Materia: Biologia II Integrantes: Juan Pablo Cedres, Matias Galeano y Melina A. Varnavoglou.

Trabajo prctico N 6: Permeabilidad de membranas celulares.

Introduccin:

Propiedades de membrana, smosis y Difusin. La membrana plasmtica es una estructura celular compuesta bsicamente por una bicapa lipdica y distintos tipos de protenas. Tiene, entre otras caractersticas, la de ser semipermeable y selectiva. Esto significa que regula el intercambio entre la clula y el medio externo, permitiendo el pasaje de ciertas sustancias e impidiendo el de otras. Esta funcin la realiza gracias a los procesos de smosis y de difusin: Difusin es el transporte de molculas de una zona de mayor concentracin a otra de concentracin menor. Como la membrana tiene permeabilidad selectiva, hay molculas que difunden libremente (sin gasto de energa) como las molculas liposolubles, no cargadas y pequeas; otras requieren de mecanismos de transporte activo (con gasto de energa) para poder difundirse dentro de la clula. smosis: Se define como el pasaje de agua a travs de una membrana semipermeable y ocurre siempre desde la solucin que presenta menor concentracin de soluto a la que presente una mayor concentracin. El solvente que se difunde tiene la capacidad de ejercer una presin sobre la membrana, se llama a esta presin osmtica. Dado esto es preciso hablar de tonicidad, que es la propiedad que se refiere al movimiento de agua a travs de las membranas plasmticas pudiendo provocar cambios conformacionales en ellas debido a la presin osmtica ejercida. Si una clula se encuentra en un medio hipotnico en relacin a su interior celular, el agua tender a fluir dentro de ella, creando presin hacia afuera y haciendo que aumente su volumen al punto de, eventualmente, lisarse. En cambio si la clula se encuentra en una solucin hipertnica, el agua solo sale a travs de la membrana, de modo que la clula se crena. El caso intermedio es una clula en solucin isotnica, donde la cantidad de agua que sale y que entra es la misma; en este caso la membrana celular no presentar ningn tipo de cambio conformacional. Para observar estas propiedades de la membrana plasmtica por lo general se utilizan glbulos rojos (llamados tambin eritrocitos) ya que estas estructuras bicncavas, al no presentar ncleo ni organelas intercelulares, la nica membrana que tienen es la membrana plasmtica y esta puede aislarse sin contaminacin de membranas internas. Colocndolos en soluciones de distintas concentraciones puede observarse la hemlisis y la crenacin de la membrana tal como se ha descripto anteriormente. Centrifugacin: Es posible separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una fuerza rotativa mayor que la de la gravedad, provocando la sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor densidad. La sedimentacin depende principalmente del tamao de las partculas y de la fuerza g aplicada; pero aquellas de tamao menor o igual a 5 micrones presentan un tipo de movimiento llamado Browniano y no sedimentan bajo la fuerza de gravedad por lo tanto se debe aumentar la fuerza mediante este mtodo denominado centrifugacin.

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Puede calcularse la velocidad con la que las partculas sedimentan segn la ley de Stockes que enuncia que: la velocidad de sedimentacin de cada partcula es proporcional a su tamao, a la densidad de la partcula y a la del medio; que es nula cuando ambas densidades se igualan por lo que se requiere un gradiente de densidad. Tambin se deduce de ella que la velocidad de sedimentacin disminuye al aumentar la viscosidad del medio y se incrementa al aumentar el campo de fuerza. El tipo de centrifugacin ms utilizado para separar subcomponentes celulares es el de centrifugacin diferencial cuyo fundamento es la diferencia de velocidad de sedimentacin entre partculas biolgicas de densidad, tamao y forma diferente. Dado que las velocidades de la sedimentacin de las partculas en la solucin a analizar o solucin problema son diferentes, se obtendrn dos fracciones tras la centrifugacin: un pellet o sedimento y un sobrenadante donde se encuentra el material no sedimentado, por ejemplo en el caso especfico de la centrifugacin de glbulos rojos, este puede contener hemoglobina si las clulas se han lisado. De esta manera es posible aislar clulas y organelas celulares para su anlisis.

Objetivos:

1. Obtencin de un pellet y un sobrenadante, mediante centrifugacin diferencial, para analizarlos por microscopia y por turbidimetra respectivamente. 2. Estudio de la permeabilidad y la resistencia de la membrana plasmtica eritroctica en soluciones de diferente concentracin.

Materiales: o o o o o Sangre de rata Wistar. Solucin de NaCl Agua destilada Micropipetas Parafilm

o o o o o
o

Gradillas con tubos de hemlisis Centrfuga Espectrofotmetro Cubetas de cuarzo Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos

Metodologa y procedimientos:

A partir de 10 ml una solucin madre, preparada con 9g de NaCl y 100 ml de agua, se diluy de la siguiente forma, de modo tal que el volumen final de todas las diluciones sea 5 ml: 1. 5 ml de solucin madre. 2. Dilucin 1:2 (2.5 ml de sol. Madre/ 2.5 ml de agua). 3. Dilucin 1:10 (0.5 ml de sol. Madre/4.5 ml de agua), por duplicado para las siguientes diluciones:

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4. 5. 6. 7.

Dilucin 1:2 de 3 (2.5 ml de 3/2.5 ml de agua). Dilucin 1:10 de 3 (0.5 ml de 3/4.5 ml de agua). Dilucin 1:100 de 3 (0.05 ml de 3/4.95 ml de agua). 5 ml de agua.

Cada una de estas diluciones se fueron preparando en tubos de ensayo rotulados y luego, se orden en una gradilla, de forma creciente con respecto a la concentracin de solucin que contenan. Posteriormente, se verti 50 l de la sangre que se extrajo de la rata, a cada uno de estos tubos. Se envolvieron con parafilm y se agit suavemente. Una vez hecho esto, se les quit el papel y se los centrifug durante 5 minutos. Al terminar este proceso, se obtuvo un sobrenadante y un pellet. Estudio del sobrenadante: Se volc el sobrenadante, cuidando de que no se desarmara el pellet, en una cubeta, para luego ser examinada con el espectrofotmetro. Luego de obtener los datos del primer tubo se vaci la cubeta y se la limpi con agua. El mismo procedimiento se aplic a los tubos restantes. Estudio del pellet: Con una pipeta se extrajo el pellet del tubo de ensayo y se lo coloc en un portaobjetos; sobre este se apoy el cubreobjetos esparciendo el pellet por toda la superficie del portaobjetos. Este mismo procedimiento se aplic a los tubos restantes. Seguidamente se observaron todas las muestras con el microscopio ptico a 400x.

Resultados: Del anlisis turbidimetrico del sobrenadante se obtuvieron los siguientes datos: Muestra 1 2 3 4 5 6 7 Absorbancia (480 nm) 0.158 0.177 0.143 0.496 0.507 0.531 0.552

y del anlisis microscpico del pellet los siguientes dibujos:

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Conclusiones

Al colocar la sangre en distintas concentraciones se pudo determinar cul es la que proporcion un medio isotnico para los glbulos rojos, cual un medio hipertnico y cual un medio hipotnico ya que por microscopia pudieron observarse clulas crenadas, lisadas y en equilibrio. Se pudo determinar que la muestra 3 es la solucin cuya concentracin proporciona un medio isotnico para las clulas. Con soluciones de menor concentracin de soluto (NaCl) los eritrocitos se lisan. Y con soluciones de mayor concentracin se crenan. A su vez, a partir del resultado de la absorbancia del sobrenadante de cada muestra, se comprob que a concentraciones menores que la de la solucin 3 la absorbancia aumenta considerablemente, eso es porque el contenido de los eritrocitos (hemoglobina) estaba diseminado por toda la solucin. Signo evidente de la ruptura de las membranas, a causa de la diferencias de concentraciones del interior con respecto al exterior de la clula. Esto arriba a la misma conclusin que obtuvimos mediante el anlisis microscpico del pellet. Observaciones

Mediante las observaciones por microcopia se pudo visualizar las reacciones de los eritrocitos a diferentes medios (isotnicos, hipertnicos e hipotnicos). Pero por falta de tiempo solamente en tres muestras distintas (solucin: 1, 3, 6).

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