Efectuarea cromatografei de lichide de nalt performan

Introducere
Cromatografia de lichide de nalt performan este de fapt o form extrem de mbuntita a cromatografiei pe coloan. In loc ca solventul sa fie lsat s se scurg printr-o coloan prin curgere liber, este forat prin presiuni ridicate de pn la 400 atmosfere. Acest lucru il face mult mai rapid. De asemenea, v permite s utilizai particule de dimensiuni mult mai mici pentru materialul de umplutura al coloanei, care ofer o suprafa mult mai mare pentru interaciunea dintre faza staionar i moleculele care curge pe lng ea. Acest lucru permite o mai bun separare a componentelor amestecului. Alt mbuntire major a cromatografiei pe coloan se refer la metodele de detectare care pot fi utilizate. Aceste metode sunt foarte automatizate i extrem de sensibile.

Coloana i solventul
Derutant, exist dou variante care se utilizeaz n HPLC n funcie de polaritatea relativ a solventului i faza staionar. HPLC cu faz normal Aceasta este, n esen, la fel ca n cromatografia n strat subire sau cromatografie pe coloan. Desi este descrisa ca fiind "normala", aceasta nu este cea mai comun form de HPLC. Coloana este umplut cu particule minuscule de silice, iar solventul este hexanul nepolar, de exemplu. O coloan tipica are un diametru interior de 4,6 mm (sau poate fi mai mic ), i o lungime de la 150 la 250 mm. Compui polari din amestec trecuti prin coloan vor ramane mai mult timp la silicele polar dect compuii nepolari . Prin urmare, cele non-polare vor trece mai repede prin coloan. HPLC cu faz invers n acest caz , dimensiunea coloanei este aceeai , dar silicea este modificata pentru a il face nepolar prin ataarea de lanuri lungi de hidrocarburi la suprafaa ei - n mod obinuit , fie cu 8 sau 18 atomi de carbon n ele . Un solvent polar este utilizat - de exemplu , un amestec de ap i un alcool cum ar fi metanolul .

n acest caz , va exista o atracie puternic ntre solventul polar i moleculele polare din amestec fiind trecut prin coloan . Nu va fi la fel de multa atracie ntre lanurile de hidrocarburi ataate la silice ( faza staionar ) i moleculele polare din soluie. Prin urmare, moleculele polare din amestec vor petrece majoritatea timpului lor deplasandu-se cu solventul . Compui nepolari din amestec vor tinde s formeze atracii cu gruprile hidrocarbonate din cauza forelor de dispersie van der Waals . Ei vor fi , de asemenea, mai puin solubili n solvent din cauza necesitii de a rupe legturile de hidrogen . Prin urmare, ei petrec mai puin timp n soluie i acest lucru le va ncetini drumul lor prin coloan . Asta nseamn c acum moleculele polare, vor trversa mai repede coloana HPLC cu faz invers este cea mai comun form de HPLC. O schem de flux pentru HPLC

Injectarea probei Injectarea de proba este automatizata n ntregime , din cauza presiunilor implicate , nu este la fel ca n cromatografia de gaz Timpul de retenie Timpul necesar pentru un anumit compus de a traversa coloana pana la detector este cunoscut ca timpul de retenie . Acest timp este msurat din momentul n care proba este injectata pana la punctul n care pe ecran se afieaz o nlime maxim de vrf pentru acel compus .

Compusi diferiti au diferite timpuri de retenie . Pentru un anumit compus ,timpul de retenie va varia n funcie de : Presiunea folosit ( pentru c afecteaz rata de curgere a solventului ) natura fazei staionare ( nu doar materialul din care este confecionat , dar , de asemenea, si dimensiunea particulelor ) compoziia exact a solventului Temperatura coloanei Asta nseamn c, condiiile trebuie s fie atent controlate dac folosii timpi de retenie ca o modalitate de identificare a unor compui .

Detectorul Exist mai multe metode de detectare atunci cnd o substan a trecut prin coloan. O metod comun, care este uor de explicat foloseste absorbia ultra-violet.Muli compui organici absorb lumina UV de diferite lungimi de und. Dac avei un fascicul de lumina UV care strlucete prin fluxul de lichid care iese din coloan, i un detector UV de partea opus a fluxului, putei obine o interpretare direct de ct de mult din lumina este absorbit. Cantitatea de lumin absorbit va depinde de cantitatea unui anumit compus care trece prin raza la momentul respectiv.

S-ar putea sa va ntrebati de ce solvenii utilizai nu absorb lumina UV. Ei fac asta, daar diferii compui absorb mai puternic n unele zone ale spectrului UV.

Metanolul , de exemplu, absoarbe la lungimi de und sub 205 nm, i apa sub 190 nm. Dac ai folosit un amestec de metanol i ap ca solvent, prin urmare, ar trebui s utilizai o lungime de und mai mare de 205 nm, pentru a evita valori le false de la solvent. Interpretarea rezultatelor de la detector Rezultatul va fi nregistrat ca o serie de varfuri - fiecare dintre ele reprezentnd un compus n amestec trecut prin detectorul i absorbind lumina UV . Atta timp ct ai fost ateni pentru a controla condiiile de pe coloana , ati putea folosi timpii de retenie pentru a ajuta la identificarea compuilor prezeni - cu condiia , desigur , c tu ( sau altcineva ) le-ati msurat deja pentru mostrele pure ale diferitelor compui n conformitate cu aceste condiii identice . Dar putei folosi , de asemenea, vrfurile ca o modalitate de msurare a cantitilor de compui prezeni . S presupunem c suntei interesat despre un anumit compus , X. Dac ai injectat o soluie care conine o cantitate pura, cunoscut de X n main , nu numai ati putea nregistra timpul de retenie , dar v-ati putea referi , de asemenea, suma de X la vrf ul la care a fost format . Aria de subvrf este proporional cu cantitatea de X , care a trecut detectorul , iar aceast zon poate fi calculat automat de calculator . Zona msurata este prezentat n verde n diagrama.

Dac soluia de X a fost mai puin concentrata, suprafaa de sub varf va fi mai puina - dei timpul de retenie va fi la fel. De exemplu:

Asta nseamn c este posibil s se calibreze aparatul, astfel nct s poat fi utilizat pentru a gsi ct de multa substana este prezent - chiar i n cantiti foarte mici.

n diagram, suprafaa de sub varful pentru Y este mai mic dect cea pentru X. Aceasta poate fi, deoarece este mai puin Y dect X, dar ar putea fi in mod egal, deoarece absoarbe lumina UV la lungimea de und pe care o utilizai mai putin decat substanta X o face . Ar putea fi cantiti mari de Y prezent, dar n cazul n care doar absoarbe slab, ar da doar un vrf mic.

Cuplarea HPLC la un spectrometru de mas Cnd detectorul arat un vrf, o parte din ceea ce se trece prin detector la acel moment poate fi deviat la un spectrometru de mas. Acolo se va da un model de fragmentare, care poate fi comparat cu o baz de date computerizat de modele cunoscute. Asta nseamn c identitatile unor game largi de compui pot fi gsite fr a fi nevoie s tii timpurile lor de retenie.

Cromatografie lichid de nalt performan

Scurt istoric i definiie Cromatografie lichid a fost definitA la nceputul anilor 1900 de ctre un botanist rus , Mihail S. Tswett . Studiile sale de pionierat au fost concentrate asupra compuilor de separare [ pigmeni frunzelor ] , extrase din plante cu ajutorul unui solvent , ntr- o coloan umplut cu particule . Tswetta umplut o coloan de sticl deschisa cu particule . Dou materiale specifice, pe care le-a gsit utile au fost praful de creta [ carbonat de calciu ] i alumin . El a turnat proba lui [ extractul de solvent a frnzelor plantelor omogenizate ] n coloan i ia permis s treac n patul de particule . Aceasta a fost urmat de solvent pur . Cand proba a trecut n jos prin coloan de catre gravitaie ,

diferite benzi colorate au putut fi vzute separate , deoarece unele componente sau micat mai repede dect altele . El a legat aceste benzi , diferit colorate separate pentru diferii compui care au fost cuprinse iniial n prob . El a creat o separare analitic a acestor compui bazata pe puterea de atracie diferita a fiecarui compus chimic de a particulelor . Compuii care au fost mai puternic atrasi de particule au ncetinit , n timp ce ali compui mai puternic atrasi de solvent s-au miscat mai repede . Acest proces poate fi descris dup cum urmeaz : compuii coninui n eantion s-au distribuit , Acest lucru face ca fiecare compus s se deplaseze cu o vitez diferit , crendu-se astfel o separare a compuilor . Astzi , cromatografie lichid , n diferitele sale forme , a devenit una dintre cele mai puternice instrumente din chimie analitic .

Cromatografia lichid (CL) Tehnici Cromatografia lichid poate fi realizat utiliznd tehnici plane [1 i 2] sau tehnici de coloan [Tehnica 3]. Cromatografie lichid pe coloan este cea mai puternica i are cea mai mare capacitate pentru prob. n toate cazurile, proba trebuie mai nti s fie dizolvat ntr-un lichid care este apoi transportata fie pe, sau n, aparatul cromatografic. Tehnica 1.Proba este identificata, i apoi curge printr-un strat subire de particule de cromatografie [faz staionar] fixata pe suprafaa unei plci de sticl [Figura B]. Marginea de jos a plcii este plasat ntr-un solvent. Fluxul este creat prin

capilaritate ca solvent [faza mobil] ce difuzeaz n stratul de particule uscate i se deplaseaz n sus pe placa de sticl. Aceast tehnic se numete cromatografie n strat subire sau TLC.

Figura B: Cromatografie in strat subtire Tehnica 2. n figura C, probele sunt identificate pe hrtie [faz staionar]. Solventul [faz mobil] este apoi adugat la centrul spotului pentru a crea un flux radial spre exterior. Aceasta este o form de cromatografie pe hrtie. [Cromatografie pe hrtie clasic este realizat ntr-o manier similar cu cea de TLC cu flux liniar.]

Figura C : hrtie cromatografic

Observai diferena de putere de separare pentru aceast hartie speciala n comparaie cuplaca TLC . Inelul verde indic faptul c hrtia nu poate separa colorani galben i albastru unul de altul , dar s-ar putea separa acesti coloranti de colorantul rou . In imaginea de jos , o prob verde , alctuita din aceleiasi colorani galben i albastru , se aplic pe hrtie . Aa cum ai prezis, hrtia nu poate separa cei doi colorani . n mijloc , o prob de violet , format din colorani rou i albastru , a fost aplicat pe hrtie . Ele sunt bine separate . Tehnica 3 . In aceasta ,abordarea cea mai puternic ,eantionul trece printr-o coloan sau un dispozitiv de cartu care conine particule corespunztoare [ faz staionar ] . Aceste particule sunt numite materialul cromatografic . Solventul [ faz mobil ] curge prin dispozitiv. n extracie n faz solid [ SPE ] ,proba este ncrcat in cartuu i fluxul de solvent poart proba prin dispozitiv . Ca i n experimentul lui Tswett, compuii din eantion sunt apoi separati prin deplasarea cu viteze diferite prin dispozitiv . Aici proba negru este ncrcata ntr-un cartu . Diferiti solveni sunt utilizati n fiecare etap pentru a crea separarea

Figura D-1: cromatografie pe coloan - Extracie de faz solid [SPE] Componentele unui sistem de baz cromatografie lichid de nalt performan [ HPLC ] sunt prezentate n diagrama din figura simplu E. Un rezervor deine solventul [ numita faza mobil , din cauza ca se misca ] . O pomp de nalt presiune [ sistem de eliberare a solventului este utilizat pentru a genera i contorizeaza un debit specific de faz mobil , de obicei mililitri pe minut . Un este capabil de a introduce proba n fluxul continuu de faz mobil care poarta proba n coloana de HPLC. Coloana conine materialul de umplere cromatografic necesarepentru a efectua separarea . Acest material de umplere se numete faza staionar , pentru c este inut n loc de hardware-ul de coloan . Este nevoie de un detector pentru a vedea benzile separate , deoarece acestea se elueaz din coloan HPLC [ cele mai multi compusi nu au nici o culoare , aa c nu le putem vedea cu ochii notri ] . Faza mobil iese din detector i pot fi trimise la deeuri , sau colectate , dup cum se dorete . Cnd faza mobil conine o band de compus separat , HPLC ofer posibilitatea de a colecta aceast fraciune eluatului care conine acel compus purificat pentru studii ulterioare . Aceasta se numete cromatografie preparativ .Reinei c tuburile de presiune nalt i

accesorii sunt folosite pentru a interconecta pompa , injectorul , coloana , iar componentele detectorului pentru a forma tubul de faz mobil , eantionul , i pentru a separa benzile compuse .

Detectorul este conectat la calculator ,componenta a sistemului HPLC , care nregistreaz semnalul electric necesar pentru a genera cromatograma pe ecranul su i de a identifica i cuantifica concentraia constituenilor eantionuli ( a se vedea figura F ) . Deoarece caracteristicile probelor combinate pot fi foarte diferite , au fost dezvoltate mai multe tipuri de detectoare . De exemplu , dac un compus poate absorbi lumina ultraviolet , se utilizeaz un detector UV absorban . Dac compusul prezint o fluorescen , se folosete un detector de fluorescen . Dac compusul nu are nici una din aceste caracteristici , un tip mai universal de detector este folosit , cum ar fi un detector de lumin evaporare - scattering [ ELSD ] . Abordarea cea mai puternic este de a folosi mai multe detectoare n serie . De exemplu , un UV i / sau detector ELSD poate fi utilizat n combinaie cu un spectrometru de mas [ MS ] pentru a analiza rezultatele la separarea cromatografic . Aceasta ofer , de la o singura injectie , informaii mai cuprinztoare despre un analit . Practica de cuplare a unui spectrometru de mas la un sistem HPLC se numete LC / MS .

Figura F.

Moduri de separare HPLC In general , sunt trei caracteristici principale ale compui chimici care pot fi utilizate pentru a crea separri HPLC . Acestea sunt : Polaritatea sarcina electrica Dimensiunea molecular n primul rnd , s lum n considerare polaritatea i cele dou moduri principale de separare care exploateaz aceast caracteristic : faza normal i cromatografie n faz invers . Separri bazate pe polaritate O structura de molecula , activitatea , i caracteristicile fizico-chimice sunt determinate de aranjamentul atomilor i legturile sale constitutive dintre ele . ntr o molecul , un aranjament specific al anumitor atomi , care este responsabil pentru proprietile speciale i reacii chimice previzibile se numete o grupare

funcional . Aceast structur determin adesea dac molecula este polar sau nepolar . Moleculele organice sunt sortate n grupe n funcie de gruparea funcional principala. Folosind un mod de separare pe baza polaritii ,retenia cromatografic relativ a diferitelor tipuri de molecule este n mare msur determinat de natura i localizarea respectivelor grupri funcionale . Aa cum se arat n Figura P , clase de molecule pot fi comandate prin retenia lor relativ ntr o zon sau spectru de polaritate cromatografice de la o polaritate mare la nepolar .

Separri pe baza de incarcare: Ion-cromatografie de schimb [IEC] Pentru separri bazate pe polaritate, aa cum sunt atrase la fel pot pot fi respinse. In cromatografia de schimb ionic i alte separri bazate pe sarcin electric, regula este inversat. Asa cum pot fi respinse, n timp ce opusii sunt atrasi unul de celalalt. Fazele staionare pentru separri de schimb de ioni sunt caracterizate prin natura i puterea funciilor acide sau bazice de pe suprafata lor i tipurile de ioni pe care le atrage i le pstreaza . Schimb de cationi este folosit pentru a pstra i de a separa ioni incarcati pozitiv pe o suprafa negativa. Invers, schimbtoarele de anioni este utilizat pentru a reine i a separa ionii negativi pe o suprafa pozitiv a