1

S i l v i a L e t i c i a S a n c h e z Prado. T e l f o n o : 5-32-26-38. M a t r c u l a : 82233601.

CLAVE: 23. 3. 128. 8 7 JCarrera: I n g e n i e r a Bioqumica I n d u s t r i a l . Trimestre l e c t i v o : 88-0 Horas semana: 20 - 2 5 h o r a s . L u g a r : L a b o r a t o r i o de M i c r o b i o l o g a , e d i f i c i o S - 1 5 7 . U n i v e r s i d a d Autdnoma Metropolitana-Iztapalapa. ' de 1 9 8 7 . F e c h a de i n i c i o : D i c i e m b r e 1 J F e c h a de t e r m i n a c i b n : J u n i o 1 ' de 19% /T u t o r i n t e r n o : M. en C. J a v i e r B a r r i o s G o n z l e z . Profesor asociado C Depto. B i o t e c n o l o g l a .

4itulo:

P r o d u c c i n de P e n i c i l i n a en F e r m e n t a c i n L q u i d a

S i l v i a L e t i c i a S a n c h e z Prado.

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8. e n ' C .

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k v . .

I,

J a v i e r B a r r i o s Gonzalez.

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INDICE

...

1.-

TITULO DEL INFORME FINAL INTRODUCCION 2.1. 2 . 2 . 2.3. 2.4. INTRODUCCION GENERAL ESTRUCTURA BIOSINTESIS MECANISMO DE REGULACION A ) REGULACION POR LA FUENTE DE CARBONO B ) REGULACION POR NITROGEN0

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2.-

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2.5.
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FERMENTACION LIQUIDA.

FERMENTACION BATCH

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I . .

3 . 4 . -

OBJETIVOS MATERIAL, METOOOS Y TECNICA DE FERMENTACION 4.1. METODO DE ESPORULAC ION METODO DE SUSPENSION DE ESPORAS METODO DE BIOENSAYO PARA PRODUCCION DE PENICILINA PREPARACION DE CURVA ESTANDAR MEDIO DE CRECIMIENTO DE LA CEPA SARCINA LUTEA (NRRLB INOCULACION DE LA CEPA CRECIMIENTO DE SARCINA DEL BIOENSAYO METODO DE LA CURVA ESTANDAR DEL BIOENSAYO METODO DE PREPARACION DE BUFFER DE FOSFATOS OETERMINACION DE LA CURVA ESTANDAR BIOENSAYO
I

L .

...
c.

4.2. 4.3.

--

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4 . 3 . 1 . 4 . 3 . 2 . 4.3.3. 4 . 3 . 4 . 4 . 3 . 5 . 4 . 3 . 6 . 4.3.7. 4.4. 4.5.

1018)

--

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METODO DE DETERMINACION DE BIOMASA METODO DE CONSUMO DE AZUCARES REDUCTORES

I

c-

..

..

5 . 6.-

RESULTADOS OBTENIDOS O ACTIVIDADES DESARROLLADAS DISCUSION Y CONCLUSIONES LITERATURA CITADA

7.-

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b.

i . . .

:
I

PRODUCCION DE PENICILINA EN FRRMENTACION LIQUIDA.

L.

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C.

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L .

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111.

INTRODUCCION.
1 1 1 . 1 .

Desde el siglo pasado es conocida la existencia de compuestos de origen

microbiano, capaces de inhibir el crecimiento de otros microorganismos.

No fue sino hasta el aRo de 1929 en que Alexander Fleming descubri l a actividad

terapetica de l a penicilina producida por el hongo Penicillium notatum, cuando se -marc el inicio de una nueva era en la medicina clnica para el control de enfermedades infecciosas, y para l a industria de las fermentaciones por su produccin en gran escala. Al igual que otros metabolitos secundarios, la penicilina no presenta ninguna

--

funcin aparente en los microorganismos que l a producen. Posee propiedades bacterici das sobre grmenes GRAM positivo, aunque en cierto grado tambin acta sobre GRAM negativos. Dicha accin sobre estos microorganismos se deriva de su capacidad para blo quear la unin entre los aminocidos D-alanina y L-alanina del pptido glucano de l a pared celular, l o que provoca una estructura sensible a los cambios osmticos. Diversos microorganismos presentan una resistencia natural a la accin de l a penicilina; dicha resistencia resulta de la sntesis de beta-lactamasas, enzima que hidroliza el anillo beta-lactmico. ( 3 ). Hasta 1945 se determin l a estructura qumica de l a penicilina, demos-111.2. trando por estudios cristalogrficos, que esta compuesto de dos anillos, uno tiazolidnico y otro beta-lactmico, que constituyen un ncleo central denominado cido o

--

amino-penicilnico (6-APA). Posteriormente, en el mismo aiio Abraham en Inglaterra y Adriaens en Blgica, esclarecieron l a secuencia de sntesis de penicilina en Penici-Ilium chrysogenum y demostraron que l a condensacin de L-cistena y D-valina da lugar a los anillos mencionados. ( 11 ): ac. fenilactico

L-ci stena

L-valina

-.

Estructura de l a Penicilina (penicilina G )

Ac. 6 amino-penicilnico

(6-APA)

Biosntesis. La penicilina es sintetizada por hongos por medio del ci111.3. do alfa-amino-adpico, como intermediario en l a biosntesis de lisina, cisteina y vali na son condensados a el tripptido gama- al fa-aminoadipil) cisteinilvalina. Subsecuentemente, l a lactama y el anillo tiazolidina se cierran produciendo Isope nicilina N. ac. alfa-amino-adpico cistena valina

d-AAh- h\t\-C

- crl, - dU-C

5~
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CN-C%

,'U3
50

al fa-aminoadipil-cisteinil-valina

C-oN

Isopenicilina

MRRb

ATP
.

111.4.

Mecanismos de Regulacin. Regulacin pro la fuente de Carbono. La formacin de penicilina en

111.4.1.

el hongo Penicillium crysogenum es reprimida por l a glucosa. El porcentaje de re

presin depende de l a concentracin de este carbohidrato en el medio de cultivo. Anlogos no metabolizables de glucosa carecen de este efecto. Las bases moleculg res de dicho efecto an no se han establecido, pero se ha reportado que l a represin no es revertida por AMP cclico. ( ' I ). Otras fuentes de carbono como sacarosa, fructuosa y galactosa afectan negativamente l a formacin del antibitico en un grado similar al ejercido por glucosa. Polmeros de glucosa, tales como almidn, inhiben parcialmente la sntesis de metabol itos secundarios. ( 9 ). 111.4.2. Regulacin por l a fuente de Nitrgeno. La formacin del antibitico, la intervencidn de los aminocidos L-alfa-amino adpico, L-cistena y L-valina y por tanto su formacin como regulacin pueden influenciar en l a formacin de aminocidos precursores. Hace algunos aos, Hunter y Segel (1980) reportaron que el micelio de

P e n i c i

11ium crysogenum crecido en diferentes condiciones experimentales, acumulaba ele-

vadas concentraciones de L-glutamato. Y se observ que la poxa se incrementa al final de l a trotafase. ( i ). "La concentration de glutamato sobrepasa a l a del resto de aminocidos y su acumulacin procede l a sntesis de penicilina". ( i ). Recientemente se ha reportado que el glutamato estimula l a sntesis del antibitico en el micelio del hongo que ha sido cosechado durante l a Idiofase y resuspendido en un medio mnimo; y no provoca el incremento de aminocidos disponibles, tambin se uti1izaron algunos anlogos. Las bases bioqumicas de esta accin han sido establecidas al demostrar que el glutamato induce l a (L-alfa-aminoadipil) L-cisteina sintetasa, primera enzima de l a va que sintetiza l a penicilina. El incremento de l a concentracin intracelular del glutamato, al final del crecimiento logartmico de P. crysogenum, induce l a sintesis de penicilina e in-crementa l a poza de glutamina en la Idiofase, a la que a su vez podra donar los grupos alfa-amino de los aminocidos precursores de l a molcula de penicilina y
de esta forma iniciar su sntesis.

( 2 ). Otra fuente de nitrgeno como el Amonio, tambin influye en la formacin de penicilina. Dicho in afecta negativamente la formacin del metabolito secundario Y su accin es proporcional a la concentracin que guarda en el medio de cultivo. La penicilina se produce en condiciones de fermentacin sumergida, en medio de --

cultivo generalmente compuesto por sales minerales, un precursos de la cadena lateral -cido fenilactico - , una fuente de nitrgeno (licor de maz, el cual es timula la formacin del antibitico) y en presencia de concentraciones limitantes de glucosa, a valores de pH que oscilan entre 5.5 y 6.0. Bajo estas condiciones, Penicillium crysogenum puede producir cantidad de antibiticos que pueden variar desde 2 unidades/mililitro hasta ms de 50,000 dependiendo de la cepa que se utilice. ( 2 ).
I I I . 5.

I
I

Fermentacin Lquida.

111.5. Fermentacin Lquida. Fermentacin Batch. En los primeros inicios de produccin de penicilina en fermentacin batch, se le reconoce a Coghill (1944) durante la tapa de la Segunda Guerra Mundial. En 1954, en la historia de la pro duccin de penicilina es reconocida por Silvester y Coghill. La primera obtencin de penicilina (Perlman, 1974) fue del orden de 2 unida des por mililitro. E l proceso sumergido de un medio con lactosa y licor de maz fue desarrolla do por Silvester y Coghill, (1954), Hockenhull, (1959), (1963); Perlman, (1970). La lactosa fue agregada para la produccin de penicilina como fuente de carbono improvizado (Moyer y Coghill, 1946) la lactosa es un carbohidrato hidrolizado enzimaticamente. ( 3 ). Si existe una acumulacin de la hexosa provista en la hidrlisis enzimtica (Matelova, 1976) el cual puede causar una inhibicin en la sntesis de penicilina. En los trabajos realizados destac mucho el cido fenilactico como precursor para la produccin de penicilina (Smith y Bide, 1948; y Mead y Stack, 1948) resultante en la sntesis natural de penicilina G . ( 3 ). Cuando el cido fenilactico o un derivado, es aadido en un medio (0.2-0. 8 kg. por metro cbico), dependiente del pH, la produccin de penicilina G se incrementa grandemente y en otras penicilinas decrecen (Moyer y Coghill, 1947). Despus se propuso que el carbono del licor de maz y la glucosa son metal izados rpidamente, desarrol landose el mice1 i o ocurre la fermentacin, comenzando a utilizar la lactosa (Silvester y Coghill, 1954). Los compuestos de nitrgeno en el licor de maz son desaminados y el amoniaco es formado. Parte de la Penicilina G, hoy en da, es usada en el rea farmacetica, pero el flujo de trabajo de la producci6n de penicilina G es para la conservacin de otros antibiticos beta-lactama. ( 8 ).

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V.

OBJETIVOS

1.-

Bsqueda, evaluacin y seleccin de un medio de cultivo para l a produccin ,de penicilina.

I !

2 . 3 . -

Bsqueda, evaluacin y seleccin de una cepa de Penicillium crysogenum. Bsqueda, evaluacin y seleccin de un mtodo de conservacin y manejo de cepa.

MATERIAL Y METODOS Y TECNICAS O ACTIVIDADES A DESARROLLAR.

Para el mtodo de Esporulacibn:

Ma ter i al
3 tubos de ensaye 1 probeta 1 asa e s t r i l 1 o l l a express 3 matraces Erlenmeyer

Reacti vos Papa Dextrosa Agar (PDA) Agua destilada

Incubadora a 29" C.

Mtodo Preparar 3 tubos de ensaye con 15 ml de Papa Dextrosa Agar (PDA) cada tubo, taponarlo con tapn gasa-algodn. E s t e r i l i z a r a 15 lbs de presin durante 15 min. Dejar e n f r i a r a temperatura ambiente en posicin inclinada y s o l i d i f i c a r , procu-rando que el PDA quede inclinado sin tocar el tapn. Inocular con Penicillium chrysogenum de l a cepa original en condiciones e s t r i l e s ( s i s e tienen 1 o 2 tubos inoculados de p. chrysogenum del cepario solo s e trabaj a r con un solo tubo). Se inoculan l o s tubos con PDA inclinados y solidificados con una asa e s t r i l en una rea de trabajo perfectamente fenolizada. Incubar a 29C durante 5 o 6 das. Antes de sacar l o s tubos de l a incubadora, se preparan 3 matraces erlenmeyer de 250 m l con 30 m l de PDA cada matraz. E s t e r i l i z a r a 15 l b s de presin por 15 min. Dejar e n f r i a r y s o l i d i f i c a r . m del tubo inclinado-incubado con una asa estril a los Inocular con P. chrvsoqenu matraces ya preparados con 30 m l de PDA. Incubar de 5 a 6 das a una temperatura de 28C (hasta obtener un buen crecimient o de esporas).

Mtodo de suspensin de Esporas. Material

vos Reacti
Tween 20 Agua destilada

10 cuerpos .de ebullicin o una

barra magntica
1 pipeta de 1 m l e s t r i l 1 pipeta de 10 m l

2 matraces E r l enmeyer

1 pipeta Pasteur

1 probeta de 10 m l 1microscpio 1cmara de Newbawer

,%todo E s t e r i l i z a r 2 matraces Erlenmeyer de 250 m l que contenga cada matraz, 50 m l de
I

--

agua destilada, 10 cuerpos de ebullicin o mosca magntica, 3 gotas de Tween 20 a

Dejar enfriar los matraces y pasar e l contenido de uno de ellos a l matraz que con Agitar para desprender l a s esporas (manual en el caso de los cuerpos de ebullicin tiene l a s esporas crecidas en PDA (Mtodo I ) .

15 l b s de presin durante 15 min.

el matraz que contena e l agua-tween vaco.

o en una p a r r i l l a en e l caso de l a mosca magntica) s i n romper e l PDA, quedando

Pasar a l matraz vaco el agua suspendida con esporas.

50 m l agua-tween-barra magntica del o t r o matraz.

Se repite l a misma operacin con e l o t r o matraz de esporas crecidas en PDA con l o s

Los 2 matraces con l a suspensin de esporas-agua se mezclan homogeneamente obte-niendo as 100 m l de suspensin de esporas. previamente e s t r i l y se pasa a l a probeta de 10 m l aforando as a un volumen de 10 m l con agua destilada (dilucin Tomamos una alcuota de 1m l de esta suspensin de esporas con l a pipeta de 1m l

1:lO)

Agitar perfectamente esta dilucin.

Tomar de esta solucin una pequea cantidad con una pipeta Pasteur y l l e n a r l a
Cmara de New-bawer.

--

4 a 5 veces para tener una lectura ms confiable.

visiones de cada cuadro y sacar el promedio, r e a l i z a r esta operacin por l o menos

Cuantificar e l nmero de esporas que hay en l o s 2 cuadros de l a cmara l e e r 5 d i -

Para la cuantificacin de esporas, aplicar la siguiente f6rmula:

r

Promedio de los 5 cuadros X 25 X dilucin X 1 X lo4

# de esporas en

la susp/ml
?"

Sacar una regla de 3 para saber cuanto debemos agregar para que el inoculo lleve i x io6 esporas.
Asi determinaremos cuantos ml llevaremos para inocular el medio de crecimiento.

..
,

Mtodo. Bioensayo para Produccin de Penicilina. (3) Curva Estandar. Material 10 cajas Petri 2 matraces Erlenmeyer 15 tubos de ensaye con tapn gasa-al godn, estril es 5 pipetas estriles de 5 ml 5 pipetas estriles de 1 ml 5 pipetas estriles de 10 ml 1 microjeringa 25 discos de papel para bioensayo de 12.2 mn de dimetro (estriles) Schleider & Schull. 1 pinza de diseccin estril 1 balanza analtica 10 matraces aforados de 5 y 10 ml 1 olla express y mecheros 1 probeta de 30 ml Reactivos Medio de Caldo Nutritivo Penicilina G Sdica (Likeside) (1 Agar Nutritivo Fenol al 20% Solucin buffer de fosfatos Cepa: Sarcina ltea NRRLB 1018

l O ' U / m l )

Mtodo Medio de Crecimiento de la Cepa Sarcina ltea (NRRLB 1018): Disolver 239 de agar nutritivo en 1000 ml de agua destilada -- preparar solamente 30 ml del medio. Disolverlo muy bien, si es necesario calentar brevemente por espacio de 1 min., y vaciar un volumen de 10 m l a cada tubo de ensaye (3) previamente etiquetados y tg parlo con tapn gasa-algodon. Esterilizar 15 lbs de presin por 15 min. en la olla express. Sacar y dejar solidificar en posicin inclinada.

Inoculacin: Sembrar los medios. Fenolizar el rea de trabajo y prender 2 mecheros para empezar a inocular. ltea a los tubos inclinados en espiral o es-Con el asa estril sembrar Sarcina tra. Tapar con .su tapn (algodn-gasa) y etiquetarlos. Incubar a 37C durante 3-5 das (color amarillento). Medio Caldo Nutritivo: Crecimiento de Sarcina lYtea para Bioensayo. Preparar 30 ml de caldo nutritivo en un matraz erlenmeyer de 250 ml. Tapar con tapn (algodn-gasa) y un gorrito de papel. Esterilizar a 15 lbs de presin - 15 min. ltea con Dejar enfriar a temperatura ambiente e inocular con un tubo de Sarcina una asa estril (la sarcina del paso anterior). Incubar a 37C en agitacin de 200 rpm. Mtodo de la Curva Estandar del Bioensayo. Curva Estandar. Pesar el contenido de un frasco de 106U/ml de Penicilina G Sdica, hacer la relacin siguiente: Si todo el frasco pesa 0.61979 y contiene 106U/ml; pesar 0.15499 que contendrn 250,00OU/ml. Los 0.15499 se disuelven en lOOml de buffer de fosfatos y se tiene una concentracin de 2500 U/ml . A 1 ml de esta solucin llevarlo a 5 ml de buffer de fosfatos (dilucin 1:5) para obtener la Solucin Madre con concentracin de 500U/ml. Realizar la siguiente dilucin: los microlitos de la solucin madre adicionarlos en los matraces aforados de 10 ml con una microjeringa y aforar a 10 ml con solucin buffer de fosfatos: CIVl
=

c2v2

Si C1

500U/ml
=

V1 = 10 ml X lU/ml 500U/ml

20 microlitros + 1 U/ml

Mtodo de Preparacin del Buffer de fosfatos. 0.2 M sol. de fosfato de sodio monobdsico. 31.29 NaH2P04.2H20 en 1000 ml P.M. 137.99 disolver 27.59 en 1000 ml tetrahidratado. Preparar 200 ml.

..
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-r-

0.2 ml sol. de fosfato de sodio dibsico. 28.399 NaHP04 71.699 NaHP04.12 H20 en 1000 nil P.M. 358.15 disolver 71.699 en 1000 dodecahidrato. Preparar ZOO ml.
\Y.

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Mezclar las 2 soluciones con agitacin a 25C. Ajustar el pH a 6.9

Determinaci6n de la Curva Estandar Para realizar la curva estandar: Se preparan las siguientes diluciones de la solucin madre con buffer de fosfatos:

U/ml
1
2

4 6
8 10

micro1 i tros de la solucin madre 20 40 8 0 120 1 6 0 200

Volumen del buffer para el aforo (mi) 9.98 9.96 9.92 9.88 9.84 9.80
l

es decir, de 1 U/ml son 20 microlitros de soluci6n madre aforados a lOml de buffer de fosfatos. Se agitaran muy bien estas soluciones y de cada una de ellas se tomarn siempre 20 microlitros. 0 ml. -Una vez hechas las diluciones, esterilizar 10 cajas Petri, pipetas de 1 y 1 los discos de papel filtro, probeta de 30 ml (o 50 mi), las pinzas, a 15 lbs de prg sin por 15 min. Preparar 75 ml de agar nutritivo, calentar durante 1 min. y agregarlos en tubos de ensaye, cada uno con 15 ml de agar, (se pueden medir l o s 15 ml con la pipeta de -1 0 ml o con la probeta de 30 ml. Tapar con tapones gasa-algodn. Esterilizar 15 lbs de presin por 15 min.

Una vez esterilizado todo el material y fenolizado el rea de trabajo empezaremos el bioensayo:

Bioensayo El agar nutritivo contenido en los tubos de ensaye (cada tubo con 15 mi) a una tempe I ratura de 38-40C se agregan a las cajas Petri. Cada caja Petri con 15 ml de agar nutritivo se inocular con 0.5 ml de la Sarcina -del paso . Agitar homogneamente este medio agar-sarcina y dejar solidificar todas las cajas -Petri. Una vez solidificadas las cajas se colocaran 2 discos de papel filtro con unas pinzas de diseccin estriles a una distancia adecuada. Rotular cada una de las cajas por concentraciones de 0,1,2,4,6.8 y 10 U/ml. con su duplicado. Se inyectar a cada disco con 20 microlitros con una microjeringa de las diferentes concentraciones, con su duplicado. Dejar que los discos absorban todo el antibitico. Refrigerar las cajas en posicin normal durante 1 hora. Sacar las cajas refrigeradas e incubarlas durante 24 horas a 35-37OC. Despus de 24 hrs. medir el halo de inhibition, 3 veces cada halo. Graficar dimetro vs. logaritmo de la concentracin. Mtodo de Determinacin de Biomasa. Para determinar la biomasa en la produccin de penicilina se llevaron los siguientes pasos : 1 ) Se pone a peso Cte. papel filtro watman. Tomando el peso del papel. 2) Se filtra la biomasa en un embudo con una trampa de vaco. 3) El filtrado, lquido de color amarillo intenso, de olor caracterstico a penicilina (humedad) se guarda en un vaso de precipitado o frasco pequeo para anlisis de cuantificacin de penicilina (Bioensayo), pH y determinacin de azcares re-ductores. 4) La biomasa recuperada en el papel filtro se coloca en una estufa a 60C durante 2 4 hrs. 5) Sin humedad la biomasa, se pesa y se determina la cantidad de biomasa: w Peso del papel c/muestra - Peso del papel s/muestra = Biomasa 6) Se hace la grfica de Biomasa vs. tiempo y se discute.
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DE D F T F R UACION DE AZUCARES REDUCTORES.

Mtodo del uso del reactivo del cido d i n i t r o s a l i c l i c o para l a determinacin de Azcares Reductores ( 9 ). Reactivo:
1% cido dinitrogal i c l ico. 0.2% fenol. 0.05% s u l f i t o de sofio. 1.0% hidrxido de sodio.

Mtodo modificado por e l departamento de Biotecnologa

UAM-I.

D e l a muestra de produccin de penicilina (lquido amarillo) se ma una alcuota de 1.0 m l y s e lleva a un tubo de ensaye, se agrega 1.0 m l del reactivo, se tapa y s e a g i t a en vortex. Se l l e v a a bao Mara a ebullicin durante 5 m i n . , (cambia de c o l o r de anaranjado a caf-naranja). Se saca del bao y se pone en bao de hielo. Se agrega 8.0 m l de agua destilada y se agita. Se l e e al espectrofotocolormetro a una longitud de onda de 575 nm. De l a misma forma se r e a l i z a una curva estandar con glucosa.

. . .
r

DESARROLLAR UNA FERMENTACION LIQUIDA PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA P. chrysogemim Realizando l a tcnica para el mtodo de esporulaci6n con la cepa NRRL 1951

--

Biomdicas, as como el mtodo de la suspensi6n de esporas obtenemos l a

siguien te cuantificaci6n de esporas :

3 b t 65+"1t32+\%= iV7/5- 39.7

*..

.
.

..

..
.
.

-.

El medio de crecimiento se inocular con 0.5076

ml de suspensin de esporas.

Se preparar solamente 200 ml del medio de crecimiento Medio de crecimiento

..

G1ucosa Sacarosa (NH4)2SOq KH2P04 Caco3 ZnS04 CUSO$

M W 4

20.0 gr/lt. 6.84

15.0
"
'I

.
L-.

9.088
3 . 0

"

El pH del medio de crecimiento

-..
-.,_

debe ajustarse a 5 . 0
" " "

0.02
O. 005 0.02

..~.
L . .

Repartir el medio de crecimiento a matraces de 250 ml, cada uno con 50 ml. Esterilizar a 15 libras de presin, 15 min. Enfriar a temperatura ambiente. En condiciones estriles se inocular cada matraz con 0.5076
ml de l a suspensin de

...

..
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esporas.

*-.

lie,en agitacin a 250 rpm. Elegir los medios que tenga mejor crecimiento, mezclarlos en condiciones estriles para el inoculo al medio de produccin.

Incubar cada matraz a 26O.C durante 60-66hrs. para tener un buen crecimiento de mice -

....

..
-..
r.

Medio de Produccin

Licor de maz Lactosa

G1ucosa .

30.0 gr/lt. 30.0 5 . 0 3 . 0

1.87
3 . 0
I'

" "

Caco3 Manteca NaN03 Zn SO4

" "

El pH del medio de produccin debe ajustarse a 7 . 0

O. 044

"

Mg so4
Feni1acetamida (precursor)

0.250 0.05

" "

Preparar 600 ml del medio. Distribuir el medio de produccin a matraces de 250 ml, cada matraz con 50 ml. Tapar con tapn algodn-gasa. Esterilizar 15 libras de presin durante 15 min. Enfriar a temperatura ambiente. Etiquetar cada matraz con los tiempos a determinar. En condiciones estriles inocular cada matraz con 10 ml. del medio de crecimiento ya seleccionados y mezclados. (mice1io). Nota: Se depe preparar el medio de produccin antes de las 66 hrs. de crecimiento de micelio, cumplidas las 66 hrs., inocular el medio de produccibn. Incubar a 2 6 C con agitacin de 250 rpm durante los tiempos a determinar, tomando tiempos cada 24 hrs. de azucares reductores.

I
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Determinar anlisis de pH, produccin de biomasa. produccin de penicilina y consumo

F E RMENTACION

TlPlCA
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Ir

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T\emp o

hwa5).
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Anali sis de Resultados.

PH El medio de produccin desde su inicio tuvo un comportamiento bueno en relacin

al pH del medio, no excediendo el rango de l a fermentacin (5.0 determina una buena produccin.

8.0) por l o que

I
Biomasa. La produccin de biomasa aumenta cada 24 hrs. teniendo una alta produccin de biomc

I
t

sa a las 72 hrs., posteriormente se observa una lisis de l a biomasa.

.,,

-_..
r . .

Prod. de Penicilina. Se obtuvo una prod. de penicilina mxima a las 48 hrs. y 72 hrs. observndose una de azucares.

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recada a las 96 y 120 hrs., esto se ve reflejado en l a prod. de biomasa y consumo

-..
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Consumo de Azucares Reductores. Se consume poco a poco los azucares, observndose un descenso hasta las 96 hrs., con sumindose totalmente a las 120 hrs. Dado a que se esperaba este comportamiento de l a cepa

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chrysogenum NRRL 1951

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Biomdicas, se realizaron otras fermentaciones liquidas, que nos llevaran a una coz paracin de produccin de penicilina con otros medios y con otras fuentes de carbono.

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COMPARACION DE MEDIOS DE PRODUCCION SELECCIONADOS Y ELECCION DEL M A S CONVENIENTE DE ACUERDO A

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SUS CARACTERISTICAS PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA

Medios que se desean investigar: Esporulacibn, Crecimiento y Produccibn. Medios de Esporulacibn: Este medio puede ser el de Papa-Dextrosa meyer de 2501111. Medio de Produccin:

- Agar.

Preparar 30 ml en un matraz Erlen-

1.

Casida; L.E.

Jackson

1958.

Sdlidos de Licor Lactosa G1ucosa Caco3

% 3.5 a 4
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1 . 0
1 . 0

KH2p04 Aceite Precursor de Penicilina

% 0 . 4
0.25

----

Con alta aereacibn y buenas condiciones de agitacibn se puede aumentar l a cantidad de lactosa hasta 4 a 5%.
2.

pH

5 . 5

y 6 . 0
1954.

Casida; L.E. gr/lt.

Coghill

gr/lt.
MgS04 ZnS04 Caco3 Feni1acetamida (precursor) 0 . 2 5 O. 044
3.Q

Slidos Licor de maz Lactosa G1ucosa NaN03

30.0 30.O 5 . 0 3 . 0

3.05

La lactosa se degrada muy lentamente produciendo glucosa + galactosa; favorece l a produccin de penicilina.
3.

Sin bibliografa

Traders Guide.

gr.
Caldo de maz Farmamedia KH2P04 MgS04.7 H20 16.0
8 . 0

Lactosa Caco3 (NH4)2S04.7 H20) Aceite de soya

gr. 16.0
4 . 0

2 . 4
O. 16

4 . 0
1 . 6

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3. Hockknhull Medio C.S.L. Lactosa Glucosa Al mi d6n A. Actico A.Lctico Feni 1 eti lamina Aminocidos
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Medio Sinttico

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(PO4) a 7.0.

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pH alto en presencia de Zn O Cu, la penicilina se hidroliza a cido peniciloico. Agitacin de 200-250 rpm. Medio de Crecimiento.

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Pueden ser los mismos medios que para produccin con la diferencia de NO adicionar lactosa como fuente de Carbono sino glucosa; los precursores slo se adicionarn al medio de produccin y NO al de crecimiento. Para realizar la fermentacin lquida de comparacin de medios de produccin llevamos a cabo el mtodo de Esporulacin y el mtodo de suspensin de esporas. Tomamos una alcuota de la suspensin ( 1 mi) con una pipeta de 1 ml estril y se pasa a la probeta de 10 ml, despus se afora a un volumen de 10 ml con agua destilada, se agJ ta y tomamos una pequea cantidad para llenar la cmara de New-bawer y cuantifica-mos : 3 b t % t W + i > + b O = ZO3/5: i 0 . G

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e wedto)

Ya realizada la cuantificacin se prepara el medio de crecimiento (400 ml), se este -

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r i l i z a a 15 l i b r a s de p r e s i n durante 15 min., se e n f r i a a temperatura ambiente. En condiciones e s t r i l e s se i n o c u l a cada matraz con 0.4926 m l . de l a suspensin de esporas, se incuba durante 60-66 hrs. a 26C 250 rpm. Se e l i g e l o s medios con mayor c r e c i m i e n t o de m i c e l i o , se mezclan y se toma una a l i cuota de 10 nil para cada matraz como i n c u l o a l medio de produccin. (Preparado anteriormente antes de l a s 60-66 hrs.). Etiquetados. Ya inoculado cada matraz se procede a incubar a 26"C, 250 rpm. Se toma un matraz de cada medio de produccin cada 24 h r s . para r e a l i z a r a n l i s i s de pH, prod. de biornasa, prod. de p e n i c i l i n a y consumo de azucares.

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COMPARACION DEL MEDIO DE PRODUCCION SELECCIONADOS Y ELECCION DEL

M A S

CONVENIENTE.

De acuerdo a la actividad desarrollada de comparar el medio de produccin seleccig nados (Hochenhull, Jackson, Coghill y un medio Modificado), se llego a los siguien t e s cuadros de resultados:

Hockenholl

Jackson

Coghill

Modificado

MEDIO DE PRODUCCION HOCKENHULL

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MEDIO DE PRODUCCION JACKSON

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Discusi6n de Resultados. Analizando los resultados, se compar cada uno de los parmetros de cada medio: pH. El pH en. los 4 medios se mantuvo entre 5 y 8, sin embargo, el comportamiento de este vara de medio a medio; Jackson se mantuvo a un pH de 6 no ideal para la -produccin de penicilina; Coghill se mantiene a 5, sube hasta 6 . 8 a las 48 hrs., desciende a las 72 hrs., para

--

llegar hasta 8 a las 96 hrs., este comportamiento en

esta ltima tapa tambin lleva consigo destruccin de biomasa y alta produccin de penicilina; Hockenholl al igual que Jackson mantiene el pH entre 5 y 6 el cual es muy bajo y puede ser la causa de l a nula produccin de penicilina. Azucares. En 3 de los medios el azcar se consume casi totalmente a las 48 hrs.,

como son Jackson, Coghill y el medio Modificado. En Hockenholl l a asimilacin fue

ms lenta se agot a las 72 hrs., este medio tiene poco licor de maz y mucha lacto sa, sobre todo comparando Coghill con Modificado, se podr decir que probablemente el licor de maz contribuya con azucares de fcil asimilacin, pues en el medio doc de no hay glucosa tambin se nota su consumo a las 48 hrs. interpolando pendientes. Biomasa. Por ser l a penicilina un metabolito secundario, l a bilmasa deber permang En Hockenholl y Jackson la biomasa se incremento hasta las 72 hrs.

cer constante.

hasta casi duplicarse y triplicarse respectivamente en los 2 medios, debe notarse el medio estaba todava en crecimiento. En el medio Modificado el micelio creci

que en los 2 medios hasta las 72 hrs. no hay produccin de penicilina, posiblemente hasta las 24 hrs. y despus se mantuvo ms o menos constante. Penicilina. Hockenholl no proudce penicilina, observandose que el micelio sigue creciendo, por lo que no hay penicilina activa.

--

En Jackson no hay produccin hasta las 72 hrs., pero es mnima y aparentemente hay destruccin de biomasa y empieza la

produccin de penicilina, muy poco %. En Coghill fue el medio que produce ms cantidad de penicilina, en este medio l a produccin de penicilina empez a las 24 hrs.

y sigui aumentando hasta las 96 hrs. en donde se alcanz 7 U/ml.

El medio que se eligi para l a produccin que por contener los nutrientes mnimos necesarios y el ser un medio sencillo fue el medio de Coghill (Coghill 1954). La cepa utilizada en este mtodo de produccin de penicilina fue: Penicillium crhysogenum NRRL 1951

- Biomdicas.

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Al real izarse fermentaciones para observar el medio de produccin seleccionado, se

desarrollaron fermentaciones para ver el efecto de sustituir en el medio de produg cin la fuente de carbono (lactosa) por almidn, con la cepa Penicillium chrysogenum NRRL- 1951-Biomdi cas. Llevando a cabo la fermentacin 14quida, se realiz el mtodo de Esporulacin y Suspensin de esporas, obtenindose la siguiente cuantificacin: 99,000,000 nmero de esporas / mililitro en una cuantificacin y en otra 1.89 X lo8 nmero de esporas / mililitro. De 99 X lo6 nmero de esporas / mililitro se tiene 0.5050 ml de inculo, De 1.89 X lo8 nmero de esporas / mililitro se tiene 0.2645 ml de inculo. La sumatoria de ambos inculos es de 0.3849 ml, aprox. 0.40 ml. Se prepara el mtodo de produccin de penicilina: E l medio de crecimiento (medio semilla) es el mismo medio de fermentacines anteriores preparandose 300 ml del -medio, se inocula y se lleva a cabo el mismo proceso durante la fermentacin, la nica variante es que existen dos medios de produccin: medio de produccin Coghill que tiene como fuente de carbono-LACTOSA- y el medio de produccin con la fuente de carbono-ALMIDON-, se prepara 600 ml de cada medio, cada matraz con 50 ml. La manteca se pone la cantidad necesaria a cada matraz despus de haberse ajustado el pH a 7 . 0 . , se esteriliza, se inocula e incuba a 26C a 250 rpm.

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Medio

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Discusin de Resultados. PH En la determinacin de pH se observ un comportamiento poco similar en el medio de almidn observando un pico a las 72 hrs., en cambio el comportamiento del medio Coghill fue gradual. Bi oma sa. En la determinacin de biomasa en el medio de lactosa se observa ms cantidad de bio masa lo que provoca un reflejo en la produccin de penicilina, en comparacin con el medio de almidn se observa el mismo comportamiento pero a diferente escala. Produccin de Penicilina. La produccin de penicilina en el medio de almidn es irregular observandose un pico a las 24 hrs. y un descenso a las 48 hrs., de nuevo otra alta y posteriormente una 1 isis total. El medio de lactosa tiene un mejor desarrollo y produccin de penicilina consumiendo as gradualmente los azucares del medio. Esa alta y baja que presenta el medio de almidn es debido tambin a que consume ms rpidamente l o s azucares del medio. Se observa la influencia de la fuente de carbono en el medio de produccin,ya que el almidn debe romperse para que el micelio pueda asimilar el carbohidrato necesario para la produccin de penicilina; en cambio el medio de Coghill que contiene como -fuente de carbono la lactosa se degrada lentamente produciendo glucosa y galactosa favoreciendo as la produccin de penicilina. Otra observacin es que el medio de lactosa produce una coloracin amarillo fuerte y un olor caracterstico a penicilina en el medio, en cambio el medio de almidn pre senta una coloracin amarillo-caf y sin olor, esto es en el transcurso de la fermen tacin.

Efecto de sustituir la fuente de carbono

HARINA DE YUCA

-.
New-Brunswick

- LACTOSA -

en el medio de produccidn por

Se realizaron 2 fermentaciones con diferente equipo de Agitacin:

- Agitador
-

(OEA).

Agitador Cajn de Madera improvisado con agitacin y regulador de temperatura.

Dichas fermentaciones se realizaron con l a cepa Penicillium chrysogenum NRRL-1951Biomdicas. La harina de yuca fue tamizada a malla 20. Fermentacin con el agitador New-Brunswick Se lleva a cabo el mtodo de produccin de penicilina en fermentacin lquida: Meto do de Esporulacin y Suspensin de Esporas con la siguiente cuantificacin: 1.42 X 108 nmero de esporas / milimetro. esto es 0.3521 ml para inocular. Se procede a preparar el medio de crecimiento y el medio de produccin (se preparan dos medios de produccin uno con lactosa (350 ml de medio) y el medio con harina de yuca (350 ml de medio)), a cada matraz con 50 ml de medio se el agrega l a cantidad de manteca que l e corresponde. (0.6545g/350ml de medio). Se procede al tratamiento ya efectuado en fermentaciones anteriores, incubando a 2 6 C con agitacin de 250 rpm. Se determina pH, biomasa, consumo de azucares reductores y produccin de penicilina.

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Medio

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Discusin de Resultados. Pardmetro de pH. El pH inicial en ambos medios fue de 6.0. El rango de pH del medio de lactosa fue de 6.0 a 7.4. El medio con harina de yuca tuvo una baja a las 72 hrs. ; al presentarse altas y bajas de pH refleja un comportamiento desfavorable para la produccin de penicilina. Produccidn de Biomasa. El micelio inoculado al medio de produccidn es el mismo en ambos medios, pero se oh tuvo incremento de biomasa a las O hrs. en el medio de harina de yuca por la cantidad de esta en el medio. La biomasa presentada en el medio de lactosa va aumentando gradualmente dando la -curva de Monod. El medio de harina de yuca presenta un pico a las 72 hrs. y posteriormente una lisis. La biomasa tenia un aspecto de algodoncillo -lquido de color caf obscuro. El fil trado para realizar el mtodo de bioensayo era de color caf durante toda la fermen tacidn en comparacidn con el medio de lactosa "Coghill" de color amarillo y de olor caracterstico a penicilina. Produccin de Penicilina. La produccidn de penicilina fue muy comparativa en esta fermentacidn ya que se ob-serv que el medio de lactosa lleva siempre el mismo efecto con la cepa Penicillium chrysogenum, en cambio el medio que contiene harina de yuca como fuente de carbono fue muy lenta la degradacidn de la harina para el micelio observandose un pico a -las 72 hrs. lo que se ve reflejado en el consumo de azucares. Esta fermentaci6n fue satisfactoria al hacer la comparacin del efecto de sustituir la fuente de carbono por harinas u/o carbohidratos.

Realizando otra fermentacin lquida con la misma suspensin de esporas (con 2 semanas en el refrigerador) en un equipo de cajn de madera, con el objeto de ver el efecto del cambio de la lactosa por otra fuente de carbono -harina de yuca- como tambin el efecto del cambio de equipo. Se prepara el medio de crecimiento inoculado con 0.3521 ml de suspension de esporas dejando incubar, y llevar a cabo el mtodo de la fermentacin lquida. En esta fermentacin se tomarn l o s tiempos de muestra cada 24 hrs. tomando duplicados los tiempos de t = 24, 48, 72, 96 hrs. para el medio de harina de yuca, y el medio de lactosa solo se tomarn los tiempos t = O. 48, 72 y 96 hrs. Se lleva paso a paso el mtodo ya mencionado anteriormente, y se determinan los -siguientes parmetros: pH, produccin de biomasa, consumo de azucares reductores y produccin de penicilina.

Medio

de

Produccin

LACTOSA n

Agitador

de

modera.

Medio

de

Produccin

uYUCA

A q i t o d o r de

madero.

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Discusidn y Resultados. Al comparar los resultados y las grficas con la fermentacidn anterior, la produccidn de penicilina del medio de lactosa fue favorable y se observd: que el pH de esta fermentacidn es semejante a la anterior fermentacin, en cambio el medio de ha rina de yuca se mantuvo en un rango de 5 a 8, influyendo en su produccidn.

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La biomasa en ambos medios fue buena hasta las 72 hrs., esto es reflejado en la prg duccidn de penicilina teniendo un pico a las 72 hrs. y posteriormente una lisis total. El consumo de azcar es rpido de O a 48 hrs. y se agota gradualmente en ambos me-dios. Esto demuestra que el medio que contiene lactosa es el que produce ms cantidad de penicilina que otros medios que contienen otras fuentes de carbono.
Es ms rpida la degradacidn de la lactosa en glucosa y galactosa y posterjormente

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su asimilacin, que otros carbohidratos o harinas.

Ambas fermentaciones fueron comparativas y demostraron que los equipos uti1 izados (con agitacin y temperatura controlada) tienen que ver s610 en el crecimiento de biomasa, es decir, forma algodoncillos y pelex de tamaiio mediano (biomasa aglomerada en forma circular) esto fue en el aparato de madera y en cambio el aparato NewBrunswick la biomasa tiene la forma adecuada y el aspecto esperado.

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COMPARACION DE LAS CEPAS UTILIZADAS EN LAS FERMENTACIONES SOLIDAS Y ELECCION DE LAS

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M A S CONVENIENTES PARA LA PRODUCCION DE PENICILINA.

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Se realiza una cintica de crecimiento de las cepas:

Penicillium chrysogenum

Wisconsin-Biomdicas W-54-1255

Penicillium chrysogenum Wisconsin- USA 9-176. Se esporula.

El mtodo es el mismo para el medio de crecimiento.

Se prepara una Suspensin de Esporas de l a s 2 cepas obteniendo las siguientes cuantificaciones de esporas: Para Penicillium chrysogenum Wisconsin-Biomdicas W-54-1255: 6 5 X 10 esporas / ml que corresponden para 1 X IO6 a 10 ml. Para Penicillium chrysogenum Wisconsin-USA Q-176: 24,500,000 esporas / ml que corresponde para 1 X IO6 a 2.04 ml.

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Se prepara el medio de crecimiento (250 m l para cada cepa) y se ajusta el pH a 5 . 0

se esteriliza y se inocula e incuba a 25OC a 250 rpm.

Se toman dos matraces cada 24 hrs. y se observan al microscpio. Se determina el parmetro de pH y biomasa.

Cintica de

Crecimiento

P. c h r y r o g e n u m

W.sconsin - U S A

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FERMENTACION LIQUIDA DE LAS CEPAS J . CHRYSOGENUM WISCONSIN BIOMEDICAS Y USA.

Se realiza una fermentacin 14quida para l a produccin de penicilina con las cepas

Penicillium chrysogenum Wisconsin-Biomdicas W-54-1255 y Penicillium chrysogenum Wiscow in-USA Q-176. El equipo es con l a incubadora con agitacin de New-Brunswick. Se realiza la msima metodologa de las fermentaciones anteriores, se pone la cepa a esporular y se obtiene una suspensin de esporas para cada una:

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F? chrysogenum

Wisconsin-Biomdicas W-54-1255:

6 3 335 X 10 nmero de esporas / m l = 2.985 X 10 ml (50 mi) = 0.149 m l

P. chrysogenum Wisconsin-USA 9-176:

6 . 5 ml. 20 X 10 nmero de esporas / ml = 0.05 ml (50 mi) = 2 Se preparan los medios para l a fermentacin y se toma una muestra cada 24 hrs. de
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cada cepa; se realiza anlisis de pH, biomasa, azcares reductores y produccin de penicilina.

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F e r m e n t a c i n Lqu'ida

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Resultados. Determinacin de pH:
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El pH de las dos cepas se comportaron semejantes sin tener cambio hasta las 120 hrs.

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Concentracin de Biomasa: La biomasa de l a cepa Wisconsin-USA fue l a de mayor concentracin desde el inicio de la fermentacin, en cambio Wisconsin-Biomdicas tuvo poca concentracin y esto

..

da un reflejo en l a produccin de penicilina y en el consumo de azcares. Produccin de Penicilina: La produccin de penicilina en l a cepa de Wisconsin-USA present ms concentracin de penicilina que la cepa Wisconsin-Biomdicas, esto origina l a observacin de que, l a produccin de penicilina varia de cepa a cepa y esto mismo se ve reflejado en -

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el consumo de azucares.
Al realizar fermentaciones con estas cepas, se reflejo los mismos resultados pres-

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tados en esta fermentacin, por l o que se opto en hacer conservaciones de las cepas para realizar fermentaciones liquidas y tener bien dominada l a metodologa de las taciones futuras como las fermentacuones slidas.

fermentaciones y anlisis de cepas en l a fermentacin liquida para dar pie a fermeE

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Montaje de una fermentacin lquida para ver el efecto de tener l a suspensin de esporas en refrigeracin durante 0.1.2 y 3 semanas.

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Se llevo el siguiente esquema de trabajo:

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Se llevo a cabo la metodologa de la fermentacin lquida y se tuvo la cuantificacion de esporas;

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25,250,000

esporas / ml. = 0.0396 ml (50 ml medio)

1.980 ml para inculo.

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Se preparan los medios de crecimiento y produccin y se tomaron los siguientes tiempos: horas

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muestra s Se determin pH, produccin de biomasa, produccin de penicilina y consumo de azucares.

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F e r m e n t a c i o n L i q u i d a Wibconbin- U 5 A S e m a n a (O)
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Fermentaci6n Liquida Wirconrin-U S A

la Semana

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Fermentacin

Liquida

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Lquida

W - USA

Semana.

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Semana ( 2 )

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Discusin de Resultados.

La produccin de penicilina fue satisfactoriamente desarrollada teniendo justificacin el hecho de utilizar l a suspensin de esporas hasta una 3a. semana y al realizar una 4a. semana no hubo crecimiento de esporas ni de micelio.
El pardmetro de pH se mantiene en un rango de 5 a 6 . 0

hasta la 3a. semana.

En cada semana de fermentacin, l a biomasa tuvo un comportamiento semejante hasta

las 72 hrs., disminuyendo a l a 3a. semana.

El consumo de azucares fue el esperado y se refleja directamente en la produccin

de penicilina.
El hecho de utilizar l a suspensin de esporas hasta un determinado tiempo es bueno

desde el punto de vista experimental ya que se puede montar fermentaciones lquidas

y slidas con l a suspensin de esporas directamente o haciendo crecer el micelio en medio semilla.

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PRUEBAS DE METODOS DE CONSERVACION DE CEPAS EN TIERRA Y CONGELADO.

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Se presentaron dos mtodos de conservacin de cepas de Penicillium chrysogenum: cor^ servacin en tierra y conservacin en congelado. La cepa de P. chrysogenum Wisconsin-USA 4-176 ya que fue l a cepa seleccionada por los resultados de fermentaciones anteriores.

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--

Mtodo de Conservacin de Cepas en Tierra Estril.

Se selecciona y se prepara la tierra para l a conservacin de l a cepa, las caracte-rsticas de l a tierra seleccionada es Arcilla 70%, Limo 20% y Arena 10%. Mtodo: Se preparan tubos de ensaye con 6 g. de tierra, se tapan con tapn algodon-

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gasa, se esteriliza a 15 lbs-15 min, 6 veces. Se realiza pruebas de esterilidad en PDA, Agar nutritivo tomando un tubo tierra que contienen 2 ml de agua-estril (suspensin). Se incuba a 27-29OC durante 60 hrs.

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Resultados. No se present contaminacin ni crecimiento de ningn microorganismo.

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Inoculacin de la Cepa en l a Tierra Estril.

Se procede a tomar la cepa-original y hacer una suspensin de esporas (la suspensin

de esporas es l a misma para los dos mtodos de conservacin). Se inocula la tierra
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con una pequea cantidad ( 2 gotas).

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Mtodo de Conservacin de Cepas en Congelado.

De l a suspensin de esporas se toma una alcuota y se lleva a esporulas y hacer otra suspensin de esporas (mtodo ya mencioando) de esta suspensin se toma una alcuota de 2 . 5 ml y se pone en tubos de rosca congelacin a 2 0 C . En este mtodo se hace una esporulacin y posteriormente una suspensin, es decir un paso en crecimiento de l a cepa.
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(previamente esterilizados), se lleva a

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Ver l a siguiente figura. Ilica+<a51

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Fermentaci6n Liquida de la Cepa P. chrysogenum Wisconsin-USA conservada en tierra y congelado.

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Se realiza una tubo de tierra cin, teniendo 1.2658 ml para

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fermentacin lquida llevando a cabo los pasos ya mencionados, del -se lleva a esporular y suspender las esporas para montar la fermentauna cuantificacin de esporas de 39,500.00 nmero de esporas / ml. = inocular el medio de crecimiento.

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de la cepa conservada en congelado, se descongela a temperatura ambiente, de esta suspensin se lleva a esporular y real izar una suspensin de esporas, cuantificando: 34,000,000 nmero de esporas / ml igual a 1.470 ml. para inocular el medio de crecimien to.

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Se prepara la fermentacin a las mismas condiciones de temperatura (26OC) y agitacin (250 rpm). y se determina el pardmetro de pH, biomasa, produccin de penicilina y -consumo de azcares.

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F E R M E N TAC I O N C. TIERRA

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FERMENTACiON
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CONGELADO.

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RESUMEN. La inestabilidad de l a s cepas a l t a s productoras de metabol i t o s secundarios hace ne-

cesario u t i 1i z a r cuidadosos mtodos de preservacin y manejo.

E l objetivo de este proyecto fue evaluar mtodos de conservacin y manejo de l a cepa y seleccionar uno para l a produccin de penicilina en fermentacin lquida que serv i r como apoyo para l a produccin de penicilina en medio slido.

y Wisconsin 4-176,

Se compar l a producci6n de penicilina de Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 resultando una produccin 3 veces mayor con Wisconsin 4-176.

Por tanto l o s mtodos de conservacin y manejo se hicieron con l a cepa

p.

num Wisconsin
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4-176 y se compararon l o s siguientes mtodos de conservacin: 2) Esporas en t i e r r a con un paso en PDA; 3)

chrysoge-

geladas a -20C y 4) pasos sucesivos en PDA (tener l a suspensin de esporas en re-frigeracidn por semanas.) La productividad del hongo conservado por estos mtodos, se evalu por fermentacin rimentos l a mayor produccin 178 U/ml 5 8.8 se obtuvo con e l mtodo en t i e r r a con 3a. semana y posteriormente baja su produccin. un pase,l25/ml ?l.4..fqihbtodo lquida en matraz agitado con medio de Sylvester & Coghill (1950). En varios expe-

Esporas en tierra;

Esporas con-

de pases sucesivos mantiene su produccin hasta una

Estos resultados indican que e l mtodo en t i e r r a es e l adecuado para obtener producciones constantes y confirman l a importancia de l o s mtodos de conservacin y nejo de cepas en l a produccin de metabolitos secundarios.

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CONCLUSIONES.
La evaluacin y seleccibn de metodologas de fermentaciones lquidas para l a produc cin de penicilina de apoyo al montaje de fermentaciones s61idas para l a produccin con soportes como: harina de yuca, bagazo de caa, plstico sinttico (esponja), yute, etc. Adems las metodologas de conservacin en tierra y congelado es un nuevo enfoque

--

tanto para la produccin de penicilina como para otros mtodos de producci6n de diferentes metabolitos secundarios, as de un conocimiento ms afondo de l a fisiolo-ga de l o s productos fungicos.

.... .

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-~ .

VIII.

LITERATURA CITADA.

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