UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

SUPORT PENTRU LUCRRILE PRACTICE DE IMUNOLOGIE

CAPITOLUL 1. ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUN Imunologia este tiina biomedical ce studiaz funcia de aprare a organismului i bolile produse prin dereglarea sistemului imun: Alergia = rspunsul imun fa de un alergen (ex: astmul bronic) Autoimunitatea = rspuns anti-self (ex: screloza multipl) Rejecia grefei = rspunsul imun fa de esutul transplantat Imunodeficiena = rspunsul imun deficitar (ex: SIDA) Imunologia clinic urmrete: Imunosupresia = tratamentul bolilor autoimune Imunostimularea = intervenii imunoterapeutice (ex: vaccinuri) Sistemul imun asigur aprarea organismului fa de: Agresorii externi de natur biologic: bacterii, virusuri, parazii, fungi, celule strine Propriile molecule sau celule modificate, cum sunt celulele infectate i celulele neoplazice

Celulele sistemului imun Celulele sistemului imun sunt distribuite difuz n tot organismul: La porile de intrare: tegumente i mucoase bucal, respiratorie, digestiv, genital n interstiiul organelor interne: ficat, plmni, rinichi
2013-2014 1

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

n sistemul circulator: snge i limf n cavitile seroase: pleur, peritoneu, pericard n sistemul nervos central Exist structuri specializate, aflate n organele limfoide, care au roluri eseniale pentru buna funcionare a sistemului imun. Organele limfoide sunt: organe limfoide primare (centrale) - n care se formeaz leucocitele i se matureaz limfocitele: mduva hematogen i timusul; la adult, mduva hematogen este sursa tuturor leucocitelor din organism organe limfoide secundare (periferice) - organele care capteaz agenii patogeni i unde exist un mediu favorabil interaciunii ntre acetia i limfo cite: ganglionii limfatici, splina, esutul limfoid asociat mucoaselor MALT (mucous associated lymphoid tissue), esutul limfoid de la nivel cutanat SALT (skin associated lymphoid tissue) Principalele celulele efectoare ale sistemului nnscut sunt polimorfonuclearele (n special cele neutrofile), macrofagele (MF) i celulele natural killer (NK). Macrofagele i polimorfonuclearele sunt celule fagocitare. Celulele NK au activitate mpotriva celulelor proprii infectate viral i celulelor tumorale. Limfocitele sunt celulele eseniale pentru sistemul adaptativ. Limfocitele recunosc specific antigenele pentru c au pe suprafa receptori cu structuri complexe. Un limfocit prezint pe membran un anumit tip de receptor care recunoate o singur structur antigenic. Nu exist limfocite care s recunoasc mai multe tipuri de antigene. Organismul vine n contact n timpul vieii cu un numr foarte mare de antigene diferite, de ordinul milioanelor, astfel c este necesar existena unui numr foarte mare de subpopulaii limfocitare care s aib pe suprafa o varietate la fel de mare de recep tori. Practic, n organism exist zeci de milioane de subpopulaii limfocitare, care difer prin structura receptorilor de recunoatere a antigenelor. O subpopulaie de limfocite are pe suprafa acelai tip de receptor pentru antigen i deci recunoate acelai antigen. Aceast subpopulaie sau familie rezult dintr -o singur celul mam i se numete clon de limfocite. O clon de limfocite cuprinde un numr foarte mare de limfocite identice. Diferenierea clonelor se face prin reorganizarea aleatorie a genelor care codific structura proteic a receptorilor pentru antigen. Astfel, rspunsul imun antigen specific este asigurat de: LB, LT i APC (antigen presenting cells), iar rspunsul imun antigen nespecific de: MF, neutrofile, NK.
2013-2014 2

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Celulele APC se mpart n: profesioniste a cror funcie principal este procesarea i prezentarea antigenelor ctre LT helper: MF, celule dendritice i LB ocazionale care, n anumite condiii, sub influena unor citokine exprim pe suprafa MHC II: fibroblaste, celule gliale, celule pancreatice, celule epiteliale timice i tiroidiene, celule endoteliale APC sunt celule cu rol esenial n generarea RIU i RIC fa de antigenele timodependente, care sunt cele mai frecvente n natur. APC sunt singurele celule care pot recunoate antigenele timodependente n form nativ. APC prelucreaz aceste antigene, selecteaz cele mai imunogene fragmente i le prezint limfocitelor.

Efectele sistemului imun Efectele sistemului imun sunt pozitive, prin protecie mpotriva structurilor nonself i eliminarea selfului alterat. Efectele negative sunt date de disconfortul generat de sindromul inflamator i afectarea selfului (autoimunitatea). Inflamaia este o reacie nespecific de aprare a organismului, cu caracter local sau general, n funcie de severitatea i de ntinderea leziunilor produse de factorii patogeni. Cnd factorul patogen are o intensitate mic sau moderat, reacia inflamatorie este un proces local. Dac el are intensitate mare i produce leziuni tisulare importante , se activeaz mecanismele de aprare din ntregul organism i apare reacia sistemic postagresiv (RSPA). Reacia inflamatorie se declaneaz cnd agenii patogeni au o intensitate suficient de mare pentru a produce leziuni tisulare. Din punct de vedere morfopatologic inflamaia cuprinde fenomene alterative i reacionale. Fenomenele reacionale sunt de tip vascular -exudativ i proliferativ (de reparaie). Starea de disconfort a pacientului este dat de vasodilataie i creterea permeabilitii capilare. n acest fel, histamina particip la formarea exudatului inflamator, manifestat prin semnele clinice: tumor, rubor, calor. Hiperemia explic dou din semnele clinice de baz ale inflamaiei: roeaa zonei inflamate (rubor) i creterea temperaturii locale (calor). Acidoza din focarul inflamator stimuleaz n exces terminaiile nervoase libere (TNL), declannd senzaia dureroas (dolor).

2013-2014

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar Tipuri de rspuns imun IMUNITATEA NESPECIFIC ( NNSCUT) Antigen independent Fr timp de laten Nu este antigen specific Nu apare memoria imunologic Piele Mucoasa intestinal Mucoasa respiratorie Secreii proteice i neproteice CELULE Fagocite Celule NK Eozinofile -

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

IMUNITATEA SPECIFIC (DOBNDIT) Antigen dependent Cu timp de laten Antigen specific Apare memoria imunologic

BARIERE FIZICE Nu are

FACTORI SOLUBILI Ig (Ac)

LT LB

Celulele fagocitare A. NEUTROFILELE Neutrofilele provin din mduva hematogen, din celula su comun pentru monocite i granulocite GM-CFU. Din seria granulocitar se difereniaz n eutrofilele (peste 90%), eozinofilele i bazofilele. Neutrofilele triesc n snge sub 24h, chiar dac nu extravazeaz spre un focar inflamator. Aproximativ jumtate din ele se deplaseaz lent, rostogolindu -se pe endoteliul vascular. Neutrofilele sunt celule polinucleare, cu un diametru de aproximativ 12 microni, cu o form variabil (datorit permanentei emiteri de pseudopode). Nucleul este multilobat i prezint granulaii citoplasmatice care conin lizozim, NADPH oxidaz, lactoferin. Neutrofilele se mai numesc polimorfonucleare neutrofile (PMN) datorit nucleului multilobat. Reprezint 60 - 70% din totalul leucocitelor din sngele periferic. Neutrofilele sunt primele celule care ajung intr-un focar inflamator. Sunt celule cu rol foarte important n imunitatea innscut (nespecific). Neutrofilele strbat endoteliul capilar (diapedez) i se deplaseaz n esuturi (chemotactism) pentru a ajunge la nivelul focarului imun.
2013-2014 4

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Neutrofilele au rol important mai ales mpotriva bacteriilor cu habitat extracelular, pe care le fagociteaz. Markerul membranar specific pentru neutrofile este CD67.

B. MACROFAGELE Macrofagele (MF) provin din monocite, care se gsesc n snge, n esuturi i n cavitile naturale ale organismului. Monocitele au originea n mduva hematogen, dintrun precursor comun cu PMN, sub influena M-CSF i GM-CSF. Monocitele ader de endoteliu datorit unor molecule de adeziune de pe suprafa. Aderarea se face numai pe anumite zone ale endoteliului, situate n vecintatea unui focar imun. Celulele APC din focarul imun, respectiv MF i celulele dendritice, elibereaz o serie de citokine IL-1, TNF-alfa i IFN-gama care stimuleaz celulele endoteliale din vecintate. Sub aciunea unor citokine (IFN i IL-2) cu rol inductor produse de limfocite, monocitele se difereniaz, transformndu -se morfologic i funcional n MF rezidente i apoi n MF activate. MF activate sunt capabile s ndeplineasc funcia de APC. MF tisulare au o durat de via de cteva luni, pn la civa ani. MF sunt prezente difuz n organism, la nivelul esutului conjunctiv i n apropierea membranei bazale a vaselor sangvine mici. Ele se afl n numr mare n zonele unde exist un aflux important de antigene: plmni, ficat, splin i ganglionii limfatici. Markerul membranar caracteristic pentru MF este CD14. Transformarea monocitelor n MF presupune schimbri importante: Dimensiunea celulelor crete de 5-10 ori (MF au diametre de 25-50 microni). Crete numrul i dimensiunea mitocondriilor i lizozomilor, se dezvolt aparatul Golgi. Crete cantitatea de enzime hidrolitice (fosfataz acid, beta-glucuronidaz, catepsin, aril-sulfataz, lizozim, peroxidaz, colagenaz, elastaz, proteaze, lipaze, fosfolipaze, muramidaz etc). Devin multinucleate prin fuzionare sau prin endomito z. Citoplasma emite numeroase pseudopode. Funciile principale ale macrofagelor sunt: fagocitoza mecanism important de aprare nespecific; procesarea i prezentarea antigenului rol de APC n aprarea nespecific;

secreia de citokine i de mediatori ai inflamaiei influeneaz att imunitatea

nnscut, ct i pe cea adaptativ;
2013-2014 5

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

particip la procesele de reparaie tisular prin activarea fibroblatilor; determin moarte intra i extracelular.
MF particip la rspunsul imun datorit funciei lor de APC i asigur: Captarea Ag - MF capteaz n special Ag corpusculate: bacterii, virusuri, parazii mici, fragmente de celule self devenite antigenice; captarea este un proces imunologic nespecific, adic se face la fel, indiferent de structura Ag. Fagocitoza Ag - pseudopodele emise de MF se unesc nglobnd Ag corpusculat ntr o vacuol numit fagozom. Prelucrarea Ag - fagozomul se unete cu lizozomii din citoplasma MF; Ag nativ endocitat este fragmentat de enzimele din lizozomi; din fragmentele rezultate este ales fragmentul cel mai imunogen, care se numete epitop. Conservarea epitopilor - n MF se conserv o cantitate mic din epitopi, care sunt eliberai progresiv n urmtoarele zile; conservarea are rol n ntreinerea rspunsului imun mai mult timp i n generarea unui rspuns imun mai intens printr-o stimulare mai puternic i prelungit a limfocitelor. Prezentarea epitopilor - epitopul selectat este cuplat cu moleculele MHC II i este expus pe membrana MF; prin expunerea cuplului MHC II-epitop se face prezentarea epitopului spre LTH.

Succesiunea de evenimente care determin rspunsul celulelor fagocitare n infecii: aderarea vascular diapedeza chemotaxia activarea fagocitoza i moartea celular

C. CELULELE KILLER NESPECIFICE NK (natural killer) i LAK (celule killer activate de limfokine) K MF activate Eozinofilele CELULELE NK NK fac parte din grupul mai numeros al limfocitelor mari, numite i non -B non-T. Limfocitele non-B non-T au morfologie de LGL (large granular lymphocytes). NK au mai mult citoplasm dect limfocitele mici.
2013-2014 6

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

NK au rol n imunitatea nnscut sau nespecific. Ele intervin n primele momente ale unei infecii virale i elimin o parte dintre celulele self infectate. n acest mod ele ofer organismului rgazul pentru proliferarea clonelor de LB i LT Ag -specifice, care vor eradica infecia. De asemenea, celulele NK recunosc i distrug celulele tumorale. Recunoatererea celulei int este imunologic nespecific. Markerii membranari caracteristici pentru NK sunt CD56 i CD16. Celulele NK activate de IL-2 i IFN-gama se transform n LAK (Limfokine Activated Killer). Recunoaterea celulei int de ctre NK NK recunosc celula int nespecific, prin mai multe mecanisme: recunoaterea nespecific mediat prin IgG: NK prezint pe suprafa receptori FcR, prin care recunosc i distrug celulele opsonizate cu IgG. recunoaterea prin receptori de tip lectinic: pe suprafaa celulelor infectate viral apar structuri glicoproteice cu greutate molecular mare. Aceste structuri sunt recunoscute prin receptori cu structur lectinic de pe membrana NK. recunoaterea direct prin NK-R: se presupune c pe suprafaa NK se afl receptori NK-R care recunosc o structur prezent fiziologic pe membra na tuturor celulelor somatice din organism. La celulele sntoase aceste structuri int sunt mascate de moleculele MHC I. Probabil c la celulele infectate viral sau malignizate scade expresia membranar a MHC I i se demasc ligandul membranar pentru NK, care se ataeaz de celule i le distruge. Distrugerea celulei int prin citotoxicitate extracelular LTC i NK realizeaz liza celulei int prin mecanisme asemntoare, prin eliberarea unor mediatori care produc leziuni ale membranei i apoptoz. Mediatorii sunt coninui n granulaiile vizibile n LTC activate i n NK. Cei mai importani mediatori citotoxici sunt: perforina, limfotoxina, granzimele i TNF. CELULELE KILLER Celulele K sunt celule nedefinite morfologic, care au receptor de tip Fc pentru IgG (de foarte mare afinitate) i recunosc intele mpachetate n anticorpi. Activarea celulelor NK i K nu produce memorie imun. Nu exist diferene ntre rspunsul imun primar i secundar. Celulele K interacioneaz cu celula int prin intermediul receptorilor Fc. Celula tumoral tapetat cu IgG este astfel uor recunoscut de celulele K. Ele se activeaz i lizeaz celula int.

2013-2014

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

D. CELULELE DENDRITICE Celulele dendritice sunt specializate n prezentarea antigenelor. Se caracterizeaz printr-o structur arborescent, cu un corp celular cu puin citoplasm perinuclear i numeroase prelungiri ramificate care ptrund printre celulele din jur. Aceste pseudopode au un aspect caracteristic care a fcut s fie comparate cu dendritele neuronilor . Datorit lungimii lor, pseudopodele celulelor dendritice permit supravegherea unor spaii ntinse de esut cu ajutorul unui numr relativ mic de celule. Celulele dendritice au rol de APC pentru c pot s capteze i s prezinte antigenele. Ele au pe suprafa principalii receptori implicai n funcia de APC: CR (receptori pentru fragmentul C3b al complementului), FcR i pot s sintetizeze moleculele MHC II. Celulele dendritice ndeplinesc n cadrul rspunsului imun urmtoarele funcii: capteaz antigenele de la porile de intrare transport antigenele spre organele limfoide secundare - ganglioni limfatici i splin prezint n organele limfoide secundare antigenele spre LB i LT Pe parcursul desfurrii funciei lor imunologice, clasele de celule dendritice s e transform una n alta. Se consider n prezent c o celul dendritic i schimb morfologia n funcie de teritoriul unde se gsete. Exista 4 tipuri principale de celule dendritice: celulele Langerhans celule dendritice interstiiale celulele dendritice foliculare celulele dendritice limfoide

Hematopoieza Hematopoieza este procesul prin care iau natere celulele sang vine mature, funcionale, iniiat n viaa intrauterin i cantonat n final la nivelul mduvei osoase . Necesit celule de origine i micromediul hematopoietic. Celule hematopoietice (de origine) se mpart n 3 grupe: celule stem pluripotente (CSP), celule progenitoare hematopoietice i celule hematopoietice ale seriilor sangvine. n luna a 5-a fetal, n dou sptmni, cavitile osoase sunt populate cu celule stromale. Celulele hematopoietice migrate din ficat traverseaz pereii vaselor sinusoidale i formeaz parenchimul hematopoietic. Componentele micromediului hematopoietic sunt: celulele stromale mezenchimale, reeaua matriceal extracelular i factorii de cretere produi de celulele stromale: Factori de stimulare ai coloniilor granulo-monocitare (GM-CSF) Factori de stimulare ai coloniilor de macrofage (M-CSF)
2013-2014 8

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Factori de stimulare ai coloniilor granulocitare (G-CSF) Eritropoietina, trombopoietina Citokine: interleukinele Micromediul din timus. Timusul este un organ limfoepitelial care are n cortex limfocite, celule epiteliale, macrofage. Nidarea limfocitelor T se face prin atragerea n afara vaselor de ctre 2-microglobuline i dirijarea ctre zona cu celule epiteliale. Diferenierea i maturarea se fac n zona epitelial. Migrarea celulelor mature se realizeaz ctre zona medular. Migrarea celulelor stem. n viaa intrauterin migreaz din sacul vitelin n ficat, din ficat n mduva osoas, timus splin, ganglioni limfatici. La adult CSP se gsesc n sngele circulant i mduva osoas. Migrarea este explicat de: intervenia CSP n sectoarele medulare intens solicitate cutarea de noi teritorii hematopoietice meninerea unei rezerve de CSP n snge atunci cnd mduva este lezat La natere singurul organ hematoformator devine mduva osoas. n jurul vrstei de 4 ani mduva roie din diafizele oaselor lungi dispare treptat fiind nlocuit cu celule adipoase. La 18 ani esut hematopoietic se gsete n vertebre, stern, coaste, oasele craniene, pelvine, partea proximal a epifizelor oaselor lungi. esutul limfatic. esutul limfatic este strns legat de formarea mduvei osoase. Apare n plexul limfatic n sptmna a 9-a i n glandele limfatice n sptmna a 11-a. La nivelul splinei n perioada de declin a mielopoiezei apare limfopoieza. Timusul devine organ limfopoietic n sptmna a 9-a. Aici vin celulele stem din ficat, splin i mduva osoas. Dup natere, esutul limfatic rmne prezent n mduva osoas, dar devine mult mai extins n ganglionii limfatici, plcile Peyer i timus. Teorii asupra procesului de angajare a celulelor stem : 1) Teoria stochastic angajarea celular survine la ntmplare, factorii de r eglare acioneaz doar n etapele tardive ale hematopoiezei. 2) Teoria micromediului inductor direcionarea celulei stem depinde de structura micromediului medular din acel moment. 3) Teoria umoral angajarea depinde de factori umorali care se ntrec ntre ei pentru fixarea pe receptorii celulelor stem.

2013-2014

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Modul de recoltare, prelucrare, transport i stocare a probelor de snge

(dup Synevo servicii medicale de laborator)

1.

2.

3. 4.

Pregatirea pacientului Recoltarea probelor se face cu pacientul n condiii bazale, naintea oricrei proceduri diagnostice sau terapeutice (ideal ntre orele 7 i 9 dimineaa, n condiii jeun pe nemncate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomand ca recoltarea s se efectueze dup 12 ore de la ultima mas. Cnd probele de snge nu sunt recoltate n condiii bazale, trebuie inut seama de efectele adiionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar i efortul fizic moderat poate determina o cretere a c% de glucoz, acid lactic, proteine serice, CK), precum i a strii emoionale sau ritmului circadian care poate afecta anumii parametri. Pacientul st ntr-o poziie comod (n poziie eznd sau n decubit dorsal). Datele demografice ale pacientului trebuie s fie corect scrise pe formularul de nregistrare de la punctul de recoltare a sngelui i recipientul de recoltare corect etichetat.

Recoltarea sngelui venos Sngele este recoltat prin puncie venoas, la nivelul fosei antecubitale, cu ajutorul unui sistem vacuum: tubul este vidat n momentul imediat anterior recoltrii, eliminnduse riscul pierderii de vid; propor ia de snge recoltat-aditiv rmne constant, fapt ce conduce la rezultate corecte. Probele de snge sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:

naintea recoltrii sngelui, se desface acul prin rsucirea capacului sigilat. Se nltur capacul i se expune partea filetat (1), avnd grij s nu se ndeprteze teaca steril n care se gsete acul (2). Se asambleaz acul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fi acum umplute unul dup altul, n concordan cu instruciunile de mai jos: a. Se aplic un garou pe antebraul pacientului i se neap pielea din plica cotului, cu ajutorul degetului mare i al indexului minii drepte.
2013-2014 10

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

b. Se inverseaz poziia minilor ct mai curnd posibil dup ce acul a penetrat vena; se apas vacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul i degetele mijlocii, susinndu-l. c. Sngele este atras de vacuumul din vacutainer i curge n tub cu vitez proprie; se elibereaz garoul din jurul braului pacientului imediat ce sngele a aparut n vacutainer, cu ajutorul mainii stngi, susinnd n continuare holderul. d. Se retrage vacutainerul cu mna dreapt, apsnd uor cu degetul mare pe una dintre marginile holderului. e. Pentru a asigura optima omogenizare a s ngelui cu anticoagulantul, se efectueaz 8-10 micri de inversiune a tubului. f. Daca se recolteaz mai mult de un vacutainer, se inser cel de-al doilea tub i se repet paii descrii anterior.

2013-2014

11

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Indiferent de sistemul de recoltare folosit, se respect urmtoarele manevre: - se utilizeaz mnui sterile, de unic folosin pentru fiecare pacient c ruia i se recolteaz probe; - se evit puncionarea n zonele n care exist leziuni cutanate; - se dezinfecteaz zona aleas pentru puncionare cu ajutorul unui tampon steril mbibat n soluie apoas de izopropanol 70%, prin micri circulare, din interior spre exterior, pentru a ndeprta contaminanii; - dup tamponare, se las s se usuce zona nainte de a trece la puncionare (dac zona este umed, poate fi indus hemoliza probei); - la sfritul puncionrii, se aplic imediat un tampon compresiv pentru a asigura hemostaza i a evita formarea hematomului (durata recomandat a compresiei este de 5 mininute); - la sfrit se acoper zona cu un pansament steril; - acul de puncie nu va fi reintrodus n teac (pentru a evita neparea), ndoit sau tiat, ci va fi depus ntr-un container de plastic rezistent la reziduuri neptoare sau tietoare.

Aditivi utilizai Pentru a mpiedica procesul de coagulare a sngelui integral, unele vacutainere conin substane anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA, citrat de dextroz), fie prin inhibarea trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudin). Pentru a nu exista nicio confuzie n identificarea tubului de recoltare, capacele vacutainerelor sunt colorate diferit, n funcie de aditivul folosit. Codurile de culoare pentru substanele anticoagulante sunt descrise n ISO/DIS 6710: 1. Capac mov/roz - folosete ca anticoagulant EDTA i are utilitate n hematologie, biologie molecular, unele teste imunochimice (ex. ACTH). 2. Capac bleu/verde - conine Citrat 9+1 i se folosete pentru analiza coagulrii. 3. Capac negru/mov - conine Citrat 4+1 i se folosete pentru VSH. 4. Capac verde/portocaliu - conine Heparinat i se utilizeaz plasm pentru testele de biochimie. 5. Capac rou/incolor - este un tub fr anticoagulant. Serul este folosit pentru testele de chimie, imunologie i serologie. Unele vacutainere destinate obinerii serului conin un activator de coagulare (care accelereaz formarea cheagului) i un gel separator, care permite meninerea serului dup centrifugare n tuburile primare, n cursul fazei preanalitice (transport ctre laborator), analitice i postanalitice (stocarea probelor n laborator).
2013-2014 12

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Ordinea recoltrii tuburilor n cazul n care este nevoie s se obin mai multe probe dintr-o singur flebotomie (puncie venoas), se recomand s se respecte urmtoarea ordine de recoltare a tuburilor: 1. recipientele pentru hemocultur; 2. tuburile fr aditivi; 3. tuburile ce conin citrat; 4. tuburile ce conin heparin; 5. tuburile ce conin EDTA. Volumul optim de prob Una din erorile cel mai des ntlnite este trimiterea la laborator a unei cantiti insuficiente de prob. Pentru a v asigura c exist un volum adecvat de prob, se recolteaz ntotdeauna snge ntr-o cantitate de 2 ori i jumtate mai mare dect volumul necesar efecturii unui anumit test (la fiecare test este precizat volumul minim de ser sau plasm necesar procesului analitic). n acelai timp, trebuie s se evite recoltarea excesiv de snge, n special la vrstnici, copii mici, pacieni internai n seciile de terapie intensiv. n cazurile frecvente, n care pacienilor le sunt indicate mai multe teste, se ine cont de urmtoarele volume de snge recomandate n cazul folosirii analizoarelor automate actuale: - 4-5 mL snge pentru efectuarea unui profil de investigaii biochimice uzuale; - 1 mL snge pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie. Obinerea sngelui pentru imunofenotipri Urmrete determinarea populaiilor i subpopulaiilor celulare Se recolteaz 2-3 mL snge venos ntr-o eprubet steril, pe anticoagulant (heparin) Sngele se prelucreaz n maxim 6 ore de la recoltare Metoda folosit - citometrie n flux. Valori de referin i comunicarea rezultatelor Buletinul final va conine intervalele de referin pentru subseturile limfocitare adecvate vrstei pacientului mpreun cu o interpretare a rezultatelor obinute. Trebuie cunoscut faptul c numrul absolut al populaiilor limfocitare este influenat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatur i mediul nconjurtor. Studiile legate de variaiile circadiane au demonstrat o cretere progresiv a numrului de celule CD4+ n cursul zilei, n timp ce limfocitele CD8+ i limfocitele B CD19+ cresc doar n prima parte a zilei, fr a se modifica n cursul dup-amiezei.
2013-2014 13

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Din acest motiv, atunci cnd se efectueaz o monitorizare seriat a populaiilor limfocitare se recomand ca probele de snge s se recolteze n acelai moment al zilei. Obinerea sngelui pentru determinarea activitii funcionale a Ly, Mo, Gran Se recolteaz venos snge venos pe anticoagulant (heparin) Se prelucreaz n maxim 4 ore Determinarea activitii funcionale a leucocitelor este indicat n u rmrirea infeciei HIV, cu monitorizarea serial a numrului de celule T CD4+ pentru evaluarea progresiei bolii, stabilirea indicaiei de terapie antiretroviral i de tratament profilactic al infeciilor oportuniste, precum i evaluarea rspunsului la terapie. Este foarte important determinarea ct mai precis a numrului absolut de celule CD4+, acest lucru realiz ndu-se prin utilizarea unui numr cunoscut de microsfere (TruCount beads) la care se adaug un volum cunoscut de prob.

Obinerea sngelui pentru tipizarea HLA (MHC) Complexul HLA este plasat pe braul scurt al cromozomului autozom 6. Se recolteaz 8,5mL snge venos periferic n vacutainer ce conine citrat de dextroz (ACD). Sngele se prelucreaz n maxim 4 ore de la recoltare. Kit-urile specifice permit tipizarea de rezoluie nalt a alelelor ntr-un singur test. Metoda SSP (Sequence Specific Primers) se bazeaz pe tehnologia PCR care folosete primeri specifici pentru tipizarea ADN din esuturi. Fiecare kit de primeri specifici const ntr-un panel de primeri, fiecare coninnd o pereche specific de primeri (specifici pentru o alel sau un grup de alele) ct i o pereche de primeri de control specifici pentru secvenele non-alelice prezente n toate probele. Acest control acioneaz ca un control PCR intern pentru a verifica eficiena amplificrii PCR. HLA = Human Leukocyte Antigen = antigene de histocompatibilitate = MHC = Major Histocompatibility Complex = complexul major de histocompatibilitate

2013-2014

14

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

MHC este format din molecule solubile sau aflate pe diferite suprafee celulare, cu roluri importante n funcionarea normal a sistemului imun. Complexul major de histocompatibilitate este implicat n imunitatea adaptativ (specific) avnd un rol esenial n discriminarea ntre self i nonself. De asemenea, intervine i n imunitatea nespecific. Complexul major de histocompatibilitate mai este cunoscut sub numele de sistemul HLA (human leukocyte antigen). Exist 2 clase principale: Moleculele MHC I sunt glicoproteine aflate pe suprafaa aproape tuturor celulelor nucleate i a trombocitelor. Au rolul de a prezenta antigenele peptidice interne limfocitelor T citotoxice. Neuronii i spermatozoizii nu prezint molecule MHC I pe membrane. Limfocitele au pe suprafa numeroase molecule ale complexului major de histocompatibilitate de tip I - pn la 105 receptori/celul. Moleculele MHC II se gsesc pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen (n special macrofage, monocite, celule dendritice i limfocite B). Au rolul de a prezenta antigenele procesate de ctre aceste celule limfocitelor T helper. Numrul moleculelor MHC II aflate pe suprafaa monocitelor i macrofagelor neactivate este redus. Stimularea antigenic determin creterea semnificativ a expresiei acestor receptori pe membran. Funciile MHC I i MHC II Moleculele MHC I i MHC II au un rol esenial n recunoaterea antigenului de ctre limfocitele T. Aceste limfocite sunt implicate n generarea att a raspunsului imun umoral ct i a celui celular. Spre deosebire de limfocitele B, limfocitele T nu pot recunoate dect acele antigene prezentate n combinaii cu moleculele MHC (mecanism de restricie MHC). Limfocitele T helper recunosc doar antigene exogene prezentate mpreuna cu MHC II, iar limfocitele T citotoxice recunosc antigene endogene prezentate mpreun cu MHC I. Moleculele MHC se asociaz cu fragmente peptidice care au fost procesate anterior n diferite compartimente ale celulei: MHC I se leag de peptide derivate din antig ene endogene, care au fost procesate n citoplasma celulei: proteine normale celulare, tumorale, virale, proteine care provin din bacterii cu habitat intracelular. MHC II formeaz complexe cu peptidele rezultate n urma procesrii antigenelor exogene, care au fost internalizate prin fagocitoz de ctre celule specializate (mai ales macrofage i celule dendritice).
2013-2014 15

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Toate celulele care prezint pe suprafa receptori MHC I pot prezenta antigene endogene limfocitelor T citotoxice. Aceast prezentare determin activarea limfocitelor T citotoxice, cu declanarea raspunsului imun celular, care are drept finalitate eliminarea acestor celule neoplazice sau infectate cu germeni intracelulari. Astfel, celulele care prezint antigene prin intermediul MHC I catre LT ci totoxice sunt de fapt celule int pentru acestea din urm. Antigenele exogene pot fi procesate i prezentate limfocitelor T helper doar de ctre celule specializate care au pe suprafa molecule MHC II (celule prezentatoare de antigen). Obinerea serului - Se recolteaz 8-10mL snge venos ntr-o eprubet de centrifug - Se introduce proba la 370C timp de 15 min, pn la completa coagulare - Se decanteaz serul ntr-o alt eprubet de centrifug - Serul rezultat se centrifugheaz 5 min la 3000 rpm - Serul poate fi pstrat timp de 1-2 ani la -200C Utilizarea antibioticelor (Ab) i antimicoticelor (Am) n mediul de cultur Antibiograma presupune testarea sensibilitii unei tulpini bacteriene izolate dintrun produs patologic fa de diverse antibiotice. Astfel se caracterizeaz capacitatea acestora de a opri dezvoltarea microbian i ofer informaii pentru selectarea celui sau celor mai active antibiotice fa de microorganismul testat. Antibiograma se face dup stabilirea diagnosticului etiologic, prin izolarea n cultur pur i prin identificarea agentului patogen. Tratamentul se realizeaz n funcie de rezultatele date de antibiogram, alegnd antibioticul cel mai eficace, adic fa de care bacteria izolat are cea mai mare sensibilitate. Principiul antibiogramei const n capacitatea Ab de a mpiedica multiplicarea bacterian, fenomen cunoscut ca efect bacteriostatic. Unele Ab au n anumite concentraii i proprietatea de a omor bacteriile: efect bactericid. Metode folosite pentru testarea sensibilitii in vitro la antibiotice Metoda difuzimetric Kirby Bauer (clasic): aceasta se efectueaz pe medii solide, n plci Petri, pe care s-a nsmnat n pnz cultura bacterian; apoi pe suprafaa mediului se dispun discuri cu antibiotice astfel c n jurul acestora se va realiza un gradient de concentraie prin difuziunea local a antibioticului (n imediata vecintate a discului obinndu-se o c% mai mare de antibiotic care descrete pe msura ndeprtrii de acesta).

2013-2014

16

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Se utilizeaz penicilina G (bacterii G+), streptomicina sulfat (bacterii G+/-), gentamicina (mycoplasme, bacterii G+/-), amphotericina B (fungi). Metoda cu antibiotic ncorporat n mediu semisolid (modern): permite determinarea sensibilitii microbiene la un set de ageni antibacterieni/ antifungici, ncorporate ntr-un mediu semisolid. Este alctuit din 16 perechi de godeuri, din care 2/4 nu conin antibiotice/antifungice i sunt martori de cretere. Celelalte perechi de godeuri conin diferite antibiotice n cte dou concentraii (c = concentraie mai mica i C = concentraie mai mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpin testat ca fiind sensibil, intermediar sau rezistent. Din tulpina de testat este preparat o suspensie care este transferat n mediul de cultur cu care este inoculat galeria. Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa 24-48 ore de incubare la 37C. Interpretarea rezultatelor: Rezistena la un anumit antibiotic este evideniat prin virajul culorii spre rou n godeurile unde microbii au crescut fr a fi deloc inhibai. Rezistena intermediar la antibiotic este evideniat prin culoarea portocalie din godeurile respective, unde microorganismele au fost inhibate doar la concentraia crescut a antibioticului. n godeurile n care microorganismele nu au crescut deloc, nici la concentraia sczut, nici la cea crescut a antibioticelor, culoarea vireaz spre glaben i arat sensibilitatea microbului fa de Ab respectiv. Tehnici de biologie molecular Reacia de amplificare enzimatic PCR Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologie PCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinele mediului, criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentar, epidemiologie etc. Tehnica PCR imit replicarea ADN in vivo. Variante tehnice i aplicaii ale tehnologiei PCR diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii n gene importante n anumite boli diagnosticul unor boli infecioase: permite detectarea particulelor infecioase bacteriene i virale aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultiv dificil in vitro, pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare i pentru
2013-2014 17

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umani pozitivi nainte de seroconversie studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne (detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n diverse procese maligne) studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a necesita n prealabil clonarea acestora studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recupe -rarea i analiza unor secvene ADN din fosile medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel molecular o serie ntreag de probe biologice

Materiale necesare Tuburi PCR de 0,2/0,5 mL Vrfuri pentru pipete automate Materialele trebuie s fie noi i sterile Tehnica de lucru Se realizeaz prin combinarea unei probe de ADN cu primeri oligonucleotidici, deoxiribonucleotidtrifosfai (dNTP) i o ADN-polimeraz termosensibil (Taq-polimeraza), ntr-un tampon corespunztor. Prin nclzirea i rcirea repetat a amestecului (30-40 cicluri), se obine nivelul de amplificare dorit. Treptele de temperatur ale unei racii PCR standard Denaturarea iniial Pentru ca o reacie PCR s se desfoare eficient, este foarte important ca moleculele ADN matri s fie denaturate iniial complet. Acest lucru poate fi realizat prin nclzirea iniial a amestecului de reacie 2 min la 94-95oC. Treapta de denaturare din cadrul fiecrui ciclu De obicei, este suficient o denaturare de 20-30 sec la 94-95oC, dar aceasta trebuie adaptat funcie de termocycler i de tuburile folosite (de ex., dac se lucreaz n tuburi de 500 L sunt necesari timpi mai lungi dect dac se lucreaz n tuburi de 200 L). Ataarea primerilor n marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataare a primerilor trebuie determinat i optimizat empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezint unul din factorii critici pentru asigurarea unei nalte specificiti a reaciei PCR. Dac
2013-2014 18

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

temperatura de ataare este mult prea nalt, nu are loc ataarea primerilor, iar dac temperatura este prea sczut, atunci crete probabilitatea atarilor nespecifice. Polimerizarea propriu-zis Taq-ADN polimerizeaz aproximativ 60 baze per secund la 72 oC. n fiecare ciclu, o perioad de polimerizare de 45 sec este suficient pentru amplificarea unor fragmente de pn la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul se calculeaz n multiplii de 45 sec, urmat de ajustri pentru diverse matrie. Pentru a obine o cantitate ct mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare, astfel: pentru primele 10 cicluri se folosete un timp constant de polimerizare (de ex. 45 sec pentru 1 kbp) pentru urmtoarele 20 de cicluri se crete timpul de polimerizare cu 2 -5 sec per ciclu (de ex. 50 sec pentru ciclul 11, 55 sec pentru ciclul 12 etc.). O asemenea mrire progresiv a timpului de polimerizare ofer enzimei mai mult timp pentru polimerizare, pentru c pe msur ce reacia PCR avanseaz, n amestecul de reacie se gsete din ce n ce mai mult matri i din ce n ce mai puin enzim activ (randamentul enzimei scade datorit expunerii prelungite la temperaturi nalte). Numrul de cicluri ntr-o reacie PCR obinuit, mai puin de 10 molecule de matri pot fi amplificate n mai puin de 40 cicluri, obinndu-se un produs (amplicon) detectabil n electroforez n gel de agaroz. La o cretere mult prea mare a numrului de cicluri, se pot acumula produi de reacie nespecifici. Polimerizarea (extensia) final n multe reacii, dup ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacie se in 5-15 min la 72oC pentru a realiza polimerizarea complet a produilor pariali, precum i renaturarea moleculelor monocatenare. PCR n mutageneza situs-specific Pornind de la faptul ca primerii folosii ntr-o reacie PCR sunt inclui n produsele PCR (ampliconi), au fost dezvoltate o serie ntreag de variante tehnice ale acestei reacii. Astfel, n experimentele de mutagenez situs-specific, modificrile dorite pot fi introduse n ampliconi pe calea primerilor, fie c este vorba de inserii sau de deleii. n toate aceste cazuri se utilizeaz o tehnologie PCR n care reacia de amplificare este mprit n 2 reacii PCR separate n care sunt amplificate cele 2 secvene ADN aflate de o parte i de alta a situsului de modificat. n aceste 2 etape se folosesc perechi de primeri constituite dintrun primer extern (pentru captul moleculei ADN iniiale) i un primer intern (primerii interni sunt complementari situsului de modificat i conin n secven modificarea dorit). Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultai conin deja modificarea dorit, precum i o zon de complementaritate inter-ampliconi.
2013-2014 19

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Dup aceast etap se realizeaz ndepartarea primerilor interni, amestecarea celor 2 produse PCR, denaturarea termic a moleculelor urmat de renaturarea acestora n condiii de stringen. Se adaug primeri exteriori i se realizeaz o noua reacie PCR, al crei rezultat va fi reprezentat de molecule ADN identice cu matria iniial, coninnd ns i modificarea dorit. Spre deosebire de tehnicile clasice de mutagenez, i chiar de experimentele de mutagenez cu ajutorul transposonilor, asemenea variante tehnice de PCR permit o rezoluie i o acuratee mult mai mare n obinerea de molecule ADN modificate. n marea majoritate a cazurilor, aplicaiile practice vizeaz analiza corelaiilor dintre secvena de nucleotide a unor molecule ADN i realizarea anumitor funcii. Prelucrarea rezultatelor Probele obinute se analizeaz prin electroforez n gel de agaroz 1% Dup migrare, gelul se examineaz la UV ARN-ul, n mod normal, migreaz n faa ADN-ului

SUBIECTE COLOCVIU CAPITOLUL 1: 1. Celulele sistemului imun 2. Efectele sistemului imun 3. Imunitatea specific 4. Imunitatea nespecific 5. Neutrofilele 6. Celulele NK 7. Celulele dendritice 8. Complexul HLA 9. PCR principii generale 10. Rolul celulelor sistemului imun 11. Rolul MF n cadrul rspunsului imun 12. Recoltarea sngelui venos pentru diverse evaluri imunologice

2013-2014

20

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

CAPITOLUL 2. RELAIA AG-AC I MECANISME DE RSPUNS IMUN Imunoglobulinele sunt glicoproteine specializate n recunoaterea moleculelor non self. Se gsesc sub dou forme, circulant i de membran: Forma circulant este reprezentat de moleculele de anticorpi, care se gsesc n plasm, lichidul interstiial i secreii. Anticorpii sunt sintetizai de plasmocite, celule care provin din LB activate n urma contactului cu antigenul. Forma membranar este reprezentat de monomeri de imunoglobuline, fixai pe suprafaa LB. Aceste molecule intr n alctuirea receptorilor pentru antigen ai limfocitelor B (B-cell receptors - BCR). Au rol de de activare a LB. Imunoglobulinele solubile sunt proteine care migreaz pe electroforez n principal n fraciunea gamaglobulinelor. Imunoglobulinele nu migreaz exclusiv n fraciunea . Exist clase importante de imunoglobuline care se regsesc n fraciunile i ale electroforezei. Cele mai multe antigene cu care organismul vine n contact au o structur complex. n general, pentru un anumit antigen, sistem ul imun va genera mai multe tipuri de anticorpi, care vor recunoate diferii epitopi. Fiecare anticorp recunoate specific un anumit epitop, de care se leag cu o poriune care are structur complementar cu a epitopului. Aceast poriune se numete paratop, situs de legare sau situs combinativ.

Funciile anticorpilor Anticorpii au un rol esenial n ndeprtarea antigenelor solubile i n distrugerea antigenelor corpusculate. Nu toate clasele de anticorpi prezint aceleai proprieti funcionale. n cele mai multe cazuri, simpla legare a anticorpilor de antigene nu determin distrugerea bacteriilor sau ndeprtarea antigenelor moleculare. Legarea anticorpului de antigen se realizeaz prin intermediul fragmentului Fab, n timp ce fragmentul Fc este responsabil de funciile biologice. Acest fragment are capacitatea de a activa molecule efectoare ale sistemului imun i de a fi recunoscut de ctre celule imunocompetente.

2013-2014

21

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Funciile principale ale anticorpilor sunt: opsonizarea favorizeaz fagocitoza Ag de ctre MF i PMN. Aceste celule prezint pe suprafaa receptori pentru fragmentul Fc, numii FcR. Aceti receptori permit legarea complexelor antigen/anticorp pe suprafaa MF i neutrofilelor. Legarea mai multor complexe imune pe suprafaa fagocitelor determin iniierea unui semnal de transducie intracelular care are drept rezultat fagocitoza acestora. Fagocitoza este un proces complex, prin care agentul patogen este internalizat i devine inta unor mecanisme de distrugere care determin liza patogenului. activarea complementului pe calea clasic este o proprietate pe care o posed moleculele de IgM i cele mai multe subclase de IgG. citotoxicitatea mediat celular dependent de anticorpi (ADCC) permite distrugerea celulelor proprii ale organismului care au fost infectate viral sau cu bacterii intracelulare. Celulele infectate viral produc proteine virale care servesc replicrii virusului. Unele dintre aceste molecule sunt expuse pe suprafaa celulei respective. Moleculele virale sunt recunoscute ca non-self, ceea ce declaneaz un rspuns imun umoral, cu producerea de anticorpi care se fixeaz pe aceste molecule de suprafa. Celulele natural killer (NK), care au un rol important n rspunsul imun celular, prezint receptori pentru fragmentul Fc. Astfel, anticorpii direcioneaz celulele NK spre celulele infectate viral, cu liza acestora din urm.

Structura anticorpilor Similar altor molecule proteice, imunoglobulinele au o organizare spaial complex, caracterizat prin structur primar, secundar, teriar i cuaternar. Toate imunoglobulinele au o structur asemntoare, reprezentat de o unitate tetracatenar. Planul de organizare al domeniilor imunoglobulinelor se regsete n multe alte proteine, de exemplu la unii receptori de suprafa. Proteinele care conin cel puin un domeniu imunoglobulinic constituie superfamilia imunoglobulinelor. Toate tipurile de anticorpi au structur comun, fiind alctuii din 4 lanuri peptidice: dou lanuri identice uoare (L) i dou lanuri identice grele ( H). Fiecare lan uor este legat de un lan greu printr -o punte disulfidic i prin diferite alte legturi noncovalente. Astfel se formeaz un heterodimer H - L. Heterodimerii sunt legai ntre ei de asemenea prin puni disulfidice i legturi noncovalente . Numrul de legturi disulfidice i aezarea acestora difer n funcie de familia de imunoglobuline.
2013-2014 22

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Structura imunoglobulinelor este strns legat de funciile pe care acestea trebuie s le ndeplineasc. Pe de o parte, anticorpii se leag n mod spec ific de antigene, iar pe de alt parte pot forma legturi cu o varietate de molecule efectoare i celule. Papaina este o enzim care scindeaz molecula de imunoglobulin n trei fragmente: dou fragmente identice care au capacitatea de a lega antigene. Ac estea au fost denumite Fab - antigen binding. Aceste fragmente sunt alctuite dintr-un lan uor L i captul N-terminal al unui lan greu H, legate prin puni disulfurice. Fragmentele Fab conin regiunea variabil V. Existena a dou situsuri de legare permite anticorpului s lege dou molecule de antigen. un fragment Fc - fragment cristalizabil, care nu prezint capacitatea de legare a antigenelor. Acest fragment este alctuit din resturile lanurilor H. Fragmentul Fc este diferit n funcie de familia de imunoglobuline. Exist dou tipuri de lanuri uoare L: i . Nu exist diferene funcionale ntre anticorpii care au lanuri fa de cei cu lanuri , iar motivul pentru care exist aceast variaie nu este cunoscut. Aceste dou tipuri de lanuri intr n alctuirea tuturor claselor majore de imunoglobuline. n schimb, diferenele structurale existente ntre lanurile grele H sunt definitorii pentru ncadrarea imunoglobulinelor n anumite clase i influeneaz semnificativ funcia acestora. Exist 5 izotipuri majore de lanuri grele H: , , , , . Pe baza deosebirilor existente n structura lanurilor H au fost descrise 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Situsul combinativ Primii 100 de aminoacizi ai capetelor N-terminale ale lanurilor H i L prezint o variabilitate marcat ntre anticorpi cu specificitate diferit. Aceste segmente sunt denumite regiunile V: VL pentru lanurile uoare i VH pentru lanurile grele. Specificitatea diferit a anticorpilor este datorat acestei regi uni variabile. Asocierea dintre VH i VL creaz o zon hipervariabil, care este locul de legare a antigenelor. Aceasta a fost denumit situs combinativ sau situs de legare a antigenului. n interiorul regiunii variabile, exist anumite poziii care sunt r elativ constante de la molecul la molecul i zone care foarte rar sunt ocupate de acelai aminoacid. Aceste poziii numite hipervariabile constituie locul de legare cu antigenul i au fost denumite regiuni determinante ale complementaritii (CDR - Complementary Determining Regions). Sistemul imun este capabil s produc anticorpi mpotriva unei repertoriu vast de antigene prin generarea de imunoglobuline care prezint CDR specifice pentru fiecare antigen.
2013-2014 23

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Situsul combinativ pentru antigen este o cavit ate mic format prin plicaturarea domeniilor VH i VL. Antigenul intr n aceast cavitate i angajeaz legturi cu domeniile V prin complementaritate, pe principiul cheie-broasc. Secvenele de aminoacizi care nu stabilesc legturi cu antigenul formeaz regiunea suport FR (framework region). Cu excepia regiunilor variabile, structura imunoglobulinelor este relativ constant pentru moleculele din aceast clas.

Clasele de imunoglobuline Imunoglobulinele G Imunoglobulinele G (IgG) sunt distribuite egal n sectorul intravascular i interstiial. Moleculele de IgG sunt formate din dou lanuri grele i dou lanuri uoare sau . Exist 4 subclase de IgG, pe baza diferenelor existente la nivelul lanurilor : IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Au concentraia plasmatic cea mai mare Realizeaz imunizarea pasiv umoral a nou-nscuilor n primele luni de via Fixeaz complementul (IgG4) Reprezint peste 75% din totalul Ig circulante Apar n RIU secundar Sinteza lor este indus de IL-4

Imunoglobulinele M Imunoglobulinele M (IgM) reprezint ntre 5 i 10% din totalul imunoglobulinelor serice. Forma monomeric de IgM se afl pe suprafaa limfocitelor B i intr n structura BCR. Plasmocitele secret IgM circulant ca pentameri. Monomerii sunt aranjai astfel nct fragmentele Fc se afl n centru iar cele 10 situsuri de legare al antigenului se afl la periferia moleculei. Fiecare pentamer este format prin legarea monomerilor prin legturi disulfurice, legturi care se constituie ntre anumite zone ale lanurilor grele, situate nspre captul C-terminal. n plus, molecula de IgM conine un lan suplimentar polipeptidic numit lanul J (joining), care este necesar pentru polimerizarea monomerilor.

2013-2014

24

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Prima Ig produs de fetus i de ctre LB IgM sunt mai eficiente dect IgG n activarea complementului Particip la aprarea contra bacteriilor i virusurilor Apare n RIU primar Sinteza este stimulat de IL-2

Imunoglobulinele A (IgA) IgA este clasa de imunoglobuline predominant n secreii: lapte matern, saliv , lacrimi, mucusul tracturilor digestiv, bronic i genitourinar. n ser, IgA reprezint 10 -15% din totalul Ig. n snge, IgA circul n principal sub forma de monomeri. n secreiile mucoase, IgA exista aproape exclusiv sub form de dimeri (IgAs). Moleculele de IgAs conin un lan polipeptidic J i o component secretorie, de asemenea de natur peptidic. Lanul polipeptidic J este identic cu cel care se gsete n pentamerii de imunoglobulin M. Componenta secretorie este sintetizat de celulele epiteliale. Mecanismele de protecie ale IgAs la nivelul mucoasei: mpiedicarea colonizrii bacterene neutralizarea particulelor virale neutralizarea enzimelor i toxinelor aciune sinergic cu factori ai sistemului de aprare nnscut: lactoferina, peroxidaz, lizozim IgAs au un rol important n meninerea relaiei simbiotice cu bacteriile comensale din cavitatea oral. Exist un repertoriu larg de IgAs care conine anticorpi pentru antigenele exprimate de bacteriile comensale i care mpiedic trecerea acestora prin mucoas.

Imunoglobulinele E (IgE) IgE este o clas de imunoglobuline cu efecte biologice importante, cu toate c se gsete n cantiti reduse n plasm 0,3 micrograme/mL. Lanul greu epsilon este format din cinci domenii, unul variabil i patru constante. Molecula de IgE nu are o zon balama i din aceast cauz este foarte rigid. Au rol n aprarea antiparazitar i intervin n reacia de hipersensibilitate de tip 1, care este responsabil pentru o varietate de afeciuni alergice, de la rinit alergic, urticarie, astm bronic, pn la oc anafilactic.
2013-2014 25

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

IgE sunt anticorpi citofili, adic dup ce sunt sintetizai nu rmn n lichidul extracelular, ci se ataeaz prin receptori specifici pe suprafaa mastocitelor i bazofilelor. Mastocitele i bazofilele posed un bogat echipament enzimatic i de mediatori ai inflamaiei, care se afl n granulaiile citoplasmatice. Legarea antigenului de imunoglobulinele E care se afl pe suprafaa acestor celule declaneaz degranularea i eliberarea mediatorilor inflamaiei n esuturi, cu apariia manifestrilor alergice.

Genele imunoglobulinelor Localizarea cromozomial a genelor pentru Ig : Sinteza lanurilor grele este codificat de gene plasate pe cromozomul autozom 14, braul lung q, regiunea 32 Sinteza lanurilor uoare este codificat de gene plasate pe cromozomul autozom 2, braul scurt p, regiunile 11-12

Antigenele Sistemul imun are capacitatea fundamental de a deosebi structurile proprii ale organismului (self) de cele strine (non-self). Structurile non-self sunt eliminate prin mecanismele aprrii imune. Termenul de non-self nu implic obligatoriu originea exogen a substanei respective. Exist molecule sau celule proprii ale organismului, care au fcut parte din self, dar au suferit modificri i au devenit non-self. Antigenul este o substan recunoscut ca non-self de ctre sistemul imun al organismului. In definiia clasic, termenul de antigen desemna orice substan de origine exogen capabil s induc formarea de anticorpi i s reacioneze n mod specific cu acetia. Aceast definiie a fost considerat prea restrictiv, pe msur ce s-a observat c exist antigene de origine endogen sau antigene care nu induc sinteza de anticorpi, dei sunt recunoscute de sistemul imun. ntr-o definiie folosit n prezent, termenul de antigen denumete o substan de origine endogen sau exogen capabil s determine un rspuns imun i s reacioneze specific cu moleculele rezultate n urma declanrii acestuia (anticorpi sau receptori celulari). Aceast definiie subliniaz cele dou proprieti fundamentale ale antigenului: imunogenitatea (capacitatea de a induce un rspuns imun) i specificitatea (capacitatea de a reaciona specific cu produsele sistemului imun activat).
2013-2014 26

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Imunogenele sunt antigene complete, avnd att capacitatea de a declana rspuns imun umoral sau celular, ct i de a se lega de produsele rezultate. Antigenele incomplete (numite i haptene) sunt capabile s reacioneze cu anticorpii sau receptorii de membran, dar nu pot declana un rspuns imun, dect dac sunt cuplate cu o alt molecul (numit carrier). Au fost descoperite antigene care, dei ndeplinesc caracteristicile fundamentale de imunogenitate, nu produc rspuns imun umoral sau celular. Acestea au fost denumite tolerogene, iar semnificaia lor imunologic este diferit. Spre desebire de haptene, pe care le putem aprecia ca fiind indiferente sistemului imun, tolerogenele activeaz anumite mecanisme de inhibiie activ a sistemului imun. Clasificarea antigenelor n funcie de origine Majoritatea antigenelor sunt exogene: bacteriile, paraziii, unele substane chimice industriale, alergenele ca polenul, praful de cas, alergenele alimentare. O alt categorie important este reprezentat de antigenele endogene: autoantigenele, antigenele virale i antigenele tumorale. Autoantigenele sunt antigene proprii care n mod normal sunt sechestrate prin bariere anatomice. Aceste antigene sunt situate n aa-numitele situsuri imunologice privilegiate, protejate prin bariere hem ato-tisulare cu permeabilitate sczut pentru substanele hidrosolubile. n mod normal autoantigenele nu vin niciodat n contact cu celulele sistemului imun i nu induc un rspuns imun. Exemple de astfel de autoantigene sunt: sperma, cristalinul, esutul cerebral i unele structuri din celulele miocardice. Pentru c autoantigenele nu sunt cunoscute de ctre sistemul limforeticular, pentru ele nu exist toleran imun nnscut, ca pentru celelalte structuri self cu care limfocitele vin n contact n cursul traficului lor prin organism. n condiii patologice se produce desechestrarea acestor autoantigene. Autoantigenele vin n contact cu sistemul imun i se produce un rspuns imun fa de ele, deci fa de nite structuri self. Aceste rspunsuri imune autoreactive dau o patologie autoimun. Antigenele virale fac parte din categoria antigenelor endogene pentru c virusurile i includ genomul n genomul gazdei. Celula gazd sintetizeaz proteinele virale antigenice pe aceleai ci metabolice ca proteinele proprii. Antigenele tumorale se gsesc pe membranele i n citoplasma celulelor canceroase. Ele nu se gsesc pe membranele sau n citoplasma celulelor normale din care a derivat tumora. Orice organism normal produce un numr mic de celule canceroase, care su nt distruse rapid de sistemul imun. Prevenirea apariiei tumorilor se face prin distrugerea celulelor tumorale izolate, n cadrul unui proces de imunosupraveghere. Dac o celul neoplazic izolat reuete s se divid i apare o tumor constituit, rspun sul imun
2013-2014 27

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

mpotriva tumorii seamn cu cel din respingere a grefelor. n ambele situaii acioneaz n special mecanismele rspunsului imun celular. Superantigenele sunt o categorie special de antigene, care prezint particularitatea c nu sunt fagocitate de macrofage. Au rol n activarea mai multor limfocite prin capacitatea lor de a se fixa pe exteriorul celulei, de MHC II de pe macrofag i de lanul al receptorului pentru antigen de pe limfocitul T (TCR T cell receptor). Din punct de vedere al necesitii participrii limfocitelor T helper n cadrul RIU, antigenele se mpart n: timoindependente - antigene care pot declana RIU n absena LT helper (mai ales antigenele polizaharidice bacteriene). Rspunsul este rapid, fapt important n infeciile cu microorganisme agresive (ex: pneumococul). Dezavantajul este c aceti anticorpi nu sunt la fel de funcionali ca cei rezultai prin participarea LT helper i nu exist mecanismul de comutare izotipic, care permite sinteza a diferite clase de imunoglobuline. n plus, nu se formeaz limfocite B cu memorie. timodependente - reprezint majoritatea antigenelor. Rspunsul imun declanat de aceste antigene este mai puin rapid, dar mai versatil i mai eficient. n plus, apar limfocite B cu memorie, care permit un rspuns mult mai rapid i intens la un nou contact cu antigenul (rspunsul imun umoral secundar). Antigenele cu care organismul vine n contact pot fi solubile sau corpusculate: Antigenele solubile sunt molecule recunoscute ca non-self. De obicei antigenele solubile sunt proteine cu greutate molecular mare. Uneori antigenele solubile sunt polizaharide, acizi nucleici sau glicolipide. Antigenele corpusculate sunt structuri non-self mai complexe: virusuri, bacterii, protozoare, celule strine, celule infectate, celule neoplazice. De fapt, antigenele corpusculate sunt formate dintr-un numr foarte mare de molecule antigenice. Dintre ele, cele mai importante pentru recunoaterea i distrugerea antigenului corpusculat sunt antigenele de suprafa.

Sistemul complement Sistemul complement este un sistem multienzimatic care particip la rspunsul imun i la reacia inflamatorie. n acest fel el face legtura ntre aprarea specific i nespecific. Factorii sistemului sunt sintetizai n principal n ficat. Ca i sistemul coagulrii, complementul funcioneaz pe principiul cascadei. Factorii complementului se gsesc permanent n plasm. Ei extravazeaz n focarul inflamator datorit permeabilitii capilare crescute. n circulaie factorii sistemului
2013-2014 28

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

complement se gsesc sub form de profactor (enzim inactiv sau zimogen). Profactorii se activeaz succesiv prin procese de proteoliz limitat. Factorii C 2, C3, C4 i C5 sunt clivai n cte dou fragmente notate cu a i b. Fragmentele a sunt mai mici. Ele rmn solubile n lichidul interstiial i au efecte de tip proinflamator. Fragmentele b sunt mai mari. Ele intervin n distrugerea antigenelor corpusculate i n epurarea antigenelor solubile. Componentele sistemului complement: C3a, C5a = anafilatoxinele C5b = factorul chemotatic C3b = factorul opsonizant MAC = complexul litic terminal

Anafilatoxinele sau factorii anafilactici acioneaz asupra mastocitelor tisulare i bazofilelor atrase n focarul inflamator prin chemotactism. Din aceste celule se elibereaz mediatorii preformai, dintre care cel mai important este histamina i mediatorii neoformai: factorul de activare plachetar (PAF), prostaglandine, leucotriene, tromboxan. Factorii chemotactici au o aciune puternic asupra leucocitelor i macrofagelor. Factorii opsonizani se ataeaz imunologic nespecific de membranele non-self i de complexele imune. Acest proces stimuleaz fagocitoza bacteriilor i a complexelor imune. Complexul litic terminal sau Membranary Attack Complex (MAC) se ataeaz pe membrana celulei int, o perforeaz i produce liza osmotic a celulei int sau a bacteriei acoperite de Ac.

2013-2014

29

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Colaborarea ntre anticorpi i complement duce la ndeprtarea sau distrugerea antigenelor prin intermediul a trei mecanisme principale: anticorpii se fixeaz pe membrana bacteriilor i determin activarea complementului. Sistemul complement este un sistem enzimatic care se activeaz n cascad i care determin liza osmotic a antigenelor corpusculate prin perforarea membranei. activarea local a sistemului complement de ctre anticorpi determin apariia unor cantiti crescute de molecule de C3b. Acestea au la rndul lor capacitatea de opsoniza antigene i promoveaz fagocitoza. eritrocitele prezint receptori pentru C3b. Molecule de C 3b au capacitatea de a se ataa de complexele imune. Complexele imune care nu pot fi fagocitate local sunt transportate de ctre eritrocite la ficat sau splin, unde macrofagele locale fagociteaz complexele imune fr a distruge eritrocitele care au avut rol de transport. Desfurarea rspunsului imun umoral Rspunsul imun umoral (RIU) pentru antigenele timodependente se produce printr o cooperare celular la care particip patru tipuri de celule: APC, LTH (helper), LTS (supresoare), LB. Cooperarea celular este bidirecional. Cooperarea dinspre APC spre LB are ca efecte: Selecia i activarea clonelor de LB i LT antigen-specifice Expansiunea clonal a limfocitelor antigen-specifice Producia unei cantiti adecvate de imunoglobuline pentru neutralizarea i distrugerea antigenelor Secvena de retrocontrol, de la LB spre APC, limiteaz intensitatea RIU la un minim necesar pentru o aprare eficient. Caracteristicile RIU primar si secundar RIU primar este declanat de primul contact cu un anumit antigen. LB virgine sunt recrutate n organele limfoide periferice i se nmulesc n foliculii limfatici, n aa -numiii centri germinativi primari, care sunt activi cam trei sptmni. RIU primar are o serie de caracteristici: Producie de IgM, stimulat de IL-2, n titruri mici sau moderate Laten de 4-5 zile de la contactul antigenic pn la decelarea Ac specifici IgM au o afinitate sczut de legare a antigenului
2013-2014 30

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

RIU secundar apare la al doilea contact cu un anumit antigen i continu la urmtoarele contacte. Dup contactul cu antigenul, RIU secundar ncepe mult mai rapid dect RIU primar (n 2-3 zile), iar panta de cretere a titrului de anticorpi este foarte abrupt. Se formeaz LB de memorie. Cooperarea celular i proliferarea clonal se produc n centrii germinativi din foliculii limfatici secundari. Dup ndeprtarea din organism a antigenului, n circulaie rmn doar anticorpii, cu titrul mult mai mare dect al anticorpilor din RIU primar. Anticorpii sunt IgG cu titru mare care persist mult, timp de mai muli ani. Frecvent acetia confer protecie pentru toat viaa fa de antigenul corespunztor, ca n cazul anticorpilor antirujeolici, antirubeolici i cei contra toxinei eritrogene a streptococului. Majoritatea Ag care declaneaz RIU sunt Ag T-dependente, care induc activarea, proliferarea i diferenierea LB antigen specifice, prin cooperarea cu LTh i secreia de citokine. Factorii de transcriere induc expresia anumitor gene, ducnd la proliferare i difereniere celular.

Desfurarea rspunsului imun celular RIC are rol de aprare n trei condiii patologice: eliminarea celulelor infectate cu microorganisme cu dezvoltare intracelular: virusuri, bacterii (mycobacterii, Listeria, Brucella, Legionella) supravegherea i distrugerea celulelor canceroase rejecia grefelor RIC este implicat n recunoaterea i distrugerea: celulelor singenice devenite Ag: celulele infectate sau neoplazice celulelor alogenice aprute prin gref sau transplant Recunoaterea i distrugerea celulelor antigenice se face prin dou tipuri de celule: LTC (LT citotoxice) i celulele NK (natural killer). Acestea recunosc celulele non -self prin mecanisme diferite, dar le distrug printr-un mecanism comun, numit citotoxicitate extracelular sau citotoxicitate mediat celular. La contactul cu celula int, LTC i NK elibereaz nite mediatori care: lezeaz membranele celulelor non-self, ducnd la liza osmotic a celulelor altereaz nucleul celulelor int, producnd apoptoza lor
2013-2014 31

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Recunoaterea celulei int de ctre LTC LTC recunosc specific celulele int, pentru c acestea prezint pe suprafa Ag cuplate cu moleculele MHC I. Normal celulele organismului prezint diverse fragmente polipeptidice rezultate din proteinele celulare degradate n cursul procesului de regenera re fiziologic sau din proteinele cu structur defectuoas, pe care celula le distruge. Asamblarea MHC I cu aceste fragmente se face n RER, iar dup aceea complexul rezultat este expus pe membran. Celulele sistemului imun, n special LT, nu reacioneaz fa de fragmentele peptidice self, deoarece nc din timpul maturaiei intratimice au fost distruse clonele de LT care recunosc autoAg. Celula infectat viral sau care a devenit neoplazic prezint pe suprafa n complex cu moleculele MHC I diverse Ag virale sau neoplazice, fa de care LTC reacioneaz. Fragmentele din primele celule int distruse de LTC sunt fagocitate de MF, care devin APC i prezint polipeptidele non-self pe suprafa n complex cu moleculele MHC II. Sunt stimulate LTH. Secret IL2 i stimuleaz astfel chemotactismul, proliferarea i activarea de noi LTC. LTC au pe suprafa CD25, receptorul pentru IL2. Din punct de vedere funcional, limfocitele T se mpart n: Limfocite T citotoxice (LTC) au pe suprafa receptorul specific CD8. Recunosc peptidele antigenice rezultate din degradarea agenilor patogeni intracelulari, peptide care sunt prezentate ctre LT citotoxice mpreun cu moleculele complexului major de histocompatibilitate de tip I (MHC I). Rolul acestor limfocite este de a distruge celulele int infectate. Limfocitele T helper (LTH) prezint pe suprafa receptori CD4. Pot s recunoasc peptide antigenice care rezult n urma prelucrrii agenilor patogeni extracelulari, peptide prezentate mpreun cu molecule MHC II. Limfocitele T supresoare reprezint o subpopulaie de limfocite T a crei existen este controversat. Aceste limfocite au efecte inhibitorii n cadrul rspunsului imun.

Concluziile mecanismelor de reacie imun Celulele T i B recunosc diferit Ag Ag trebuie prelucrat nainte de a fi prezentat celulelor T Procesarea Ag genereaz peptide antigenice Mecanismul de procesare a Ag depinde de compartimentul n care se replic agentul patogen

2013-2014

32

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Principalele reacii Ag-Ac i aplicaiile acestora 1. Testul pentru determinarea Ac antistreptolizina O reacia ASLO Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecie streptococic, ca i a celui de reumatism articular acut (RAA) Meninerea titrului ASLO ridicat chiar i la cteva luni dup puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii. Principiul metodei: Reactivul folosit: suspensie de particule latex de po listiren ncrcate cu streptolizina O stabilizat. Reactivul a fost astfel preparat nct, n prezena unui titru ASLO normal de 200 U.I/mL sau mai crescut, s dea o aglutinare vizibil a particulelor latex, fr diluarea serului. Reactivi: 1 flacon cu reactiv latex de 5mL 1 flacon control pozitiv de 1mL 1 flacon control negative de 1mL 1 plcu pe care se efectueaz reacia Interpretarea testului: Reacia ASLO negativ: obinerea unei suspensii lptoase, fr aglutinare, ca cea observat la controlul negativ Reacia ASLO pozitiv: obinerea unei aglutinri observat n cercul probei asemntoare cu cea observat la controlul pozitiv Valori crescute: > 200 U.I.: la pacienii care au avut n ultimele trei luni o angin streptococic sau alte infecii streptococice > 300 U.I.: n glomerulonefrita acut streptococic, scarlatin, purpura reumatoid 600-2500 U.I.: n RAA 2. Testul pentru identificarea proteinei C reactive Testul este utilizat pentru identificarea CRP n ser n vederea diagnosticrii unor afeciuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaiei . Principiul metodei: Reactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o fraciune de gamaglobulin a serului anti-uman CRP specific. Cnd CRP este prezent n prob, se observ o aglutinare ce indic un coninut de 6 mg /L.
2013-2014 33

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar Reactivi: 1 flacon cu reactiv latex de 5 mL 1 flacon cu control pozitiv de 1 mL 1 flacon cu control negativ de 1 mL 1 plcu pe care se efectueaz reacia

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Interpretarea rezultatelor: CRP nu este prezent n sensul pacienilor aparent sntoi Valori crescute: infecii bacteriene: pneumonii infarct miocardic, afeciuni maligne, LES, stri post-operatorii febr reumatic, afeciuni reumatice diverse, colagenoze, TBC activ 3. Testul RPR Carbon VDRL Reactivul RPR Carbon este o suspensie stabilizat cu cristale de colesterol marcate cu cardiolipin lecitin i particule de mangal (pentru mbuntirea interpretrii rezultatelor). Reactivul are rol de Ag fa de Ac prezeni n organismal pers oanelor infectate cu Treponema pallidum. Modul de lucru : Se aduc reactivii i probele la temperatura camerei, nainte de folo sire Se agit uor reactivul pentru dispersarea particulelor Se pune cte o pictur din controlul pozitiv i negativ n cte un cercule al plcuei Se pune cte o pictur (50 l) de ser nediluat din fiecare prob n cte unul din cercurile plcuei Se adaug o pictur de reactiv RPR Carbon, ori se pipeteaz 20 l de reactiv n fiecare cercule folosit Se amestec ambele picturi, fr s se disperseze pe toat suprafaa cercului Se rotete plcua manual ori cu un rotor mecanic de 80-100 rpm, 8 min Se citete prezena aglutinrii vizibile cu ochiul liber. O aglutinare nespecific poate apare dac testul este citit mai trziu de 8 min Interpretarea rezultatului: Rezultat pozitiv: prezena unor nori cenuii pe albul plcuei Rezultat negativ: lipsa unei reacii de floculare uniforme i a unei culori cenuii

2013-2014

34

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

4. Testul pentru identificarea AgHBs Testul pentru identificarea AgHBs este un test rapid, care se efectueaz din ser, este util n diagnosticul infeciei cu virusul hepatitic B. Rezultatul testului poate fi citit vizual, fr niciun instrument. Testul se bazeaz pe principiul determinrii semicantitative a AgHBs din ser, cu ajutorul metodei imunoenzimatice de tip sandwich . Anticorpii monoclonali i policlonali sunt folosii pentru identificarea AgHBs cu o nalt sensibilitate. Testul dureaz circa 15 min. Principiul metodei: 25 de plcue imunocromatografice Reactivul 1 = enzima conjugat Reactivul 2 = soluia de splare Reactivul 3 = soluia revelatoare

2013-2014

35

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Interpretarea rezultatelor: Negativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi mici Intens pozitiv: toate cele 3 spoturi mici i spotul mare sunt vizibile, iar spotul mare este intens colorat Slab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici i spotul central, dar spotul mare nu foarte intens colorat Neconcludent: cnd spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau cnd nu apare niciun spot; se repet testul 5. Testul COOMBS Test de diagnostic pentru anemiile hemolitice autoimune Const n reacia de hemaglutinare Testul DIRECT: detecteaz Ac anti-eritrocitari (AAc) fixai deja pe Ag de pe eritrocitele bolnavului Eritocitele se pun n contact cu ser anti-Ig, care determin aglutinare n urma cuplrii anti-Ig-AAc Testul INDIRECT: detecteaz Ac anti-eritrocitari (AAc) circulani Serul cu AAc provenit de la bolnav este pus n contact cu eritrocite normale care au pe suprafa Ag eritrocitare Are loc cuplarea AAc de Ag Adugarea de ser anti-Ig determin aglutinarea eritrocitelor

2013-2014

36

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

SUBIECTE COLOCVIU CAPITOLUL 2: 1. Funciile imunoglobulinelor 2. Proprietile IgG, IgM, IgE 3. Antigene exogene i endogene 4. Componentele sistemului complement 5. RIU primar 6. RIU secundar 7. RIC 8. Cooperarea LB-LTh 9. Testul COOMBS principiu 10. Structura de principiu a unei imunoglobuline 11. Haptenele, Ag convenionale i superantigenele 12. Testele ASLO, CRP, VDRL, AgHBs: interpretarea rezultatelor

2013-2014

37

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

CAPITOLUL 3. TERAPII IMUNOSTIMULATOARE IMUNIZAREA ORGANISMULUI Imunizarea organismului presupune ansamblul de msuri prin care se ofer protecie specific mpotriva patogenilor frecveni i agresivi. Edward Jenner a descoperit vaccinul mpotriva variolei (vrsat ului de vnt) n anul 1700. Imunizarea natural activ const n apariia unui rspuns imun specific i protector dup o boal infecioas, n urma contactului natural cu agentul patogen. Ea se realizeaz prin mecanismul memoriei imunologice i reprezint o achiziie a sistemului imun. Boala infecioas poate mbrca forme severe, uneori mortale, motiv pentru care imunizarea natural nu este ntotdeauna o variant benefic de imunizare . De aceea cercettorii au cutat nc de acum 200 de ani metode artificiale de imunizare. Imunizarea natural pasiv const n motenirea de ctre nou nscut a unui titru de anticorpi protectori de la mam, fa de bolile infecioase pentru care mama este imunizat. Aceti anticorpi sunt de tip IgG i traverseaz placenta n timpul vieii intrauterine. Dup natere ei continu s ajung la copil prin intermediul laptelui matern. Astfel copilul este protejat n primele luni de via de o serie de boli infecioase. ns titrul acestor anticorpi scade progresiv, astfel nct dup vrsta de 5-6 luni copilul nu mai este protejat. Imunizarea artificial activ const n inducerea memoriei imunologice prin introducerea n organism a unor ageni infecioi sau a unor antigene ale acestora prin intermediul vaccinurilor. Acestea nu sunt capabile s produc boala, dar pot induce un rpuns imun protector, similar cu cel obinut dup boal. Imunizarea artificial pasiv const n introducerea n organism a unor anticorpi specifici preformai, prin intermediul serurilor sau imunoglobulinelor. Imunizarea pasiv nu induce un rpuns imun din par tea organismului, nu declanaz mecanismele memoriei imunologice i asigur o protecie de scurt durat. IMUNOPROFILAXIA ACTIV PRIN VACCINARE Imunizarea activ determin protecie pe termen lung i memorie imunologic. Profilaxia asigurat prin vaccinare se numete imunizare activ i este durabil n timp .

2013-2014

38

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Ea nu trebuie confundat cu imunizarea pasiv realizat prin administrarea de seruri hiperimune sau imunoglobuline specifice, care asigur o protecie imediat dar de scurt durat, de circa 3-4 sptmni. Vaccinul este un preparat care conine fraciuni antigenice din structura unui agent infecios. El este capabil s induc la individul vaccinat un rspuns imun protector mpotriva respectivului agent infecios. Acesta se instaleaz dup un interval de timp necesar sintezei de anticorpi n urma vaccinrii. Apariia unui rspuns imun n cursul vaccinrii nu este suficient pentru protecie. Acesta trebuie s aib o anumit intensitate i este necesar apariia memoriei imunologice, asigurat de limfocitele T i B de memorie. Tipuri de vaccinuri: Germeni vii atenuai (vaccinuri vii bacteriene sau virale) Germeni mori Fraciuni de germeni Toxoizi (toxine secretate i detoxifiate) Recombinani de determinani antigenici Vaccinurile vii sunt utilizate pentru imunizarea mpotriva unor infecii virale: rujeol (pojar), rubeol, oreion, varicella, poliomielit, hepatit A. Pentru c pot determina simptome de boal majore, vaccinurile vii sunt atenuate prin cultivarea agentului patogen pentru perioade ndelungate n condiii anormale de cultur. Se vor selecta mutani care sunt adaptai supravieuirii n cultura anormal, dar au patogenitate mai redus n organism . Un exemplu este vaccinul mpotriva Mycobaterium (BCG bacilul Calmette Guerin). Acesta a fost obinut prin creterea Mycobaterium bovis pe un mediu cu o concentraie crescut de bil. Pentru c au capacitate mare de replicare, microorganismele determin un rspuns imun intens i prelungit, cu un titru nalt de anticorpi i formarea de celule de memorie. Astfel, n cele mai multe cazuri, vaccinurile atenuate necesit doar o singur imunizare. n plus, n cazul vaccinurilor cu microorganisme intracelulare se declan eaz i un rspuns imun celular. Principalul dezavantaj al vaccinurilor atenuate este reprezentat de posibilitatea ca agentul patogen respectiv s revin la patogenitatea iniial . Administrarea vaccinurilor vii atenuate este uneori urmat de reacii adverse care mimeaz infecia
2013-2014 39

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

natural cu agentul infecios coninut n vaccin . Sunt contraindicate la pacienii imunodeprimai pentru c pot determina reacii adverse severe i la gravide, din cauza posibilului efect teratogen. Vaccinurile inactivate conin virusuri sau bacterii lipsite total de putere patogen. Induc, dup administrri repetate, o imunizare activ. Pot fi utilizate la gravide i imunodeprimai. Vaccinurile inactivate determin inducerea unui rspuns predominant umoral. Exist mai multe tipuri de asemenea vaccinuri: Vaccinurile complete sau corpusculare , care conin bacteria sau virusul n ntregime. Ele sunt inactivate prin diverse procedee: formol, cldur, betapropio-lacton. Microorganismele astfel inactivate sunt incapabile s se replice n interiorul gazdei. Vaccinurile macromoleculare conin fragmente antigenice sau subuniti din structura virusului sau bacteriei: toxine detoxifiate (anatoxine), antigene capsulare (polizaharidice), antigene de membran (proteice). Vaccinurile preparate prin recombinare genetic, cum ar fi vaccinul contra hepatitei B (Engerix B). Vaccinurile obinute prin inginerie genetic sunt atenuate ireversibil prin ndeprtarea selectiv a genelor care sunt responsabile pentru virulena agentului respectiv. Vaccinurile obinute prin inactivarea toxinelor bacteriene (vaccinuri cu toxoizi): antidifteric, antitetanic, antiholeric, polivaccinuri de tip Polidin (stimularea imunitii pentru strepto, staphylo i meningococ).

2013-2014

40

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

Imunizarea pasiv prin seruri i prin imunoglobuline Serurile hiperimune conin anticorpi specifici preformai care acioneaz imediat dup administrare. Ele pot fi seruri: heterologe i homologe. Serurile heterologe Sunt recoltate de la animale (cai) n prealabil imunizate activ, care posed deci titruri mari de anticorpi specifici. Din cauza riscului de accidente anafilactice ele sunt din ce n ce mai puin utilizate, fiind nlocuite cu Ig umane specifice. Se administreaz n scop profilactic, imediat dup un presupus contact cu agentul infecios (plag tetanigen, plag rabigen). Serurile homologe (umane): provin de la convalesceni. Ele au fost abandonate din cauza riscului transmiterii unor virusuri, ca HIV i virusurile hepatitice. Imunoglobulinele umane se recolteaz de la populaia adult i sunt de 2 tipuri: gamaglobuline standard (administrate n deficitele imune primitive cu hipogamaglobulinemie, infecii bacteriene severe recidivante la copiii infectai HIV, leucemie limfoid cronic i pentru profilaxia rujeolei sau a hepatitei A dup un contact infectant) gamaglobuline specifice (se utilizeaz Ig antitetanice, antirabice, antihepatit B, antivariceloase) Durata rspunsului imun post contact natural sau vaccinare Pentru toat viaa rujeola, rubeola, oreionul, varicela Pentru 10 ani HVB, antitetanic Pentru cteva luni - holera Imunoprofilaxia secundar DTP diftero-tetanic-pertussis luna a 2-a de via i 3 rapeluri la 4, 6, 12 luni HVB administrat la natere, lunile 2 i 6 VPI (antipolio) luna a 2-a de via, cu rapel BCG (antituberculos) n primul an de via Momentul administrrii vaccinurilor Profilactic pre-expunere Terapeutic post-expunere
2013-2014 41

UMF Carol Davila Bucureti Facultatea de Medicin Dentar Calea de administrare a vaccinurilor Injectabil i.m, s.c, i.d - rapel Reacii adverse la imunizare Sindrom febril Stare general alterat Artralgii Tulburri neurologice Reacii alergice Sindrom inflamator rubor, edem, durere

Disciplina de Fiziopatologie i Imunologie Anul de studii: III

SUBIECTE COLOCVIU CAPITOLUL 3: 1. Imunizarea natural activ 2. Imunizarea natural pasiv 3. Imunizarea artificial activ 4. Imunizare artificial pasiv 5. Tipuri de vaccinuri 6. Vaccinurile vii 7. Vaccinurile inactive 8. Vaccinurile macromoleculare 9. Serurile heterologe 10. Serurile homologe 11. Imunoprofilaxia secundar 12. Momentele i calea administrrii vaccinurilor 13. Reacii adverse la imunizare

Acest material este proprietatea intelectual a Disciplinei de Fiziopatologie i Imunologie Medicin Dentar. Reproducerea parial sau integral a textului este interzis.

2013-2014

42