1.

Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic

Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, i anume: 1. Recoltarea i transportul produsului patologic (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, prelevnd un anumit produs patologic n funcie de manifestarea clinic n cazul respectiv, de exemplu urin n cazul unei infecii urinare, materii fecale n cazul dizenteriei, sput n cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame n cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6). 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologic reprezint de multe ori o etap esenial, care poate orienta paii urmtori. Pentru examenul microscopic se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram. Este preferabil s avem ntotdeauna cel puin nc un frotiu (de rezerv), n special n cazul n care produsul patologic este preios (LCR, produs recoltat prin puncie-biopsie etc). n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic, iniial cu obiectivul 40 pentru o analiz mai general, pentru stabilirea cmpului microscopic sau al zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se noteaz prezena diferitelor celule (eventual modificate fa de normal, burate de microorganisme), prezena celulelor inflamatorii (dovada reactivitii organismului, ex. leucocite, surprinznd eventual fenomenul de fagocitoz), precum i eventuala prezen a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretat cu precauie, n contextul dat. Chiar dac examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dat, cu rigurozitate, n anumite situaii putnd fi foarte important i foarte util. Atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu se realizeaz frotiuri fixate i colorate. Spre exemplu, n cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel, cutndu-se n special prezena leucocitelor (dar i a unor stru cturi care pot da anumite informaii cu privire la funcionalitatea tractului digestiv). n cazul suspicionrii unei infecii urinare, se va realiza un sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va examina ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe cmp microscopic, n cazul n care acestea exist, n vederea aprecierii prezenei unor cilindrii leucocitari precum i a altor celule normale sau patologice, a prezenei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile n vederea unui diagnostic corect i util pentru pacient. n cazul suspicionrii unei infecii micotice sunt utile att preparatele proaspete (ex. preparatul montat n soluie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraii negative (tu de India, nigrozin), precum i frotiurile colorate MayGrnwald-Giemsa sau Gram. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se va face n funcie de situaie (mediile i condiiile de incubare se vor alege n funcie de presupusul microorganism pe care trebuie s-l izolm; spre ex. n cazul n care infecia este produs de microorganisme strict anaerobe, n lipsa condiiilor anaerobe de cultivare este imposibil izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza n aa fel nct s se poat obine colonii izolate (tehnica nsmnrii n poligon) i respectiv o cultur pur, care se va identifica. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat, frotiu care se va fixa i colora Gram sau Ziehl Neelsen, dup caz, i se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenia numai microorganisme cu form i tinctorialitate similar (n cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte cocobacilare pn la forme filamentoase). n cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari. b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe mediile de cultur solide i care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazulCorynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis, de tip M n cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor(detalii privind aspect ele coloniilor microbiene sunt prezentate n capitolele dedicate fiecrui gen n parte). c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta i pot fi foarte utile spre exemplu n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a mediilor multi -test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma. d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i antigenicitatea microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen -anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscui pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile din genul Shigella, Salmonella,Vibrio etc). Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc.

e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substane cu rol n patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau infecia experimental a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie dup inocularea sputei la oarecele alb; n cazul n care n sput exist pneumococi, animalul va muri n 24 -48 de ore, iar din sngele lui se va izola o cultur pur de Streptococcus pneumoniae). f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie); g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa nr. 7). 5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice antibacteriene i antifungice, n vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave, antibiograma difuzimetric trebuie s fie completat de determinarea concentraiei minime inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide (CMB). n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar determinarea nivelului de eficien pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7).

2. Diagnosticul de laborator immunologic

Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic i / sau imunobiologic. n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) anticorpilor, n serul pacientului investigat, utiliznd antigene cunoscute. n diagnosticul serologic ne bazm pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp i utiliznd diferite tehnici trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale, i anume: - exist anticorpi n serul pacientului investigat? - care este titrul anticorpilor? - cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru; n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile; aceast analiz ne va permite s difereniem situaia unei afeciuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic de 4 ori), de situaia n care pacientul este deja n convalescen (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai sczut) sau de situaia unui pacient cu o afeciune cronic (titrul anticorpilor va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive). n vederea identificrii unei infecii acute, o variant posibil n majoritatea situaiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM. n cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea pacientului fa de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacia la tuberculin (PPD, preparat proteic purificat) sau la candidin reprezint exemple clasice, n acest sens. Tehnica intradermoreaciei este folosit n mai multe scopuri i trebuie s avem n vedere c n funcie de scopul urmrit i respectiv n funcie de antigenul inoculat (i de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3). Considerm c pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt foarte utile, merit s fie nelese i aplicate corespunztor. Pentru cei care se dedic microbiologiei sau bolilor infecioase, aceste noiuni reprezint o baz obligatorie, care poate fi completat utiliznd pe de o parte diferitele tratate medicale n domeniu dar i experiena personal dezvoltat att din punct de vedere teoretic ct i practic.