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Laboratorio de Microbiologa

AO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N 7
TECNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Integrantes:
20111360 20091001 20120456 20100472 Colquehuanca Meja, Eliana Elsye Flores Calderon, Elvis Hedim Norabuena Damian, Juan Bernardo Tantahuillca Landeo, Pat Teresa

Mesa N5

Grupo: Mircoles de 3 a 5 pm

2013

Laboratorio de Microbiologa

I.

INTRODUCCIN
Muchos de los anlisis realizados en los laboratorios de microbiologa de alimentos incluyen en recuento de microorganismos presentes en una muestra. Aunque se puede usar el microscopio para enumerar los microorganismos, esta tcnica tiene tres limitaciones. Primero, es difcil de diferenciar las clulas vivas de las clulas muertas. Segundo, es casi imposible observar la bacteria a la luz del microscopio con una densidad celular de menos de 10 por mililitro. Tercero, los materiales slidos como partculas de nutrientes no pueden ser vistos sin una ruptura mecnica debajo de la luz de un microscopio de alta potencia (Swanson, Petran y Hanlin; 2001). Seguido de la incubacin, la poblacin de microorganismos originalmente presente puede ser estimada por un recuento del nmero de colonias o el nmero de tubos que muestran evidencia del crecimiento y multiplicacin a travs de la dilucin que fue agregada a las placas o tubos. En el caso de los alimentos, existe un lmite para recuento de bacterias en estos, que ya estn establecidos por la norma siendo permitidos dentro de un rango de 30 a 300 u.f.c./ml. Generalmente los microorganismos se encuentran mezclados unos con otros en una muestra, por lo que se realizan aislamientos para estudiar un microorganismo objetivo a travs de un cultivo puro. Esto porque viven de forma sinergstica, o sea que existe cooperacin entre ellos. En este informe se explican las principales tcnica usadas para el cultivo del microorganismo, caractersticas del crecimiento en medios de cultivos como en el caldo nutritivo y agar nutritivo (inclinado y vertical); adems del aislamiento y recuento de microorganismos con dos mtodos: a) por estras en placas con agar Mc Conkey y agar Manitol-salado, b) diluciones por incorporacin (0,1 ml) en agar nutritivo licuado.
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OBJETIVOS:

Observar caractersticas de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo lquido y slido. Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismo utilizando tcnicas de aislamiento.

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II.

MARCO TERICO
El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre de siembra, esta operacin la podemos realizar a partir de muestras biolgicas (orina, pus, secreciones, etc.), de anlisis de control de calidad (alimentos, aguas, cosmticos, medicamentos, etc.), procedentes de muestras ambientales (agua, suelo, aire, etc.) o de un cultivo microbiano a otro. Por otro lado, si la realizamos de un cultivo a otro se denomina subcultivo o repique (Rojas, 2011). Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo (Agar Gelatina, Agar Mc Conkey, etc.), puede ser inoculado e inmediatamente incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. En la toma de muestras de un medio (solido, liquido o aire), mayormente se tiene una poblacin mixta, entonces si se quiere cultivar una especie de la muestra se debe realizar tcnicas de aislamientos que permitan obtener cultivo axnicos o puros. Un cultivo puro o axnico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y que procede de una sola clula, el crecimiento de esta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente reconocibles o visibles que recibe el nombre de colonia, un ejemplo figura 1.

Figura 1: Pseudomona aeruginosa cultivada en agar Triptacasa-Soja Fuente: Madigan, 2009. La tcnica de aislamiento, fue desarrollada durante el siglo XIX. En un principio se utiliz diluciones seriadas en medio lquido, pero la presencia de contaminantes (microorganismos no deseados) dificulto el aislamiento. Posteriormente la escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, completamente con agar y las placas Petri para bacterias, permitiendo as la separacin de fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. Esto permite tener una visin macroscpica de las colonias y de diferenciar distintas especies microbianas.

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2.1 Tcnica de siembra en medios contenidos en tubos

Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo nutritivo, agar inclinado, otros. As se observara en las colonias su intensidad de enturbiamiento, aparicin de pelcula o sedimento en el tubo, tambin poder determinar un crecimiento mvil o no. En esta siembra se debe tener mayor cuidado, puesto que un contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de estudio, por lo tanto se deber tomar las siguientes precauciones: Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la bica de este. Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el tubo, sostenindolos entre el dedo menique, el anular y el dedo del corazn. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algn otro lugar. Flamear la boca de tubo antes de cerrarlo despus de la siembra o inoculacin. Esterilizar el asa adecuadamente (toda porcin que entra en contacto con el medio de cultivo) Sumergir el asa en el medio de cultivo, sin tocar las paredes del tubo. Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo. Despus de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo. Al sembrar trabajar en cmara de flujo laminar o en su defecto con mechero Bunsen. En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo, as como, utilice asas totalmente rectas.

a) Siembra en tubos por estras simples

Se realiza en un tubo con medio solido inclinado (en bisel o pico de flauta), y deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marque con movimiento en zigzag o surcos en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea inclinada. Luego incubar en estufa durante 28-48 horas a temperatura ms adecuada a 37C.

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Figura 2: Siembra en un tubo de agar inclinado b) Siembra en tubos por picadura Se realiza con asa recta en punta en tubos de medios slidos y semislidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de superficie, llegando con el extremo del asa al fondo del tubo y retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa (de argolla) o con cierto movimiento de vaivn podra originar un patrn de crecimiento que se interpretara errneamente como movilidad bacteriana. Por ultimo incubar durante 24-48 horas a temperatura optima de crecimiento.

Figura 3: Prueba de movilidad en agar semislido.

c) Siembra en tubo en medio lquido (caldo lquido)

Transferir aspticamente con el asa bacteriolgica (de argolla), o en algunos casos, pipetas estriles o hisopos. Si se usa asas bacteriolgicas, de una pequea muestra de microorganismos, se transfiere desde el tubo que

contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estril, se inocula el microorganismo en el medio lquido, sumergiendo el asa en el lquido y rotar el mango para desprender la muestra.

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Figura 4: Inoculacin de un caldo de cultivo

2.2 Tcnicas de aislamiento

Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en

aislar de l los

microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios

experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la biotecnologa y la microbiologa industrial y ambiental (Madigan, 2009). Hernndez (2003) nos dice que se ha desarrollado una serie de tcnicas microbiolgicas para aislar microorganismo y obtener cultivos puros. A

continuacin se mencionan tres de ellas: Siembra en placas de Petri por rayado Siembra en placa vertida Diluciones en serie

2.2.1

La siembra en placas de Petri por rayado

Esta tcnica se basa en la separacin de los microorganismos al dispersarpor rayado sobre agar- una muestra que los contiene, segn se muestra en la figura 5, a. Para llevar a cabo la disgregacin, se recoge una porcin de la muestra con un asa bacteriolgica y se raya sobre una seccin de una placa Petri; luego, se repite el rayado en tres secciones ms de la placa. En cada rayado, se toma la muestra de la seccin anterior por lo que se logra una disminucin gradual en la cantidad de microorganismos. Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo recomendados; al crecer, formarn colonias separadas unas de otras en alguna de las secciones del rayado, como se puede observar en la figura 5, b. En esa figura, cada punto representa una colonia. Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el procedimiento, con la finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de microorganismos.

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Figura 5: Siembra en placa Petri por rayado. a) El rayado de placas con asa microbiolgica. b) El crecimiento y la separacin de las colonias. Fuente: Hernndez, 2003.

2.2.2

La siembra en placa vertida

En esta tcnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una concentracin diferente, y se evala el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada.

Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas diluciones y se coloca cada una en un tubo con agar fundido, como se muestra en la figura 6, a. Luego, se mezcla homogneamente el contenido (el agar y el inculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri, segn se muestra en la figura 6, b.

Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilucin en la que se haya obtenido mayor separacin de las colonias.

Por ltimo, de esta dilucin, se toma una muestra de las colonias y se siembra en una placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo est puro. La conformacin de pureza se puede realizar por observacin a simple vista (colonias de igual morfologa), por observacin microscpica o mediante pruebas bioqumicas.

Figura 6: La siembra en placa vertida. a) Las diluciones de la muestra. b) El vertido del cultivo en una placa de Petri. Fuente: Hernndez, 2003.

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2.2.3

Diluciones en serie Esta tcnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de inters se encuentra en mayor cantidad que los dems. Para llevarla a cabo, se preparan varias diluciones de la muestra y se incuban en el medio de cultivo adecuado para que crezca este microorganismo; as, se logra que en alguna de las diluciones solo l aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando el mtodo de siembra en placa de Petri por rayado.

2.3 Morfologa de la colonia de bacterias

Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivos exhiben diferentes tipos, formas macroscpicas en su crecimiento, estas diferencias llamadas caractersticas culturales, son la base para la separacin de ellas en grupos taxonmicos. Estas son determinadas por el cultivo de microorganismos en agar Nutritivo inclinado, en placas de Petri, en caldo nutritivo y otros.

La morfologa colonial, es una caracterstica indispensable a tener en cuenta en el aislamiento primario de una bacteria y, en la cual se debe considerar el borde y la elevacin de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y textura de la masa celular, pues tambin son caractersticas distintivas. La consistencia va desde viscosas que se pegan en el asa y se separan de la colonia formando un hilo. As como tambin la pigmentacin de la colonia, las pelculas continas de crecimiento (bacterias mviles), colonias lisas (generalmente virulentas) o colonias rugosas (generalmente avirulentas).

2.3.1

Caracterizacin del crecimiento sobre Agar Nutritivo inclinado

Los cultivos en este medio se inoculan en una sola lnea recta (sobre la superficie del bisel), y se evalan de la siguiente manera:

Abundancia de crecimiento: La cantidad de crecimiento es designada como ninguna, leve, moderada o abundante.

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Pigmentacin:

Los microorganismos cromognicos, pueden

producir pigmentos intracelulares que son responsables de la coloracin de las colonias; otros microorganismos, producen pigmentos solubles extracelulares que son excretados en el medio y tambin producen color, sin embargo la mayora de la los microorganismos son no cromognicos y aparecern en

tonalidades que van desde el blanco al gris. Las caractersticas pticas: Pueden evaluarse con base en la cantidad de luz transmitida a travs del crecimiento, estas caractersticas son descritas como: opaca (ninguna transmisin de luz), translucida (transmisin parcial), o transparente (transmisin total de la luz). Forma: La apariencia del crecimiento de la siembra en una sola lnea sobre la superficie del agar inclinado se designa de la siguiente forma (Ver figura 7).

Estas pueden ser:

a. Filiforme.- Crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos. b. Equinulado.- Crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares continuos. c. Barbado.- Colonias semi-confluentes o no confluentes. d. Difuso.- Crecimiento difuso y reducido. e. Arborescente.- Crecimiento en forma de rbol. f. Rizoide.- Crecimiento en forma de raz.

Figura 7: Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en una sola lnea sobre agar Nutritivo inclinado, donde: (A) Crecimiento filiforme, (B) equinulado, (C) barbado, (D) difuso, (E) arborescente y, (F) rizoide. Fuente: Rojas, 2011.

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2.3.2

Caracterizacin del crecimiento en caldo nutritivo

Son evaluados segn la distribucin y apariencia del crecimiento como sigue (Ver figura 8):

a. Turbidez fina uniforme.- Crecimiento fino y totalmente disperso b. Floculante.Crecimiento en agregados escamosos

totalmente dispersos c. Pelcula.- Crecimiento en la superficie como plataforma, grueso d. Sedimento.- Concentracin del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser granular, escamoso o floculante.

Figura 8: Apariencia del crecimiento bacteriano, sembrado en caldo Nutritivo, donde: (A) Crecimiento de turbidez fina uniforme, (B) floculante, (C) pelcula y, (D) sedimento. Fuente: Rojas, 2011.

2.3.3

Caracterizacin del crecimiento en placas de Agar Nutritivo La descripcin se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable macroscpicamente), de forma aislada y se evala de la siguiente manera (figura 9).

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a. Tamao: Grande (dimetro mayor a 1mm), mediano (dimetro aproximado a 1 mm), pequeo (dimetro inferior a 1 mm) y puntiforme. b. Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide y lanceolada.

c. Borde: De borde regular (continuo), de borde irregular (ondulado, lobulado, espinoso/dentado/lacerado, ondulado y filamentoso). d. Elevacin: Plana o aplastada (no elevacin), elevada (convexa baja, convexa cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada). e. Superficie: Lisa o rugosa. f. Consistencia: Blanda, dura o mucoide.

g. Aspecto: Brillante, opaco y mate o translucido. h. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que decoloran el medio, pigmentos fluorescentes y pigmentos no difundibles confinados a las colonias.

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Figura 9: Descripcin macroscpica realizada en colonias creciendo sobre Agar Nutritivo, donde se aprecia la forma, la elevacin y el borde. Fuente: Rojas, 2011

La morfologa de las colonias es un parmetro importante en el proceso de identificacin bacteriana, siendo estas caractersticas, comunes entre cada gnero bacteriano. Sin embargo, la morfologa puede alterarse por tiempo de incubacin, composicin del medio de cultivo (excesiva desecacin o humedad), etc. Esta descripcin es tambin aplicable a las levaduras, debido a que esta presenta crecimientos tpicos a bacterias.

III.

PARTE EXPERIMENTAL
Ejercicio 1: Tcnicas de cultivo de Microorganismos: Caractersticas de crecimiento en medio de cultivo Materiales:
Cultivo de microorganismos de 18 horas: Staphylococcus sp Asa de klle Mechero

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Tubos con agar nutritivo inclinado Tubos con agar nutritivo vertical Tubos con caldo nutritivo

Procedimiento:
1. Se esteriliz el asa de klle por flameo a la llama. 2. Se tom el tubo con cultivo de 18 horas, se retir el tapn, se flame la boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequea porcin del cultivo con ayuda del asa de klle. Se flame nuevamente la boca del tubo antes de volver a taparlo. 3. Se tom el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores se introdujo el asa en el lquido para dejar el inculo. Se homogeniz la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano. 4. Se repiti el procedimiento 1 para obtener ms inculo, pero se us esta vez aguja de klle. 5. Se tom el tubo de agar inclinado y se realiz la siembra depositando el inculo a lo largo de una sola lnea descrita desde la base de inclinacin hasta el extremo. 6. Se repiti el procedimiento 1 para obtener ms inculo, se us nuevamente aguja de klle. 7. Se tom el tubo con agar vertical y se realiz la siembra por picadura profunda del medio. 8. Se rotularon los tubos sembrados y se colocaron a incubar a 37C por 24 horas. 9. Cumplido el tiempo de incubacin, se evalu el crecimiento.

Figura 10. 1. Se esteriliz el asa de klle por flameo.

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Figura 11. Se introdujo el asa en el lquido para dejar el inculo.

Figura 12. Se introdujo el asa en el lquido para dejar el inculo.

Ejercicio 2: Tcnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y Recuento

en placas

Materiales:
Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos

(Serratiamarcescens, Bacillus sp., Escherichia coli, Micrococcus sp., Proteus sp.) Asa de klle, aguja de klle Mechero Tubos con 12ml de agar nutritivo licuado y manteniendo a 50C Placas Petri estriles Placas con Agar nutritivo

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Placas con Agar Mc Conkey Placas con Agar Manitol Salado

Procedimiento: A. Aislamiento por estras

1. Se tom el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa o aguja de klle previamente esterilizada a la llama, se retir el inculo. Se consider todas las recomendaciones antes dadas para el trabajo con asepsia. 2. Se tom la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos pulgar e ndice se levant hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia de la llama del mechero. No se descubri por completo la placa, as se evit mayor contaminacin. Con el asa cargada de inculo, se hizo estras sobre toda la superficie del medio, se procur trazar una ltima estra en un espacio libre. Se cerr la placa. 3. Se esteriliz el asa a la llama nuevamente. 4. Se repiti los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mc Conkey. 5. Se coloc las placas en incubacin a 37C por 24 horas. 6. Se observ el desarrollo de colonias individuales y se describieron sus caractersticas de forma, elevacin, consistencia, bordes, etc. Se diferenci las caractersticas de las colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

B. Aislamiento por diluciones

1. Se tom el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa de klle se retir inculo. 2. Se tom un primer tubo de agar licuado mantenindolo a 50C y

transferir aspticamente el inculo. Se esteriliz el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado se mezcl el inculo con el medio, se hizo girar entre las palmas de las manos. 3. Se transferir una asada del agar mezclado con el inculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Se repiti la operacin anterior para obtener una mezcla homognea. 4. Se verti el contenido de cada tubo por separado en dos placas Petri estriles y se rot lentamente sobre la mesa para distribuir el medio de manera uniforme. Se rotularon cada dilucin para diferenciarlas.

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5. Se incub las placas a 37C por 24 horas. 6. Se examin el crecimiento de las colonias en las placas. Se hizo un recuento de colonias (el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300). Se describieron las caractersticas diferenciales de las colonias observadas.

IV.

OBSERVACIONES
Al da siguiente se observaron los resultados en cada placa, y cada tubo. Obteniendo los siguientes resultados:

Ejercicio 1: Caractersticas de crecimiento en medio de cultivo.

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Figura 13: Agar nutritivo inclinado.

Agar Nutritivo inclinado Cantidad Abundante Distribucin en la superficie Irregular Forma de crecimiento Rizoide Consistencia de crecimiento Viscoso Pigmentacin Blanco

Figura 14: Agar nutritivo vertical

Agar Nutritivo Vertical Crecimiento Limitado a la lnea de inoculacin En profundidad

Figura 15: Caldo nutritivo

Caldo Nutritivo Cantidad Escasa

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Apariencia o tipo

Turbidez, aparicin de opacidad en el medio.

Ejercicio 2: Tcnica de aislamiento.

A) Aislamiento por estras:

Caractersticas de colonias observadas: Tienen forma redondeada Presentan elevacin

Figura 16. Crecimiento de Staphylococcus sp en Agar MacConkey.

Caractersticas de colonias observadas: No se observ crecimiento de colonias de Staphylococcus sp, despus de aproximadamente 24 horas.

a) Figura 17. Crecimiento de Staphylococcus sp en agar manitol salado.

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B) Aislamieno por diluciones

Figura 18. Primera asada del agar mezclado con el inculo.

Caractersticas de las colonias presentes con la primera asada del inculo : Se obsev colonias muy juntas y abundantes.

Colonias formadas

Figura 19. Segunda asada del agar mezclado con el inculo.

Caractersticas de las colonias presentes con la segunda asada del inculo: Se observ que las colonias presentes estaban an juntas pero si se podan contabilizar. El nmero de colonias contabilizadas

fue de 92.

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V.

DISCUSIONES
Las bacterias Staphylococcus sp son poco exigentes en sus necesidades; crece bien en cualquier medio ordinario, aunque lo hacen mejor en los medios enriquecidos. Los medios de cultivo comunes son el agar nutritivo donde crece Staphylococcus sp.,

como se muestra en las figuras 13 y 14, donde se observa un crecimiento de microorganismos; lo mismo sucede en el medio de caldo nutritivo como se muestra en la figura 1, donde se observa turbidez (cambio de color) despus de aproximadamente 24 horas, siendo esto indicador de que se han crecido microorganismos.

En la figura 16 se muestra el crecimiento de Staphylococcus sp en el medio de cultivo de agar Mac Conkey, pero segn Konemman et al. (2006) este medio de siembra es diferencial, solo para seleccionar y recuperar Enterobacteriaceae y bacilos

gramnegativos entricos relacionados, inhibiendo a las gram-negativas como lo es Staphylococcus sp; por lo tanto en el experimento ocurri un error, tal vez en la

preparacin del medio o al momento de sembrar las bacterias.

Segn Pahissa (2009), el medio selectivo

ms empleado para identificar

Staphylococcus sp es el agar sal manitol (medio Chapman), que por su elevado contenido en sal inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias gramnegativas. Sin embargo como se muestra en la figura 17, en la experimentacin no crecieron colonias de Staphylococcus sp, este error pudo deberse a una mala preparacin del medio de cultivo.

Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales ptimas para su crecimiento, en la figura 18 se muestra que en la primera asada se obtuvieron una gran cantidad de colonias, pero en la segunda asada se obtuvo una cantida menor a 300 y mayor a 30 , siendo esta contabilizada (92 colonias) como se muestra en la figura 19, estas crecieron en el centro de la placa petri.

VI.

CONCLUSIONES

Se logr observar el crecimiento de las bacterias Staphylococcus sp en medios de cultivo como agar nutritivo inclinado, agar nutritivo vertical y caldo nutritivo.

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Se logr separar colonias

con la tcnica de estras, aunque este

experimento presento un error ya que las bacterias Staphylococcus no deban crecer en el medio con agar MacConkey pero si en el agar manitol.

Se logr observar colonias individuales con dos asadas a partir del inculo de una mezcla de bacterias.

VII.

CUESTIONARIO

Ejercicio 1: Tcnicas de cultivo de Microorganismos: Caractersticas de crecimiento en medio de cultivo.

1. Por qu algunos microorganismos desarrollan en caldo un caracterstico crecimiento tipo pelcula? Qu factores ambientales podran alterar la formacin de una pelcula superficial? El crecimiento tipo pelcula es la acumulacin de los microorganismos que se estn cultivando en la superficie del medio de cultivo, en este caso del caldo nutritivo. Los microorganismos se acumulan all por tener respiracin tipo aerobia. Al ser el oxgeno poco soluble en agua no penetra en la totalidad del tubo, y se concentra en la superficie del medio donde se agrupan los microorganismos, formando la pelcula. La concentracin del oxgeno ambiental que disipara la acumulacin de

microorganismos en la superficie del medio o factores como el aumento de temperatura pueden tambin causar la muerte del microorganismo.

2. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de crecimiento es preferible inocular con aguja de klle y no con asa. Por qu?

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La aguja de Klle, a diferencia del asa, facilita el sembrado del inculo en el agar debido a que es necesario hacer la estra sobre ste, la cual debe realizase desde la base hasta el borde del medio, asegurando de este modo el crecimiento de los microorganismos. Adems la cantidad de inculo debe ser moderada y el asa tiende a recoger muestras abundantes.

3. Cuando se utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las caractersticas de crecimiento es preferible inocular con aguja de klle y no con asa Por qu? Qu factores de influirn en la abundancia del crecimiento en caldo, agar inclinado y agar vertical? El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

a) Disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido.

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Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. b) Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

c) Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

d) Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

e) pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.

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f) Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertermfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprfitos tienen rangos ms amplios. g) Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

Ejercicio 2: Tcnica de cultivo de Microorganismos: Aislamiento y recuento en placas

1. Qu procedimiento seguira a continuacin del desarrollo en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? Cmo podramos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias aisladas? Luego de tener las colonias aisladas, stas deben transferirse con el filamento a un tubo que contenga agar nutritivo estril para cultivar esa colonia aislada; este procedimiento se conoce como trasplante. Para garantizar la pureza del cultivo obtenido, es conveniente, a partir de cada tipo de colonia aislada, repetir el proceso de aislamiento antes descrito. Se considerar que se ha obtenido un cultivo puro, cuando al realizar este proceso, todas las colonias obtenidas presenten las mismas caractersticas. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento depender, entre otros factores, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos que se espera aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus caractersticas y/o por la cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtencin del microorganismo objeto del aislamiento. En este ltimo caso, se deben utilizar medios de enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de grmenes contaminantes.

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La temperatura y otras condiciones de incubacin, variarn segn los microorganismos, usualmente la temperatura ptima de los microorganismos patgenos para el hombre oscila entre 30 y 40C. Cuando el microorganismo que se intenta aislar es anaerbico, deben tomarse las precauciones necesarias a fin de eliminar la presencia de oxgeno en el ambiente donde se desarrollar el mismo. Basndose en el origen y naturaleza de la muestra se pueden inferir los posibles microorganismos que se encuentran presentes en la misma, y ese conocimiento ayudar en la seleccin del medio y las condiciones de cultivo adecuadas. Para iguales fines, es de gran utilidad el conocimiento de la procedencia de la muestra analizada.

2. Qu factores limitan el tamao de las colonias en una placa de cultivo? Existen diversos factores que limitan el tamao de las colonias en un placa de cultivo; una de ellas es el pH, dependiendo del rango de pH del medio; el contenido de agua, influenciar en la forma y tamao de la colonia; el potencial de xido reduccin; el contenido nutricional presente en el medio cultivo; los constituyentes antimicrobiales y las estructuras bilgicas.

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el nmero total de colonias por gramo. Plantee una metodologa cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema. El mtodo de recuento en placa consiste en sembrar por duplicado 1 ml de la muestra liquida o 1ml de la dilucin madre en placas Petri estriles. Se repite esta operacin en cada una de las diluciones decimales preparados. Verter 15 ml de agar VRBL a 45C, mezclar y dejar solidificar, preparar de la misma manera una placa testigo, para controlar la esterilidad del medio, cubrirla con 4ml del mismo medio a 45C. Dejar solidificar e incubar a 30C durante 24 a 48 horas. Se contabiliza las colonias de dimetro mayor o igual a 0.5mm en las placas que contengan 150 colonias caractersticas o de 30 a 300 colonias. Por medio de la densidad se podr hallar el nmero de colonias por gramo.

4. En qu consiste la tcnica del nmero ms probable y qu usos tiene? La estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP) es muy adecuado para determinar bacterias anaerobias, porque permite mantener un ambiente anaerobio dentro de los tubos, sin necesitar de sistemas anaerobios ms complejos como cmaras o jarras anaerobias.

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El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados. El mtodo consiste en la estimacin del nmero de microorganismos viables a partir de diluciones sucesivas (1/10) partiendo de 1 g de suelo o sedimento en base hmeda o 1 ml de agua; posteriormente, de tres o ms de las diluciones se inoculan tubos con medio de cultivo con sustratos y aceptores de electrones especficos. En este mtodo se asume que en las series de diluciones los microorganismos se encuentran distribuidos al azar y que al menos un microorganismo generar crecimiento, produciendo una respuesta positiva (turbidez, cambio de color, produccin de algn metabolito especfico). Esta tcnica se basa en la estimacin de la densidad bacteriana por el mtodo estadstico de mxima probabilidad, utilizando la teora de diluciones. Para realizar la estimacin microbiana se utiliza un mnimo de tres diluciones y un intervalo de 3 a 10 rplicas (n tubos de medio para crecimiento) por dilucin; el nmero de diluciones y rplicas utilizadas estar en funcin de la precisin requerida. Actualmente, existen tablas estndar como las publicadas por la FDA o NACE para estimar el nmero de microorganismos ms probable. Estas tablas estn limitadas a tres diluciones y a 3, 5 y 10 rplicas por dilucin; sin embargo, tambin existen programas de computadora (MPN CalculatorTM, Chem SW) para obtener la estimacin microbiana empleando ms de tres diluciones y un nmero mayor de rplicas.

5. De qu manera se pueden preservar cepas puras por largos perodos?

Existen varios mtodos para la conservacin de los microorganismos-, todos buscan que las clulas sufran el dao mnimo y se preserven por el mximo periodo posible. Los cuatro procedimientos generales son: La siembra o el subcultivo: Este mtodo consiste en sembrar el microorganismo en determinado medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeracin. El procedimiento se debe repetir cada cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar inclinado, o en botellas especiales que contienen un medio de cultivo slido y estril. Una de las desventajas del mtodo es que los tubos guardados en refrigeracin se deshidratan y, entonces el microorganismo muere, por esta razn, es necesario repetir el procedimiento peridicamente.

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Una variacin del mtodo consiste en adicionar aceite mineral estril al tubo o a la botella con el microorganismo en crecimiento, de tal forma que cubra al agar hasta una altura de un centmetro y medio, para reducir el metabolismo del microorganismo y la deshidratacin del medio de cultivo. La desecacin: El mtodo consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratacin de las clulas de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se inocula una muestra de cultivo en tierra hmeda estril (material de soporte), se separa hasta que haya crecimiento (vatios das) y, luego se seca con aire a vaco. Despus, el cultivo se guarda en una atmsfera seca o en refrigeracin. Otros materiales de soporte pueden ser slica gel, discos de gelatina y tiras de papel. Entre las ventajas del mtodo se puede mencionar que no necesita equipo especial ni mucho personal para ejecutarlo y, si no sufre daos durante la desecacin, el cultivo puede continuar viable por muchos aos.

La congelacin: La congelacin es, al igual que la liofilizacin, uno de los mtodos de mantenimiento ms utilizados, porque se logran los periodos de conservacin ms largos (superiores a veinte aos, cuando se utiliza nitrgeno lquido). En el proceso de congelacin lo ms importante es controlar la velocidad de disminucin de la temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a partir del lquido contenido en las clulas sern muy grandes y pueden romper la membrana celular. El proceso de congelacin se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se lleva a cabo, en: Congelacin ordinaria: Se mantienen temperaturas de -5 a -20C. Congelacin ultrafra: Se efecta en congeladores mecnicos entre -50 y -80C. Congelacin con nitrgeno lquido: Se logran temperaturas de -150 a -196C.

La liofilizacin: Es la remocin de agua de las clulas congeladas (slidas) a presin reducida (sublimacin). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra de cultivo por conservar y se suspende en algn medio con crioprotectores, como leche, suero o glutamato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se congela y se somete a alto vaco hasta que el agua celular se sublima (pasa de estado slido al gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la contiene se sella para impedir que el microorganismo se altere por el contacto con el medio ambiente.

6. Qu tcnicas de cultivo se emplean anaerbicos?

para aislar microorganismos

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El aislamiento de bacterias anaerbicas por mtodo de siembra en placa plantea problemas especiales. Siempre que los organismos en cuestin no mueran rpidamente al ser expuestos al oxgeno, las placas pueden preparase de la manera usual y luego incubarse en recipientes, de los cuales se elimina el oxgeno bien sea por absorcin qumica o por evacuacin. Para los anaerbicos ms sensibles al oxgeno, es preferible una modificacin del mtodo de siembra por vertido, denominado cultivo por dilucin y agitacin. Un tubo con agar fundido y enfriado se inocula y se mezcla, aproximadamente la dcima parte de su contenido se transfiere a un segundo tubo el cual se mezcla a su vez y se utiliza para inocular un tercer tubo de la misma manera. Despus de haber preparado de 6 a 10 disoluciones sucesivas, los tubos se enfran rpidamente y se encierran hermticamente una forma es verter un capa de vaselina y parafina, con el fin de evitar el acceso del aire a la columna de agar. En esto cultivos, las colonias se desarrollan en profundidad dentro de la columna de agar, y por lo tanto no son tan fcilmente accesibles. Para hacer una transferencia de colonias se elimina el cierre de vaselina-parafina con una aguja estril y la columna de agar se extruye del tubo soplando suavemente una corriente de gas libre de oxgeno a travs de una pipeta capilar introducida entre la pared del tubo y el agar. La columna extruida se recoge en una placa Petri estril y se secciona en discos con una cuchilla estril, a fin de permitir el examen y transferencia de las colonias. Muchas bacterias mueren al ser expuestas aunque slo sea momentneamente al aire; por lo tanto, el cultivo con xito de estos anaerobios estrictos exige medidas extraordinarias para excluir, en todo momento, incluso trazas de oxgeno. Habitualmente se utilizan dos tcnicas principales para el cultivo de bacterias en completa ausencia de oxgeno; son las tcnicas de tubo rodante y las de la cmara anaerbica con guantes. El procedimiento del tubo rodante, desarrollado por R. E. Hungate, se usa para obtener cultivos puros de anaerobios estrictos distribuyendo clulas en una fina capa de agar depositado en la pared de un tubo de ensayo, en donde se desarrollan como colonias aisladas. El tubo de ensayo contiene unos pocos mililitros de medio con agar fundido que ha sido reducido qumicamente para eliminar el oxgeno disuelto; el tubo es cerrado hermticamente con un tampn de goma de butilo. El agar fundido se inocula con diluciones apropiadas de la fuente de bateras, introducindolas a travs de los tapones de goma con una jeringa estril. Los tubos se depositan luego tumbados sobre hielo y se los hace rodar hasta que el agar se solidifique formando una capa fina en la pared del tubo. Despus de un periodo de incubacin, cuando las colonias son ya visibles, se quita el tampn y las colonias aisladas se recogen con una aguja o con un tubo capilar. Siempre que se destapa un tubo, se impide la entrada de aire pasando continuamente una corriente libre de O2 (normalmente CO2 N2) al interior del tubo. Para asegurarse de que no ha penetrado algo de aire inadvertidamente, se suele incluir en el medio el

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colorante sensible al redox resazurina, que vira de incoloro a rojo cuando el Eh alcanza un valor de -0.042 V. Tambin pueden aislarse anaerobios estrictos utilizando tcnicas convencionales de siembra por estra en placa, si se realizan todos los procedimientos dentro de una cmara anaerbica, que contiene una atmsfera reductora.

VIII.

BIBLIOGRAFA

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