UNIVERSITATEA DUNREA DE JOS, GALAI FACULTATEA DE TIINA I INGINERIA ALIMENTEL

Rezumatul tezei de doctorat STUDII PRIVIND AUTENTIFICAREA I CARACTERIZAREA PRIN TEHNICI MODERNE A MIERII DE ALBINE DIN ROMNIA

Doctorand Irina Dobre

Coordonator tiinific Prof. Dr. Ing. Petru Alexe

Galai, 2012
1

Prezenta tez de doctorat a fost elaborat prin sprijinul financiar acordat de ctre proiectul POSDRU/88/1.5/S/61445, Id proiect: 61445- Eficientizarea activitii studenilor din cadrul ciclului de studii doctorale-EFICIENT, Universitatea "Dunrea de Jos", Galai. Perioada de implementare fiind: 1 octombrie 2009 - 30 septembrie 2012.

MULUMIRI
Dedic aceast lucrare mamei mele de care sunt legat nu doar prin legturi de snge ci i prin legturi de iubire i prin rdcinile ancenstrale comune. Doresc s-mi exprim gratitudinea fa de persoanele care au avut impact n viaa mea profesional n ordine cronologic: mi exprim recunotina fa de doamna profesoar Rodica Segal, fiind prima cluzitoare a pailor mei pe crarea cercetrii n domeniul mierii de albine din anul II de studii universitare. V mulumesc! A dori s-mi exprim mulumirea fa de doamna profesoar Luminia Anca Georgescu care i-a consacrat timpul i energia, contribuind cu devotament i perseveren la formarea mea profesional nc din timpul facultii. Mulumesc din suflet! Sunt recunosctoare domnului profesor Petru Alexe, conductorul tiinific al tezei mele de doctorat, cruia i mulumesc pentru c m-a acceptat i mi-a oferit toat ncrederea pe parcursul efecturii acestei lucrri. Alese mulumiri celor care mi-au fost alturi pe perioada celor trei ani de studii doctorale, persoane care au reprezentat un reper pentru mine privind omenia i prietenia sincer, pe lng colegialitatea de care au dat dovad. Astfel, mulumesc colegilor Livia Patrascu, Ina Vasilean, Maricica Stoica, Ana Maria Simion, Loredana Dumitracu i Bria Vasile. Mulumesc proiectului EFICIENT POSDRU pentru susinerea financiar pe perioada celor 3 ani de doctorat, lucru care a favorizat formarea mea profesional n timpul celor 8 luni de mobilitate extern petrecute n laboratoarele Facultii de tiine din Ourense, Spania. Quiero mostrar mi especial agradecimiento a Maria Carmen Seijo Coello que ha sido para m como un segundo tutor, por dedicarme tanto su tiempo como su paciencia ante mis numerosas dudas, apoyndome en todo y confiar en mi desde el primer momento. Gracias por el apoyo profesional, financiero y tambin por tu sincera amistad. A Olga Escuredo, mi compaera de laboratorio y de vivienda, por mostrar su inters desde el primer da, por su ayuda, por sus palabras, por sus cafs.

Y por supuesto, a mi amiga y compaera Shantal Rodrguez Prez, por hacer que los largos das de laboratorio no fuesen tan largos, por su sincera amistad, por el tiempo compartido y las risas. Gracias! Quiero dar las gracias a mis amigos dentro y fuera de la facultad: Mara, Montse, Estefana, Jos Doncel, Jos Manuel, Begonia, Sandra y a los padres de Shantal por el tiempo compartido y el apoyo en mis das no tan buenas. Gracias a todos, al resto de personas, que por algn motivo u otro en este momento no recuerdo. Alese mulumiri prietenei mele de suflet, Corina Afteni, pentru suinerea, sfaturile, nelegerea i iubirea necondiionat de care a dat dovad n pofida distanei fizice existente. Mulumesc din suflet lui Bogdan Constantinescu, cuvintele fiind prea mici pentru a exprima imensa mea recunotin. tiu un singur lucru: creativitatea mea nu ar fi ajuns la acest nivel fr prezena i susinerea lui necondiionat.

V iubesc!

OBIECTIVE TIINIFICE I JUSTIFICAREA ALEGERII TEMEI

Mierea de albine este unul din produsele cele mai complexe din punct de vedere biologic, n compoziia creia s-au descoperit substane foarte importante pentru organismul uman. Acest fapt sporete mult importana mierii n alimentaia omului, comparativ cu alt e produse alimentare valoroase din punct de vedere nutriional. Compoziia chimic, precum i importana mierii pentru organism sunt determinate de n atura ei. Teza de doctorat intitulat Studii privind autentificarea i caracterizarea prin tehnici moderne a mierii de albine din Romnia a vizat ca principal obiectiv studiul unor diferite tipuri de miere (salcm, tei, rapi, floarea-soarelui, Prunus, man i poliflor), sub aspect melisopalinologic, fizico-chimic, biochimic, reologic i senzorial. Pentru autentificarea mierii romneti s-au utilizat diferite metode moderne cuplate cu tehnici de chemometrie. Astfel, n cadrul planului de lucru din programul doctoral au rezultat urmtoarele obiective specifice: Crearea unei bnci de mostre autentice de miere de albine din Romnia din diferite surse florale i zone geografice. Autentificarea originii botanice i clasificarea pe tipuri de miere prin identificarea i cuantificarea spectrului polenic bazat pe aplicarea metodei microscopice (melisopalinologice) cuplat cu metoda chemometric de prelucrare statistic. Caracterizarea fizico-chimic prin metode tradiionale i moderne (HPAEC-PAD), n vederea identificrii compuilor predominani din miere (spectrul glucidic, echipamentul enzimatic i etc.). Studiul proprietilor biologic active ale diferitelor tipuri de miere prin determinarea coninutului total de polifenoli, coninutului total de flavonoide, a capacitii antiradicalice dar i a indicelui de oxidare. Evoluia n timp a comportamentului reologic al mierii de albine prin evaluarea diferiilor parametrii reologici. Caracterizarea senzorial a probelor de miere prin evaluarea descriptorilor organoleptici specifici. Clasificarea i autentificarea mierii prin combinarea metodelor chemometrice (Cluster ierarhic, Analiza Componenilor Principali, Analiza Discriminant Factorial, Corelaii canonice i Pearson) i crearea unei baze de date constituit din profilele palinologice, fizico-chimice, biochimice i senzoriale ale mierii romneti.

Prezenta tez de doctorat este structurat n dou pri, astfel:

STUDIUL DOCUMENTAR
Capitolul 1, intitulat Apicultura i importana ei n Romnia este structurat n trei subcapitole care descriu diferite consideraii teoretice privind istoria apiculturii n ara noastr, caracteristici ale albinei romneti Apis mellifera Carpatica ct i potenialul apiculturii i producia de miere de calitate din Romnia. Capitolul 2, denumit Baza melifer este structurat n dou subcapitole alctuite din consideraii teoretice privind vegetaia melifer a Romniei, clasificarea plantelor melifere cu impact i caracterizarea taxonomic a acestor plante. Capitolul 3, intitulat Melisopalinologia ca tiin i preocuprile ei moderne cuprinde 2 subcapitole formate din considerente teoretice i stadiul actual al cercetrii n domeniu dar i rolul i importana aplicrii metodei palinologice, ct i structura morfologic a granulei de polen cu importan major n identificarea corect a speciei unei plante melifere. Capitolul 4, intitulat Mierea de albine, care este format din 5 subcapitole, prezint clasificarea mierii, tipurile de miere utilizate n prezentul studiu i caracteristicile sale, caracteristicile fizico-chimice ale mierii, nsuirile terapeutice dar i stadiul actual al cercetrilor n domeniu.

PARTEA EXPERIMENTAL
Capitolul 5, intitulat Identificarea spectrelor polenice diferitelor tipuri de miere din Romnia prin analiza melisopalinologic, prezint rezultatele obinute prin trasarea spectrelor polenice pentru cele 54 de probe de miere analizate n urma aplicrii metodei palinologice cantitative i calitative, identificarea tipurilor de miere luate n lucru dar i clasificarea acestora n funcie de originea botanic. Capitolul 6, denumit Contribuii privind controlul calitii mierii romneti prezint rezultatele obinute n urma identificrii i cuantificrii celor mai importani parametrii ai mierii precum: glucidele, proteinele, grsimile, apa, echipament enzimatic, indicatori ai prospeimii (HMF, invertaza, diastaza), valoare energetic. Capitolul 7, intitulat Evoluia n timp a comportamentului reologic al mierii de albine prezint profilele reologice ale tuturor tipurilor de miere analizate prin diferite teste precum: testul de cretere progresic a deformrii, testul de cretere progresiv a frecvenei, testul de curgere n trepte i testul de cretere progresiv a temperaturii. n cea de-a doua parte a acestui capitol a fost evaluat efectul temperaturii asupra vscozitii mierii utiliznd diferite modele matematice care descriu aceast influen. n urma analizei de clusterizare ierarhic, n funcie de vscozitatea probelor evaluate, s -a obinut gruparea acestora pe tipuri de miere.

Capitolul 8, denumit Studiul activitii antioxidantente a mierii romneti analizate prezint rezultatele obinute n urma evalurii potenialului antioxidant prin diferite metode: estimarea coninutului total de polifenoli prin metoda Folin-Cioclteu, estimarea coninutului total de flavonoide, estimarea activitii antiradicalice (RSA -radical scavenging activity) i estimarea indicelui de oxidare. Prin prelucrare statistic a rezultatelor s-au obinut corelaii canonice semnificative ntre diferitele metode de determinare a activitii antioxidante. De asemenea, n urma analizei de clusterizare ierarhic a fost posibil autentificarea originii botanice n funcie de capacitatea antioxidant i discriminarea ntre mierea floral i cea de man. n capitolul 9, intitulat Evaluarea calitii mierii romneti pe baza analizei senzoriale este prezentat profilul senzorial al tipurilor de miere evaluate de un grup de degusttori specialiti (mpreun cu autorul lucrrii care a fost pregtit n acest sens), din cadrul Institutului Tcnica del Consejo Regulador Geogrfica Protejida Miel de Galicia din Spania. S-au stabilit, prin aplicarea analizei compentelor principale, atributele senzoriale care discrimineaz puternic tipurile de miere precum i coeficienii de corelaie Pearson pentru aceti descriptori organoleptici. De asemenea, n funcie de culoare i gustul dulce, este posibil autentificarea originii botanice a mierii aplicnd analiza de clusterizare ierarhic. Capitolul 10, intitulat Autentificarea originii botanice a mierii romneti bazat pe combinarea analizelor fizico-chimice i chemometrice prezint rezultatele obinute n urma autentificrii prospeimii mierii prin identificarea posibilelor fraude, autentificarea originii botanice utiliznd metode palinologice, fizico-chimice, biochimice i chemometrice. n partea a doua este prezentat profilul fizico-chimic, biochimic, palinologic i senzorial caracteristic fiecrui grup de miere evaluat. n final, au fost prezentate contribuiile originale ale actualei teze de doctorat, care prezint impact asupra dezvoltrii cunoaterii n acest domeniu dar i viitoare le perspective de continuare a cercetrilor i diseminarea rezultatelor pe perioada programului de studii doctorale (01.10.2009 - 14.09.2012). Realizarea activitilor de cercetare care au respectat i ndeplinit obiectivele tiinifice ale tezei de doctorat a avut loc n cadrul: Laboratorului de Analize Fizico-Chimice i Microbiologice ale Alimentelor acreditat RENAR al Facultii de tiina i Ingineria Alimentelor, Universitatea Dunrea de Jos, Galai, Romnia. Laboratorului de Biologie Vegetal i tiina Solului din cadrul departamentului de Apicultur i Biologie, Facultatea de tiine, Universitatea de Vigo, Ourense, Spania.

CAPITOLUL 5. IDENTIFICAREA SPECTRELOR POLENICE ALE TIPURILOR DE MIERE DIN ROMNIA PRIN ANALIZA MELISOPALINOLOGIC
5.2. MATERIALE I METODE Ca referin pentru identificarea diferitelor specii de polen studiate s -au utilizat preparatele microscopice din palinoteca (biblioteca de polen) Departamentului de Biologie Vegetal i Apicultur din cadrul Facultii de tiine din Ourense, Spania. n para lel s-au folosit chei de identificare polenic. Probele de miere supuse prezentului studiu (n=54) au fost achiziionate direct de la apicultor care a garantat originea sa botanic i geografic, dar i de la Asociaia Cresctorilor de Albine din diferite localiti. Probele au fost obinute din 2 culturi (culesuri) consecutive coresponznd anilor 2009 i 2010 (tabelul 5.1 i 5.2). S-au utilizat n total 54 de probe de miere dintre care: 26 de probe din Moldova, 13 probe din Muntenia, 12 probe din Transilvania i 3 probe din Dobrogea (figura 5.1).

Tabelul 5.1. Originea geografic i botanic a probelor de miere conform declaraiei productorului
Tip de miere Salcm Tei Rapi Floarea-soarelui Pomi fructiferi (Prunus) Man (brad, man, fnea) Poliflor Ppdie Numr probe n=21 n=17 n=4 n=2 n=1 n=3 n=5 n=1 Origine geografic (localitate) Arge, Braov, Bucureti, Galai, Ialomia, Iai, Cluj-Napoca Arge, Braov, Tulcea, Bacu, Neam, Galai, Brila, Iai Brila, Slobozia, Vaslui, Galai, Bacu, Braov, Bucureti, Timioara, Tulcea Vlcea, Bucureti, Vaslui, Bihor Braov Braov, Bacu, Galai Galai, Tulcea, Bucureti, Braov, Oradea, Timioara Cluj-Napoca

Fiecare prob de miere a fost depozitat n recipiente de sticl care au fost corect etichetate i transportate la laboratorul din cadrul Facultii de tiina i Ingineria Alimentelor pentru analizele ulteriore. Analizele parametrilor de calitate au fost efectuate la
8

data intrrii n laborator a probelor de miere, restul fiind transferate n recipi ente sterile de plastic pstrate n condiii de refrigerare.

Tabelul 5.2. Originea botanic i caracteristici apicole a probelor de miere conform declaraiei productorului
Origine botanic Salcm Tei Rapi Floarea-soarelui Pomi fructiferi (Prunus) Man (brad, man, fnea) Poliflor Ppdie Numr probe n=21 n=14 n=4 n=2 n=1 n=3 n=5 n=1 Nectar-PolenMan N,P N,P N,P N,P N,P man N,P N,P Luna de nflorire mai-iunie iunie-iulie mai-iunie iunie-septembrie martie-iunie aprilie-mai aprilieseptembrie aprilieseptembrie Producia de miere (kg/ha) 1000 1200 30-100 35-100 20 1200 200

Reactivii, glicerin (87%) i gelatin glicerinat Kaiser pentru microscopie, au fost achiziionai de la Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, Germania) iar parafilmul i fuxina de la Merck (Darmstadt, Germania). 5.2.2. Analiza palinologic calitativ Numrul granulelor de polen specifice mierii monoflore se determin prin examinarea microscopic a sedimentului obinut n urma centrifugrii, iar procentul se stabilete prin raportarea numrului respectiv la numrul total de granule de polen gsite pe aceleai cmpuri microscopice. Prin aceast metod se pot identifica diferitele tipuri polenice prezente n miere, lucru care permite apoi stabilirea polenului dom inant ce reprezint un indicator botanic. Pentru investigarea spectrelor polenice ale celor 54 probe de miere, extracia polenului s-a realizat utiliznd metodologia descris de Louveaux i colab. [6] cu mici modificri adoptate n ceea ce privete durata de centrifugare.

Astfel 20 g miere au fost dizolvate n 45 mL de ap distilat (la o temperatur de 45C) pn la dispariia cristalelor de zahr. Apoi a avut loc centrifugarea acestora timp de 15 minute la 4500 rotaii/minut. Dup ce s-a eliminat supernatantul din fiecare tub prin nclinare uoar, n aa fel nct s nu se disloce sedimentul, peste acesta s -au adugat 45 mL ap distilat, n scopul splrii sedimentului de impuriti. Acestea au fost supuse apoi unei centrifugri timp de 10 minute la 4500 rotaii/minut, dup care supernatantul a fost ndeprtat din nou. Examinarea a avut loc la un microscop optic (NIKON OPTIPHOT II) la grosismentul de 400x i 1000x, n funcie de dificultatea identificrii polenului respectiv. S -au numrat i identificat circa 1000 granule de polen pentru fiecare spectru polenic. Odat ce a fost identificat, polenul s-a clasificat n funcie de taxonomie n specie, gen sau tip i familie. Se clasific corespunztor unei specii atunci cnd polenul identificat are caracteristici morfologice specifice acelei specii florale sau vegetale. Dup obinerea acestor date, se calculeaz procentele relative fiecrui tip de polen i se finalizeaz prin trasarea spectrului polenic al mierii supuse analizei palinologice. Calcul i exprimarea rezultatelor: GP=n/n1100 (%) n care: GP- granule de polen (se nominalizeaz specia); n- numrul granulelor de polen aparinnd speciei florale studiate; n1- numrul total de granule numrate (specia studiat i celelalte specii).

5.2.3. Analiza palinologic cantitativ Pentru investigarea spectrelor polenice a celor 54 probe de miere, extracia polenului s-a realizat utiliznd metodologia descris de Louveaux i colab. [6] cu unele modificri privind timpul centrifugrii i viteza de centrifugare. Obinerea preparatului microscopic a avut loc n aceleai condiii ca n cazul analizei calitative, cu modificarea c dup ndeprtarea supernatantului din tubul de centrifug (la finalul celor dou centrifugri) sedimentul se aduce la un volum de 5 mL cu ap distilat i se omogenizeaz cu ajutorul unui Vortex. S-au identificat toate granulele de polen dar i indicatorii de man (spori, alge, hife) din ntreg preparatul microscopic. Pentru aceasta s-a parcurs suprafaa preparatului prin deplasarea lamei pe distane egale cu diametrul cmpului microscopic.

10

Pentru exprimarea rezultatelor s-a utilizat raportul HDE/P, n care HDE (honeydew elements- elemente de man) reprezint numrul indicatorilor de man iar P reprezint numrul total de granule de polen identificate. 5.2.4. Metode statistice de prelucrare i interpretare a rezultatelor Analizele descriptive au fost efectuate pentru toate probele analizate. Cele mai frecvente tipuri de polen au fost comparate innd cont de tipul de miere cu ajutorul unei analize de varian (ANOVA) care determin prezena unor diferene statistice semnificative (p<0,05). Analiza componentelor principale (PCA) a fost efectuat n scopul determinrii unor similitudini ntre probe n funcie de originea botanica, iar analiza de clusterizare n scopul clasificrii/gruprii acestora. Toate analizele statistice au fost efectuate cu programele de calcul Centurion STATGRAPHICS XVI i SPSS Version 17.0 pentru Windows. Determinrile au fost realizate n duplicat. 5.3. REZULTATE I DISCUII 5.3.1. Evaluarea analizei cantitative Determinarea cantitativ palinologic s-a realizat cu scopul obinerii densitii polenice pentru toate probele analizate. Probele de miere au fost incluse n urmtoarele clase de polen conform clasificrii lui Maurizio [5]: Clasa I, < 2000 GP/g miere- 37,04% (20 probe de miere). Clasa II, ntre 2000-10000 GP/g miere- 59,26% (32 probe de miere). Clasa III, ntre 10000-50000 GP/g miere- 3,7% (2 probe de miere). Clasa IV, ntre 50000-100000 GP/g miere (0 probe). Clasa V, mai mult de 100000 GP/g miere (0 probe).

11

3,7

Clasa I
Clasa II Clasa III 37,04 Clasa IV Clasa V

59,26

Figura 5.3. Distribuia probelor de miere n acord cu clasificarea lui Maurizio Distribuia probelor de miere s-a realizat cu ajutorul clasificrii lui Maurizio (figura 5.3). Rezultatele obinute indic faptul c probele de miere studiate au o densitate polenic medie, mai mult de 50% dintre probe situndu-se n Clasa a II-a. n cele ce urmeaz este reprezentat variaia mediei densitii polenice a fiecrui grup de miere n parte.
Salcm (n=12)
2254 1986 2083 2338 4044 5375 6766

Tei (n=14) Man( n=3) Fl.-soarelui (n=4) Poliflor (n=9) Prunus (n=1) Rapi (n=11)

2000

4000

6000

8000

Densitate polenic [GP/g miere]

Figura 5.4. Densitatea polenic medie a fiecrui grup de miere

12

Grupul mierii de salcm (n=12) a nregistrat un minimum de 525 GP/g i un maximum de 5475 GP/g, cu probe aparinnd att clasei I, ct i clasei a II-a, fa de grupul rapi (n=11) cu valori semnificative i foarte variate situate n intervalul 700-19525 GP/g miere. Anumite probe de rapi (33 i 34) au aparinut clasei III, fiind singurele din toate probelor analizate care se situeaz n clasa relativ bogat n polen (tabelul 1- Anexe). Din figura 5.4 se poate observa variaia densitii polenice ntre cele 7 tipuri diferite, care n cazul mierii de rapi i Prunus este destul de ridicat comparativ cu mierea de man i cea de tei. Concentraia n polen sczut n cazul mierii de man se datoreaz prezenei n compoziie n cea mai mare msur a indicatorilor de man i mai puin a granulelor de polen. n cazul mierii de tei, polenul Tilia este hiporeprezentat, ceea ce admite denumirea unei mieri ca fiind de tei, acesta fiind prezent cu un procent ntre 10-20% [3,16]. n studiul de caracterizare a mierii monoflore, Persano Oddo i colab. [8] afirm c n cazul mierii de tei polenul aparinnd genului Tilia poate chiar s fie absent datorit sterilitii multor varieti ale acestor plante cultivate. Acest fapt depinde, de asemenea, de flora fiecrei regiuni. Analiza indicatorilor de man (spori, hife, alge, etc.) s-a realizat pentru toate probele de miere, nsa rezultate edificatoare a prezentat, n mod special, mierea de man (3 probe din regiunea Transilvania) (figura 5.5). Din clasa indicatorilor de man ntlnii n probele de miere din Romnia, fac parte spori ai mucegaiurilor aparinnd genurilor: Cladosporium (identificat n majoritatea probelor de miere, nu doar n cele de man), Aspergillus, Stemphylium, Alternaria, Pleospora iar n unele probe au fost prezente algele verzi precum Chlorococcus (figura 5.5). Un studiu recent din Spania bazat pe diferenierea mierii florale fa de cea de man confirm, de asemenea, prezena unora din indicatorii de man identificai n mierea romneasc [26]. Mierea comercializat cu denumirea miere de munte a avut cea mai mic valoare a HDE=175 pe gram de miere, fiind urmat de mierea de man cu un HDE=275 pe gram de miere. ns mierea de brad a nregistrat cea mai mare valoare a HDE=300 pe gram de miere. Aceste valori includ cele 3 probe de miere n categoria celor de man, lucru dovedit ulterior i de anumite analize fizico-chimice care le difereniaz de tipurile de miere floral. 5.3.2. Evaluarea analizei calitative Rezultatele obinute n urma analizei palinologice calitative arat c din cele 54 probe de miere, doar 9 intr n categoria mierii poliflorale , 3 sunt clasificate drept miere de man i 42 probe sunt mieri monoflorale. n cadrul mierii monoflorale, 12 probe de miere au fost clasificate ca fiind de salcm (Robinia pseudoacacia), 14 probe de tei (tipul Tilia), 11 probe de rapi (tipul Brassica napus), 4 probe de floarea-soarelui (Helianthus annuus) i o prob de Prunus (tipul Prunus).

13

S-au remarcat diferene ntre denumirea comercial pe care a avut-o produsul n momentul achiziionrii lui i clasificarea tipurilor de miere, obinut n urma examenului palinologic. Astfel, din 21 probe de miere de salcm, achiziionate cu aceast denumire, doar 12 sunt din punct de vedere palinologic salcm (Robinia pseudoacacia), restul intrnd n categoria mierii de rapi sau poliflor. n cazul mierii de tei, a avut loc acelai fenomen (din 17 probe doar 14 fiind de tei), identificndu-se ca facnd parte din acest grup o prob de floarea -soarelui i dou poliflorale. Mierea achiziionat cu denumirea de ppdie a prezentat un procent de numai 5% Taraxacum officinale, fiind inclus ulterior n grupul mierii poliflore. Proporia de polen considerat necesar pentru a putea denumi o miere monoflor, utilizat n acest studiu pentru toate tipurile de miere este: pentru tipul Brassica napus (miere de rapi) un procent >45% din totalul spectrului polenic, pentru Helianthus annuus (miere de floarea-soarelui) s-a ales un procent >45%, pentru tipul Prunus un procent mai mare dect 44%. Robinia pseudoacacia (miere de salcm) i Tilia (miere de tei) fiind tipuri de polen hiporeprezentate s-au ales procente de minimum 5% respectiv 29%. n prezentul studiu palinologic au fost identificate 77 tipuri polenice aparinnd celor 35 de familii botanice corespunztoare. Genul Brassica napus i Rumex prezint o frecven de apariie de 100% i respectiv 88,9% n probele de miere luate n lucru.

14

Tabelul 5.3. Frecvena de apariie a tuturor tipurilor polenice prezente n peste 50 % din probe conform claselor de dominan
Familie Cruciferae Polygonaceae Rosaceae Rosaceae Fabaceae Plantaginaceae Rosaceae Fabaceae Tiliaceae Fagaceae Rosaceae Rosaceae Asteraceae Umbelliferae Asteraceae Boraginaceae Vitaceae Chenopodiaceae Urticaceae Asteraceae Rhamnaceae Boraginaceae Specie de polen Tipul Brassica napus Rumex Prunus Rubus Tipul Trifolium repens Plantago Tipul Fragaria Robinia pseudoacacia Tilia Quercus Tipul Crataegus monogyna Filipendula Tipul Taraxacum officcinale Tipul Daucus carota Helianthus annuus Echium Vitis vinifera Tipul Chenopodium Tipul Urtica Centaurea cyanus Frangula alnus Tipul Symphytum oficcinalis Frecven de apariie (%) 100,0 88,9 87,0 83,3 81,5 81,5 81,5 77,8 77,8 75,9 75,9 75,9 74,1 64,8 61,1 61,1 61,1 57,4 57,4 53,7 51,9 50,0 P (0-1%) 1,9 46,3 29,6 38,9 40,7 48,1 37,0 33,3 22,2 37,0 44,4 25,9 57,4 53,7 29,6 40,7 44,4 51,9 51,9 44,4 38,9 38,9 R (1-3%) 7,4 33,3 24,1 22,2 22,2 25,9 37,0 5,6 14,8 22,2 27,8 38,9 14,8 9,3 11,1 13,0 9,3 5,6 5,6 7,4 9,3 7,4 I (3-15%) 25,9 9,3 24,1 22,2 16,7 5,6 7,4 31,5 7,4 13,0 3,7 9,3 1,9 1,9 9,3 3,7 7,4 0,0 0,0 1,9 3,7 3,7 A (15-45%) 37,0 0,0 9,3 0,0 1,9 1,9 0,0 5,6 14,8 3,7 0,0 1,9 0,0 0,0 3,7 3,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 D >45% 27,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,9 18,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 7,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

15

Studii privind autentificarea originii botanice a mierii din Cehia relateaz apariia ntr o msur semnificativ a polenului din genul Brassica, Tilia, Robinia, Helianthus, Pomum i mici cantiti de Phacelia, Taraxacum, Rubus i Trifolium. Este evident similaritatea anumitor genuri de polen ce se gsesc n mierea ceh i cea romneasc, lucru demonstrat de asemnarea florei celor dou ri. Familiile botanice cu frecvena de apariie cea mai ridicat sunt: Cruciferae, Rosaceae, Fabaceae, Fagaceae, Umbelliferae, Boraginaceae, Chenopodiaceae i Poaceae. Cu toate c procentul de apariie a polenului din familia Chenopodiaceae i Poaceae a fost de peste 50% din totalul probelor analizate, acestea au fost prezente n cantitai nesemnificativ de mici, nefcnd parte din grupul plantelor melifere. Spectrul polenic al mierii monoflore prezint ntre 12 i 42 tipuri polenice cu o valoare medie de 26 pe fiecare spectru. Pentru un studiu detaliat al analizei palinologice calitative, tipurile de miere luate n lucru s-au mprit n grupuri diferite, discutntu-se fiecare n parte. 5.3.10. Interpretarea rezultatelor prin metoda PCA i CA Grupurile de miere (salcm, tei, rapi, Prunus, floarea-soarelui, man i poliflor) supuse analizei de varian ANOVA au nregistrat diferene semnificative pentru p<0,005. Pentru a demonstra grafic aceste diferene, s-a recurs la aplicarea Analizei Componentelor Principale (analiz discriminant) n care s-a urmrit clasificarea grupurilor de miere n funcie de cele mai importante specii de polen: Robinia pseudoacacia, Tilia, Brassica napus, Prunus i Helianthus annuus (figura 5.14). Procentele acestor tipuri polenice au fost ulterior integrate n software pentru toate probele de miere monofloral , dar i pentru cea de man. Componentele principale sunt combinaii liniare ale variabilelor originale (speciile de polen) extrase pe criteriul maximizrii varianei (variana fiind o masur a cantitii de informaie reinut). Astfel, componenta 1 este reprezentat de Tilia i Helianthus annuus, componenta 2 de Tilia i Brassica napus iar componenta 3 de Robinia pseudoacacia, Tilia i Prunus. Scopul analizei a fost acela de a obine un numr mic de combinaii liniare din cele 5 variabile introduse (tipuri polenice), care s aib puterea discriminatorie cea mai ridicat n probele de miere. n acest caz, 3 componente au fost extrase, deoarece 3 componente au avut valori proprii mai mare dect 1,0. mpreun, acestea reprezint 78,76 % din variabilitatea datelor originale. n cazul clusterizrii, problema const n a grupa o colecie dat de probe neetichetate n grupuri semnificative.

16

Figura 5.14. Grupurile de miere formate n urma PCA (1-salcm; 2-tei; 3-rapi; 4-floareasoarelui; 5-Prunus; 6- man) Astfel, dendograma formeaz 5 grupuri diferite de miere monofloral n funcie de variabilele cu putere discriminant obinute n urma analizei componentelor principale (figura 5.15).

Figura 5.15. Dendograma pentru gruparea probelor de miere n funcie de originea botanic (1-salcm; 2-tei; 3-rapi; 4-floarea-soarelui; 5-Prunus; 6- man)

17

5.4. CONCLUZII n cazul analizei palinologice cantitative distribuia probelor de miere s -a realizat cu ajutorul clasificrii lui Maurizio, probele de miere luate n lucru avnd o densitate polenic medie, mai mult de 50% din probe situndu-se n Clasa a II-a (ntre 2000 i 10000 GP/g de miere). Concentraia absolut de polen a tipurilor de miere analizate variaz astfel: mierea de rapi> mierea de Prunus> mierea poliflor> mierea de floarea-soarelui> mierea de salcm> mierea de man> mierea de tei. Evidenierea indicatorilor de man (spori, hife, alge etc.) s-a aplicat tuturor probelor de miere, nsa rezultate edificatoare s-au nregistrat n mod special n cazul a 3 probe din regiunea de munte a Romniei (declarate cu originea: brad, man i fnea). Mierea de brad a nregistrat cea mai mare valoare a HDE=300 pe gram de miere. Aceste 3 probe de miere au fost incluse n categoria celor de man, lucru dovedit de anumite analize fizicochimice efectuate ulterior. Spectrul polenic n cazul mierii de man nglobeaz n special spori de mucegai aparinnd genurilor precum: Cladosporium (identificat n majoritatea probelor de miere, nu doar n cele de man), Aspergillus, Stemphylium, Alternaria, Pleospora, Leptosphaeria, Urediniospores iar n unele probe au fost prezente algele verzi ca Chlorococcus. Rezultatele obinute n urma analizei palinologice calitative arat c dintre cele 54 probe de miere, doar 9 au fost poliflore, 3 clasificate ca miere de man i 42 probe intrnd n categoria mierii monoflore. n cadrul mierii monoflore, 12 probe de miere au fost clasificate ca fiind de salcm (Robinia pseudoacacia), 14 probe de tei (tipul Tilia), 11 probe de rapi (tipul Brassica napus), 4 probe de floarea-soarelui (Helianthus annuus) i o prob de Prunus ( tipul Prunus). n prezentul studiu palinologic au fost identificate 73 tipuri polenice aparinnd celor 35 de familii. Tipul Brassica napus i Rumex au fost prezente n 100%, respectiv n 88,9% din totalul probelor de miere luate n lucru. Singurul tip de polen prezent n toate cele 54 de probe (100 %) a fost Brassica napus (rapia), acesta fiind urmat de anumite tipuri polenice din familia Rosaceae ca: Prunus (aici poate intra prunul, cireul, viinul, corcoduul, mlinul, porumbarul, migdalul pitic), Rubus, Fragaria i Filipendula. Pe lng Robinia pseudoacacia au fost prezente n toate probele de salcm tipuri de polen ca Brassica napus, Plantago, Rubus, Prunus, Fragaria, Filipendula, Rumex i Vitis vinifera.

18

CAPITOLUL 6. CONTRIBUII PRIVIND CONTROLUL DE CALITATE AL MIERII ROMNETI

6.2. MATERIALE I METODE 6.2.1. Material de studiu S-au utilizat n total 54 de probe de miere dintre care: 26 de probe din Moldova, 13 probe din Muntenia, 12 probe din Transilvania i 3 probe din Dobrogea. 6.2.2. Determinarea parametrilor fizico-chimici Analizele fizico-chimice care s-au utilizat n controlul de calitate al mierii (pH, umiditate, conductivitate electric, cenu, indice colorimetric) au fost n conformitate cu metodologia oficial de analiz a mierii din Spania (standardul BOE- Boletn Oficial del Estado nr. 186/5.08.2003). 6.2.3. Determinarea parametrilor de prospeime ai mierii Ali parametrii ce au fost evaluai privind calitatea mierii au fost: HMF i activitatea invertazic i amilazic, care au fost determinai conform metodei propuse de European Honey Commision i de AOAC. 6.2.4. Determinarea compoziiei nutriionale a mierii 6.2.4.1. Determinarea spectrului glucidic Glucidele din miere au fost determinate prin metoda cromatografic de schimb anionic de nalt performan (HPAEC) cu un cromatograf ionic DIONEX ICS-3000 SP (Sunnyvale, California, E.E.U.U.) ce prezint un detector amperometric cu pulsuri (PAD). Acest tip de cromatografie a fost dezvoltat pentru separarea glucidelor din diferite alimente [116], profitnd de caracterul slab acid al carbohidrailor cu scopul obinerii de separri extrem de selective la un pH ridicat, utiliznd ca i faze staionare un schimbtor de anioni puternic. Detecia cantitativ i calitativ depinde de caracteristicile coloanei utilizate, tipul detectorului i condiiile de lucru. Pregtirea probei de miere pentru analiz S-a dizolvat 1 g miere n 100 mL de ap ultrapur obinnd o concentraie a soluiei de miere de 10 mg/L. Apoi s-a diluat 1 mL din aceast soluie, cu ap ultrapur, pn la un volum final de 100 mL, iar din aceasta s-au filtrat 5 mL cu ajutorul unui filtru cu diametrul

19

porilor de 0,45 m, pentru a elimina orice posibil impuritate sau granul de polen care poate interfera n testare.

Figura 6.1. Cromatograma glucidelor standard, identificate i cuantificate cu cromatograful DIONEX ICS-3000 SP. 1: trehaloza; 2: glucoza; 3: fructoza; 4: zaharoza; 5: melezitoza; 6: maltoza

6.2.4.2. Determinarea lipidelor Lipidele din miere provin n mare parte din plante i resturi de cear , prezentnd un coninut relativ sczut. Acest nutrient a fost determinat prin metoda Soxhlet conform AOAC , care cuantific lipidele din materia uscat cu ajutorul unui extractor automatic ce utilizeaz eter de petrol ca solvent. 6.2.4.3. Determinarea proteinelor Coninutul de azot din miere provine majoritar din polen, chiar dac i aminoacizii i enzimele aduc un aport de azot mierii [54]. Pentru determinarea proteinelor din miere s-a aplicat metoda Kjeldahl [117], care se bazeaz pe conversia azotului organic, prezent n proba de analizat, n sulfat de amoniu, care reacioneaz ulterior cu acidul sulfuric. 6.2.5. Determinarea valorii energetice Prin valoarea energetica a unui aliment se nelege potenialul nutrienilor si calorigeni de a furniza energie. Aceasta energie latent din aliment se transform n corpul uman n energie activ, pe care organismul o folosete n procesele sale (cretere,

20

metabolism, construcii etc.). n cazul mierii, principalele componente care furnizeaz energie sunt glucidele. Pentru determinarea valorii calorice a mierii romneti s-a inut cont de coninutul de proteine, lipide i carbohidrai.
6.2.6. Prelucrarea statistic a rezultatelor

n ceea ce privete prelucrarea statistic a rezultatelor obinute n urma analizelor fizico-chimice s-au utililizat dou metode chemometrice multivariate: Analiza componentelor principale (PCA) i Analiza de clusterizarea ierarhic (Cluster analysis). Pen tru a descrie posibile corelaii ntre parametrii analizai s-a aplicat o analiz de corelaie bivariat Spearman. 6.3. REZULTATE I DISCUII 6.3.1. Evaluarea parametrilor fizico-chimici de apreciere a calitii mierii Mierea destinat comercializrii trebuie s ndeplineasc norma de calitate conform standardelor n vigoare. Calitatea mierii influeneaz compoziia sa, culoarea i aspectul, criterii importante n vederea achiziionrii unui astfel de produs. Primul parametru care trebuie analizat este umiditatea. Mierea este un produs foarte higroscopic iar coninutul su poate suferi modificri n timpul depozitrii, cauznd o cretere n cantitatea de ap n straturile superioare. Valoarea medie a umiditii probelor de miere analizate a fost de 18,7%, cu un interval de variaie ntre 14,9 24,5%. Un alt parametru analizat n prezentul studiu a fost pH-ul ,a crei valoare medie pentru cele 54 de probe analizate a fost de 4,1 variind n intervalul 3,3 5,7. Pentru evidenierea grafic a diferenelor dintre grupuri privind conductivitatea electric, s-au reprezentat ntr-o diagram Box-Whisker medianele fiecrui grup de miere i limitele maxime i mininime (figura 6.2). n urma analizei ANOVA, a rezultat raportul F egal cu 15,8, fiind raportul de estimare ntre grupuri i n interiorul fiecrui grup. Deoarece p<0,005, exist o diferen statistic semnificativ ntre cele 7 variabile, la nivelul de ncredere de 95,0%. Este bine cunoscut corelaia dintre conductivitatea electric i cenu n cazul mierii, astfel, aceti doi paramentrii analizai n prezentul studiu au prezentat valori medii de 0,5 mS/cm i respectiv 0,320% iar coeficientul de corelaie a fost de 0,903 (figura 6.3). O relaie de linearitate ntre cei doi parametrii studiai este susinut i de Saxena i colab. [94], obinnd un coeficient de corelaie egal cu 0,98. n cazul unor tipuri de miere produse n Algeria, de asemenea, s-a obinut o corelaie ridicat (0,92) ntre coninutul de cenu i conductivitatea electric.

21

Figura 6.2. Diagrama Box-Whisker pentru conductivitatea electric a celor 7 grupuri diferite de miere

n urma analizei ANOVA, a rezultat raportul F egal cu 15,8, fiind raportul de estimare ntre grupuri i n interiorul fiecrui grup. Deoarece p<0,005, exist o diferen statistic semnificativ ntre cele 7 variabile, la nivelul de ncredere de 95,0%. Este bine cunoscut corelaia dintre conductivitatea electric i cenu n cazul mierii, astfel, aceti doi paramentrii analizai n prezentul studiu au prezentat valori medii de 0,5 mS/cm i respectiv 0,320% iar coeficientul de corelaie a fost de 0,903 (figura 6.3). O relaie de linearitate ntre cei doi parametrii studiai este susinut i de Saxena i colab. [94], obinnd un coeficient de corelaie egal cu 0,98. n cazul unor tipuri de miere produse n Algeria, de asemenea, s-a obinut o corelaie ridicat (0,92) ntre coninutul de cenu i conductivitatea electric. Este de remarcat coninutul ridicat de cenu i respectiv al conductivitii electrice n cazul probelor de man. Rezultatele conductivitii electrice variind, n acest caz, ntre 1,2 i 1,4 mS/cm, au clasat cele 3 probe ca fiind de man. Valori destul de ridicate s -au obinut n cazul mierii de tei i a mierii de Prunus, ceea ce confirm coninutul ridicat n sruri minerale al acestor tipuri de miere. Probele din grupul mierii de salcm au nregistrat cele mai sczute valori ale conductivitii, rezultat obinut i raportat ntr-un studiu recent i de ctre Mrghita i colab. [4] pentru mierea romneasc. Culoarea, n funcie de originea floral a mierii i de compozia sa, a avut o mare variabilitate n probele de miere analizate, de la o tonalitate de galben transparent la maro. Aceasta a fost, n principal, datorit diversitii tipurilor de miere colectate din diferitele regiuni ale Romniei. Cu ajutorul analizei ANOVA au fost identificate diferene semnificate ntre tipurile de miere n ceea ce privete culoarea la p<0,005 i F=27,11. Pentru evidenierea acestor

22

diferene s-a utilizat diagrama Box-Whisker (figura 6.4). Din aceast diagram reiese c acest parametru reprezint un factor discriminant ntre mierea floral i cea de man.

Figura 6.4. Diagrama Box-Whisker pentru culoare a celor 7 grupuri diferite de miere Mai muli autori au luat n considerare influena granulelor de polen (morfologie i culoare), n ceea ce privete culoarea mierii, n timp ce intensitatea de culoare a mierii se datoreaz pigmenilor, cum ar fi carotenoizii i unele flavonoide. Pentru evidenierea amnunit a rezultatelor s-au calculat parametrii statistici pentru fiecare tip de miere supus analizei (tabelul 6.7). Coninutul de cenu i conductivitatea electric cele mai ridicate le-au avut mierea de man. Aceasta este cunoscut pentru spectrul su mineral vast, dar i pentru potenialul antioxidant cel mai ridicat. Valoarea medie a conductivitii electrice n cazul mierii de salcm (0,183 mS/cm) a fost semnificativ mai mic (p<0,05) dect cea a mierii de man (1,3 mS/cm). Indicele colorimetric n cazul mierii romneti de diferite origini florale a avut o valoare medie de 28,5 mmPfund variind ntre 2 mmPfund (miere de salcm) i 90 mmPfund (miere de man). Conform analizei melisopalinologice a fost identificat o miere floral de Prunus. Aceasta nu a fost reprezentat n tabel deoarece nu reprezint un grup format din mai multe probe. Aceasta a prezentat o umiditate relativ mare (20%), un indice colorimetric destul de ridicat (45 mmPfund) i un pH mediu (3,7). Dup mierea de tei, mierea de Prunus prezint cel mai ridicat coninut de cenu i conductivitatea electric cea mai mare.

23

Tabelul 6.7. Analiza statistic descriptiv a parametrilor fizico-chimici studiai n diferitele tipuri de miere Tip de miere Salcm N Parametri statistici Medie DS Min-Max Limit inf.(95%) Limitsup.(95%) Medie DS Min-Max Limit inf.(95%) Limitsup.(95%) Medie DS Min-Max Limit inf.(95%) Limitsup.(95%) Medie DS Min-Max Limit inf.(95%) Limitsup.(95%) Medie DS Min-Max Limit inf.(95%) Limitsup.(95%) Medie DS Min-Max Limit inf.(95%) Limitsup.(95%) Umiditate (%) 17,5 0,9 16,5 -19,8 17,2 17,7 18,2 1,1 14,9 - 20 17,2 18,4 18,5 1,1 14,9 - 20 18 18,8 22,4 0,7 19,2 -24,5 19,2 19,4 19,2 0,1 16,9 -23,1 3,9 3,9 17,4 0,9 15,8 -18,7 17 17,6 pH 3,8 0,3 3,3 - 4,2 3,7 3,9 4,6 0,4 3,7 - 5,7 4,2 4,6 4 0,4 3,5 - 4,9 3,8 4,1 3,9 0,2 3,6 - 4,1 3,8 4 4 0,4 3,4 - 4,6 3,8 4,2 4,4 0,3 3,8 - 4,8 4,3 4,5 CE (mS/cm) 0,183 0,05 0,121-0,331 0,17 0,19 0,7 0,1 0,5 - 0,9 0,65 0,73 0,26 0,1 0,115-0,551 Cenu (%) 0,05 0,02 0,03 - 0,1 0,04 0,055 0,3 0,05 0,2 - 0,4 0,29 0,31 0,09 0,01 0,08 - 0,12 0,09 0,1 0,17 0,02 0,15 - 0,2 0,16 0,17 0,14 0,02 0,11 - 0,18 0,13 0,15 1,2 0,1 1 - 1,5 1 1,3 Culoare (mm Pfund) 11 0,4 2,0 - 28 9 14 33,5 0,8 24 - 50 28 35 23 0,9 1,0 - 48 21 25 31 0,4 26 - 34 29 32 28 0,9 15 - 45 26 30 88 0,7 86 - 90 87 89

12

Tei

14

Rapi

11

Floareasoarelui

Poliflor

Man

0,454 0,1 0,210-1,070 0,4 0,5 0,4 0,02 0,16 - 0,76 0,38 0,42 1,3 0,05 0,6 - 1,8 1 1,4

6.3.2. Evaluarea parametrilor de caracterizare a prospeimii mierii Activitatea amilazic i coninutul de HMF sunt parametrii care sunt folosii n principal pentru a evalua gradul de prospeime al mierii. Valoarea amilazei variaz foarte mult ntre tipurile de miere analizate, normele legislative permind un minim de 8 pe scara Gothe. n cazul valorilor mai mici, poate fi considerat c mierea a fost supus unui tratament termic (cu excepia mierii cu un coninut sczut de enzime care permite un minim de 3 ID, cu condiia ca valoarea de HMF s fie mai mic de 15 mg/kg).

24

Coninutul amilazei a fost mai mic dect 8 ID n cazul a 5 probe de miere, acestea prezentnd valori ale HMF mai mari de 15 mg/kg (salcm, tei, rapi, poliflor). Se presupune c aceste probe au fost supuse unui tratament termic inadecvat. Cele 3 probe de man au nregistrat cele mai mari valori ale coninutului de HMF. n cazul uneia din probele de salcm, aceasta a fost eliminat din grup datorit coninutului de HMF de 56,2 mg/kg de miere, ceea ce depete cu mult limita maxim admis de standardele n vigoare (att la nivel naional, ct i internaional). Dup eliminarea acestei probe, grupul de salcm a atins un coninut mediu de HMF de 3,8 mg/kg. Dup mierea de man s-a situat mierea de rapi, cu un coninut mediu de HMF de 5,5 mg/kg. Acest lucru se explic prin faptul c unele probe de rapi au fost colectate n anul 2009 i implicit au un coninut mai ridicat n HMF, fiind depozitate o perioad mai mare de timp. n rest , dup cum se observ n grafice, coninutul de HMF s-a meninut constant, prezentnd valori inferioare lui 40 mg/kg, chiar apropiate de zero. Valoarea medie a indicelui amilazic a celor 54 probe de miere luate n lucru a variat ntre 3,5 Gothe i 19,4 Gothe. Media indicelui amilazic pe grupurile de miere a variat ntre 16,7 Gothe pentru mierea de Prunus i 9,5 Gothe pentru mierea de floarea -soarelui. Trei din totalul probelor au fost eliminate ca fiind suspecte de falsificare prin adaos de sirop de zahr dar supuse i unui tratament termic brutal, acestea nregistrnd valori nule (dou probe de tei i una poliflor). O alt enzim cuantificat n prezentul studiu a fost invertaza. Pentru ca o miere s nu fie suspect de falsificare, indicele invertazic poate lua valori n intervalul 4 - 26 IN, ns International Honey Commission propune valori minime ale invertazei n cazul unei mieri de calitate. Toate grupurile de miere s-au ncadrat n norma prevzut de legislaia n vigoare n ceea ce privete activitatea invertazic, cu excepia a 2 probe ce au prezentat valori nule ale activitii acestei enzime. n concluzie, ase probe de miere au prezentat valori aberante ale indicatorilor de prospeime studiai i ca urmare acestea au fost eliminate din grupul de miere supuse analizelor, suspectate ca fiind falsificate prin adaosuri ilicite i/sau supuse unor tratamente termice brutale. 6.3.3. Evaluarea valorii energetice a mierii 6.3.3.1. Spectrul glucidic al mierii S-au identificat i cuantificat prin metode cromatografice ase zaharuri: glucoza, fructoza, zaharoza, maltoza, trehaloza i melezitoza. Zaharurile constituie componentul principal al mierii iar valoarea medie a zaharurilor totale pentru probele de miere analizate a fost 76,5%, intervalul variind ntre 53,2% i 89,7%.

25

Fructoza i glucoza reprezint glucidele majoritare ale mierii de albine, fiind ntotdeauna peste 50% din totalul zaharurilor. n cazul probelor de miere analizate, concentraia medie a fost de 73,2%, avnd o valoare minim de 48,8% i cea maxim de 87,5%. Restul zaharurilor precum maltoza, zaharoza, trehaloza i melezitoza constituie glucidele minoritare ale mierii, acestea prezentnd o valoare medie de 3,2%. De subliniat este faptul c melezitoza i trehaloza au fost identificate n foarte puine probe analizate.

26

Tabelul 6.7. Analizele descriptive ale glucidelor identificate Zaharuri Glucoz [%] Fructoz [%] Zaharoz [%] Maltoz [%] Melezitoz [%] Trehaloz [%] G+F [%] Zaharuri totale [%] F/G G/Ap Analize statistice MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max MedieDS Min - Max Salcm (n=12) 29,741,8 27,26-33,47 40,372,8 19,33-45,46 2,261,51 1,34-5,41 1,920,54 1,19-3,02 0 0 0 0 70,115,20 48,76-74,46 74,29 5,2 53,19-80,83 1,360,15 0,66-1,67 1,70,13 0,45-1,98 Tei (n=14) 33,273,58 24,62-37,26 38,703,08 31,75-45,52 1,470,17 1,33-1,97 1,370,54 0,77-2,20 0 0 0 0 71,976,03 58,10-81,41 74,81 5,95 60,92-83,66 1,170,11 1,03-1,49 1,810,31 1,27-2,41 FloareaRapi (n=11) soarelui (n=4) 37,25,56 38,72.,0 28,81-46,84 36,77-41,68 41,131,84 39,493,05 38,53-43,82 36,54-43,63 1,460,13 1,430,01 1,35-1,80 1,43-1,44 1,210,45 1,270,28 0,70-1,81 1,10-1,70 0 0 0 0 78,325,06 70,79-87,53 81 4,81 73,97-89,74 1,130,20 0,87-1,51 2,030,4 1,41-2,88 0 0 0 0 78,194,79 74,93-85,31 80,9 5,08 77,47-88,45 1,020,06 0,95-1,08 1,740,18 1,55-1,92 Poliflor (n=9) 32,832,21 29,05-36,47 41,635,22 33,5-51,61 1,50,2 1,38-1,97 1,630,35 1,10-2,16 0 0 0 0 74,466,24 62,55-84,45 77,6 6,3 65,3-87,3 1,270,15 1,07-1,57 1,740,25 1,26-2,04 Man (n=3) 28,226,9 21,35-35,18 37,665,45 31,90-42,73 1,820,69 1,41-2,61 1,500,79 0,9-2,39 0,630,57 0-1,10 0,330,58 0-1,0 65,8812,34 53,25-77,91 70,16 5,1 55,8-81,03 1,360,14 1,21-1,49 1,620,36 1,21-1,88 Valoarea p* 0,000 0,054 0,059 0,053 0,000 0,003 0,002 0,004 0,005 0,058

27

Urmtorul glucid ca pondere este glucoza care a prezentat variaii importante, prezentnd o valoare medie de 33,2%. Mierea de salcm a prezentat o valoare medie a acestor dou zaharuri predominante de 70,11% cu o valoare medie a glucozei de 29,74% i a fructozei de 40,37%. n cazul unei singure probe de salcm zaharurile majoritare au prezentat cele mai sczute valori: glucoza fiind de 29,42% i fructoza de 19,33%. Aceast prob a fost singura care a nregistrat cea mai mare valoare a maltozei i anume 3%, iar coninutul de HMF a depit limitele impuse de normele n vigoare fiind de 56,2 mg/kg. Proba a fost supus unui tratament termic brutal , fapt dovedit de concentraia foarte sczuta n fructoz, care a fost transformat n HMF n urma nclzirii la temperaturi ridicate (mai mari de 50C), mai mult aceasta a fost falsificat prin adaos ilicit de sirop de porumb, dovada fiind coninutul ridicat n maltoz. Glucidele minoritare cuantificate (zaharoz, maltoz, trehaloz i melezitoz) au fost prezente n mierea de salcm ntr-o concentraie medie de 4,18% - aceast valoare fiind cea mai ridicat dintre toate tipurile de miere floral analizate. n cazul acestui tip de miere, spectrul glucidelor a fost format din toate glucidele identificate mai puin melezitoz i trehaloz. Coninutul mediu de zaharoz din mierea de salcm a prezentat o valoare medie de 2,26% cu un minim de 1,34% i un maxim de 5,41%. Aceste valori claseaz din nou mierea de salcm ca fiind mierea cu cel mai ridicat coninut de zaharuri minoritare. Mierea cu cel mai ridicat coninut al zaharurilor predominante a fost reprezentat de grupul rapi. Valoarea medie a sumei dintre glucoz i fructoz a fost de 78,33% cu o valoare medie a glucozei de 37,2% i a fructozei de 41,13%. n cazul unei probe de rapi care a prezentat cele mai ridicate valori, coninutul de glucoz a fost de 46,84 %, mult mai mare dect coninutul de fructoz care a prezentat valoarea 40,69%. Aceast prob, ca majoritatea celor de rapi, a prezentat fenomenul de cristalizare i consisten cremoas datorit dimensiunii mici a cristalelor. Concentraia maxim de glucoz detectat n urma acestui studiu pentru mierea romneasc a fost prezent n cazul unei mieri de rapi avnd valoarea 46,84%. Coninutul n glucide minoritare a fost relativ mediu, de 2,67%. Mierea ce a urmat celei de rapi n ceea ce privete coninutul ridicat a l celor dou glucide majoritare a fost mierea de floarea-soarelui. Valoarea medie a sumei dintre glucoz i fructoz a fost de 76,19% cu o valoare medie a glucozei de 38,7% i a fructozei de 39,49%. Proba cu cea mai ridicat valoare n coninut glucidic predominant a prezentat o concentraie a glucozei de 41,62% i a fructozei de 46,84%. n cazul acestui grup, cristalizarea a avut loc n timp, ns cristalele formate au prezentat dimensiuni mari (peste 0,5 mm). Concentraia glucidelor minoritare a avut o valoare medie de 2,7 %, similar cu cea a mierii de rapi studiat. Mierea poliflor a urmat ca i valoare mierii de floarea-soarelui, concentraia medie a glucozei i fructozei fiind de 74,46%. Concentraia maxim de fructoz detectat n urma acestui studiu pentru mierea romneasc a fost prezent n cadrul unei mieri poliflore, avnd valoarea de 51,6%. Mierea poliflor a prezentat un coninut relativ ridicat fa de celelalte tipuri de miere n ceea ce privete coninutul de glucide minoritare , anume 3,13%.

28

Mierea de man a prezentat cele mai sczute valori ale glucidelor majoritare i cele mai ridicate valori ale glucidelor minoritare. Acest tip de miere, fa de mierea floral , a prezentat n spectrul glucidic toate zaharurile analizate. Spre exemplu, melezitoza a fost detectat doar n mierea de man, prezentnd o valoare medie de 0,63%. Valoarea medie a sumei dintre glucoz i fructoz a fost de 65,88%, cu o valoare medie a glucozei de 28,22% i a fructozei de 37,66%.

Figura 6.7. Diagrama Box-Whisker pentru coninutul de zaharuri totale a celor 7 grupuri diferite de
miere

6.3.3.2. Coninutul n proteine i lipide Coninutul mediu de proteine al probelor de miere analizate a fost de 0,66% prezentnd variaii n intervalul 0,25%, n cazul unei mieri de rapi, i 1,3%, aparinnd unei mieri de man. Media coninutului proteic pe grup de miere a prezentat variaii importante dup cum urmeaz: miere de man (1,05%), miere de tei (0,86%), miere de Prunus (0,85%), miere de floarea-soarelui (0,72%), miere poliflor (0,66%), miere de salcm (0,52%), miere de rapi (0,42%). Coninutul proteic, dei este prezent n concentraii joase, a prezentat variaii ntre tipurile de miere analizate. Astfel, conform analizei de varian ANOVA, mierea de man a prezentat diferene semnificative (p<0,05) fa de tipurile de miere floral. Coninutul de lipide din miere depinde n primul rnd de urmele de cear pe care aceasta le poate conine. n orice caz, aceast valoare este ntotdeauna foarte aproape de zero. n cazul mierii romneti supuse analizei, coninutul lipidic a prezentat o valoare medie de 0,03%, cu un minimum de 0 (pentru majoritatea probelor) i un maximum de 0,35% (pentru o prob de rapi). Lipidele au putut fi cuantificate n 11 % din totalul probelor (6 probe). Nu s-au gsit diferene semnificative pentru coninutul lipidic ntre tipurile de miere analizate.

29

6.3.3.3. Valoarea energetic a mierii romneti Valoarea caloric a mierii se bazeaz pe coninutul de glucide, grsimi i proteine, n principal. Variaiile n compoziia mierii pentru aceti compui influeneaz n mod direct valoarea energetic. Valoarea caloric medie a fost de 309 kcal/100 g, cu valori minime i maxime cuprinse n intervalul 214,1 i 360,4 g kcal/100g. Intervalul de ncredere de 95% pentru medie s-a situat ntre 280,8 i 320,8 kcal/100g. Diferene semnificative (p<0,05) pentru valoarea caloric au prezentat grupurile de salcm, Prunus i man, cu cele mai sczute valori medii fa de mierea de rapi i cea de floarea-soarelui. Acest fapt este datorat coninutul ridicat de glucide din aceste dou tipuri de miere. Mierea de man, fa de mierea floral, a nregistrat cea mai mic valoare medie, de 284,8 kcal/100g, acest parametru putnd discrimina mierea floral de cea de man.

Tabelul 6.9. Valoarea energetic (Kcal/100g) calculat pentru tipurile de miere analizate
Valoare energetic (kcal/100g) Tip miere Salcm Tei Rapi Floareasoarelui Prunus Poliflor Man N 12 14 11 4 1 9 3 Medie 299,4 303,1 326 326,5 287,1 313,1 284,8 DS 0,9 0,7 0,6 0,6 0,9 1 Min 214,1 250,2 297,1 311,7 266,3 227,8 Max 325,2 337,8 360,4 356,5 352,1 327,1 Lim inf-lim sup (95%) 290,2-300,6 300,4-308,4 320,8-328,2 321,4-329,8 305,2-316,6 278,8-292,6

6.4. CONCLUZII Mierea testat a prezentat un grad de prospeime i o calitate corespunztoare. Doar apte probe au avut un coninut de umiditate de peste 20%, care este limita stabilit de ctre standardul de calitate de miere pentru acest parametru. Umiditatea fiind unul dintre parametrii care ofer informaii despre calitatea mierii, n special existena sau nu a unei posibile fermentaii. Un alt parametru important, care, de data aceasta, nu doar caracterizeaz diferite tipuri de miere, ci informeaz asupra autenticitii sursei florale, este conductivitatea electric. Astfel, n cazul unei mieri monoflorale, conductivitatea electric are valori inferioare lui 0,8 mS/cm, n timp ce mierea de man nregistreaz doar valori mai mari dect 0,8 mS/cm. Variaia pH-ului s-a situat n intervalul 3,8 i 4,6, respectnd cerinele standardelor europene i internaionale.

30

Probele de man (n=3) au nregistrat cele mai mari valori ale coninutului de HMF. Pe locul al 2 lea, dup mierea de man, s-a situat mierea de rapi cu un coninut mediu de HMF de 5,5 mg/kg. n cazul uneia din probele de salcm, aceasta a fost eliminat din grup datorit coninutului de HMF de 56,2 mg/kg de miere, ceea ce depete cu mult limita maxim admis de standardele n vigoare. Toate grupurile de miere s-au ncadrat n norma prevzut de legislaia n vigoare n ceea ce privete indicele invertazic. ns trebuie subliniat faptul c n cazul unei probe de tei, valoarea indicelui invertazic a depit cu mult limita legal fiind , de 33,6 IN (243 U/kg). Acest fapt a condus ulterior la eliminarea acestei probei din grupul de tei supus analizelor, considerndu-se ca fiind supus unui tratament termic brutal. Media indicelui amilazic pe grupurile de miere a variat ntre 16,7 U Gothe pentru mierea de Prunus i 9,5 U Gothe pentru mierea de floarea-soarelui, respectnd legislaia n vigoare. Trei din totalul probelor au fost eliminate ca fiind suspecte de a fi falsificate prin adaos de sirop de zahr dar i supuse unui tratament termic brutal, acestea nregistrnd valori nule (doua probe de tei i una poliflor). Carbohidraii sunt componentele majore nutritive care ofer cea mai mare valoare energetic mierii, aceasta situndu-se n intervalul 214,1 kcal/100g pentru proba de salcm suspectat de a fi falsificat i 360,4 kcal/100g pentru o miere de rapi. Glucidele cuantificate (fructoza, glucoza, zaharoza, maltoza, trehaloza i melezitoza), ajung la o valoare medie de 76,5%. Mierea de man a avut cel mai sczut coninut de monozaharide, ns aceasta a prezentat cel mai ridicat nivel de oligozaharide. Coninutul mediu de lipide este de 0,01%, acesta nu prezint nicio dependen fa de originea botanic sau geografic. Coninutul mediu al proteinelor prezente n mierea din Romnia a fost de 0,66% .

CAPITOLUL 7. EVOLUIA N TIMP A COMPORTAMENTULUI REOLOGIC AL MIERII DE ALBINE ANALIZATE

7.2. MATERIALE I METODE n prezentul studiu s-au utilizat 54 de probe de miere de diferite origini florale dintre care: 26 de probe din Moldova, 13 probe din Muntenia, 12 probe din Transilvania i 3 probe din Dobrogea. Tehnica de analiz Proprietile reologice dinamice i comportamentul la curgere al probelor de miere au fost determinate cu reometrul TA AR 2000 (TA Instruments Inc., New Cattle, DE, USA), utiliznd o geometrie paralel cu diametrul de 40 mm i unghiul de 2 iar distana dintre cele dou plci (geometrie i placa Peltier) a fost setat la 1000 m. Temperatura a fost reglat cu ajutorul unei bi de ap recirculant JULABO AWC100 i un sistem Peltier. Datele

31

experimentale ale msurtorilor reologice au fost obinute cu ajutorul unui program de calcul TA Data Analysis software V 4.8.3. n prima parte a studiului s-au aplicat teste de dinamic oscilatorie, urmnd ulterior s fie evaluat comportamentul mierii de albine la curgere pentru diferite temperaturi i ntr un domeniu vast de viteze de deformare. De obicei proprietile vscoelastice ale unui material sunt independente de deformare pn la un nivel critic de deformare. 7.2.1. Testul de cretere progresiv a deformrii (engl. Strain Sweep Test, baleiaj de deformare) 7.2.2. Testul de cretere progresiv a frecvenei (engl. Frequency Sweep Test, baleiaj de frecven) 7.2.3. Testul de curgere n trepte (engl. Flow Step) 7.2.4. Testul de cretere progresiv a temperaturii 7.2.5. Metode statistice de prelucrare i interpretare a rezultatelor experimentale Analiza de clusterizare ierarhic (Cluster analysis) Analiza de varian dispersional ANOVA 7.3. REZULTATE SI DISCUII Avnd n vedere importana tot mai mare a calitii n etape precum manipularea, depozitarea, procesarea (centrifugarea fagurilor, filtrarea mierii), controlul de calitate i analiza senzorial a mierii, s-a realizat evoluia n timp a comportamentului reologic prin aplicarea a trei determinri. Primul test reologic aplicat a fost testul de baleiaj de deformare n urma cruia a fost obinut amplitudinea parametrului tan (G''/G'), aceasta reflectnd puterea forelor coloidale existente. n cazul n care tan este subunitar, se nelege c particulele sunt aglomerate datorit forelor coloidale iar sedimentarea poate aprea cu uurin. n prezentul studiu tan a nregistrat valori ntre 55 i 161, lucru ce demonstreaz faptul c particulele intermoleculare ale mierii sunt neasociate, fr posibile aglomerri sau sedimentri, acest fapt fiind raportat i de ctre Franck, n cercetrile sale. Cu ajutorul celei de-a doua metod, baleiajul de frecven, s-au determinat valorile lui G' i G'' i unghiul n funcie de frecvena aplicat. S-a utilizat o frecven ntre 0,4775 47,75 Hz echivalentul lui 3 - 300 rad/s. Modulul vscos G'' (modul de pierdere a energiei) a nregistrat valori mult mai mari dect cel elastic G' (modul de nmagazinare a energiei) determinnd astfel caracterul fluid al mierii, acestea clasndu-se n categoria fluidelor vscoase att n cazul analizei aplicate n 2010, ct i n 2011, asupra acelorai probe de miere.

32

Se poate observa n figura 7.3 urmtoarea ordine descresctoare n ceea ce privete modulul de vscozitate pentru fiecare grup de miere supus analizei n anul 2010: man, salcm, rapi, poliflor, floarea-soarelui i tei. De asemenea, este de remarcat suprapunerea, ca i valori a lui G'', n cazul mierii de rapi i cea poliflor (3155 respectiv 3245 Pa). Valorile modulului de vscozitate cele mai ridicate le-a nregistrat mierea de man (4220 Pa), n timp ce mierea de tei a avut cele mai sczute valori (1217 Pa). La un prim examen vizual, mierea de man i cea de salcm au prezentat cea mai ridicat vscozitate, pe cnd cea de rapi a prezentat fenomenul de cristalizare cu granule foarte fine. Se tie c mierea de rapi poate cristaliza direct n fagure dac nu este extras la timp, acest fapt datorndu-se coninutului de glucide destul de ridicat (n cazul prezentului studiu , n medie 37,2% glucoz i 41,13% fructoz). n cazul aceleiai analize, ns dup un an i jumtate, s-au obinut rezultate edificatoare care au confirmat faptul c mierea de albine este un aliment viu. Se observ din figura 7.4 o cretere a modulului de vscozitate de aproape 2 ori comparativ cu G'' al probelor de miere analizate n anul 2010. Modificarea vscozitii n cazul probelor de miere analizate n acest studiu la diferen de 18 luni sugereaz prezena unor transformri continue att la nivel molecular ct i structural, sub aspect fizico-chimic i biochimic. Aceast afirmaie este ntrit tiinific prin studiul diferiilor parametrii fizico -chimici care au condus la aceast observaie, cum ar fi: spectrul glucidic analizat prin tehnici moderne cromatografice, dar i activitatea enzimatic (amilazic, invertazic) a probelor de miere. Se observ ordinea descresctoare, cu unele modificri privind G'', a unor grupuri de miere: man, salcm, poliflor, tei, rapi i floarea-soarelui. Valorile lui G'' au fost cele mai ridicate n cazul mierii de man (6990 Pa), pe cnd mierea de floarea-soarelui, de aceast dat, a nregistrat cele mai sczute valori (1645 Pa). De asemenea la examenul vizual n ceea ce privete mierea de man, vscozitatea acesteia a fost destul de crescut (fr prezena vreunui fenomen de cristalizare), pe cnd mierea de floarea-soarelui cristalizase puternic, prezentnd o granulaie avansat. Mierea de rapi a prezentat un comportament reologic special fa de restul probelor de miere analizate, G'' s-a modificat n cazul acesteia de la o valoare maxim de 3155 Pa (n anul 2010) la o valoare maxim de 1737 Pa (2011). S-a observat c mierea de rapia este singura din grupul celor studiate sub aspect reologic care a prezentat un modul de vscozitate mult mai sczut, dup un an i jumtate, comparativ cu celelalte grupuri, care au prezentat o cretere semnificativ privind vscozitatea. n tot acest timp, au loc procese de transformare continu a zaharurilor, dar i a enzimelor, fapt ce explic existena unei corelaii ntre zaharuri i vscozitate chiar i dup 1 an i jumtate de la extragerea mierii din fagure. Grupul mierii de rapi a fost singurul din acest punct de vedere care a prezentat cele mai ridicate valori ale glucidelor identificate i cuantificate prin HPAEC-PAD: glucoz, fructoz, zaharoz, maltoz, trehaloz, melezitoz.

33

Valoarea medie a sumei dintre glucidele majoritare (glucoz i fructoz) n cazul mier ii de rapi, s-a situat ntre minimum 70,79 maximum 87,53%. 7.3.1. Profilul reologic al mierii de salcm n urma analizei denumit baleiaj de frecven s-a observat valoarea destul de ridicat a modulului vscos G'' (cu un maxim de 3987 Pa n anul 2010 i 5545 Pa n anul 2011), comparativ cu modulul de elasticitate care a nregistrat valori medii ntre 7,99 Pa (anul 2010) i 72 Pa (cea mai mare valoare medie dintre toate tipurile de miere analizate n anul 2011). Prezena elasticitii ridicate n cazul mierii de salcm se poate datora unei cantiti aproape duble de fructoz (valoarea medie 42,3 %) comparativ cu glucoza (valoarea medie 29,7%). Acest fenomen apare predominant n cazul mierii de salcm. n cea de-a doua parte a studiului s-au trasat reogramele (curbe de curgere) probelor de salcm la diferite temperaturi: 10C, 20C, 30C i respectiv 40C, pentru anul 2011, iar pentru anul 2010, doar 20C, 30C i 40C. S-a observat ulterior c n cazul temperaturii de 10C, structura molecular a unor probe de miere a fost distrus la viteza de forfecare utilizat (care a crescut de la 0,1 la 500 forfecri/s). Mierea de salcm analizat n anul 2010 a prezentat comporta ment reologic newtonian, dovada fiind reprezentat de suprapunerea curbelor de curgere la ncrcare i descrcare. Rspunsul materialului la gradientul de deformare aplicat cu o vitez de forfecare de la 0,1 la 500 forfecri/s i viceversa a urmat acelai traseu, fapt ce confirm existena memoriei materialului studiat. La temperatura de 20C, valoarea maxim a tensiunii de deformare a fost de 3381 Pa la ncrcare i 4021 Pa la descrcare. n timp ce, la temperatura de 40C, valoarea tensiunii de deformare a sczut pn la 0,09 Pa la ncrcare, respectiv 121,7 Pa la descrcare. Att vscozitatea ct i tensiunea de deformare scad odat cu creterea temperaturii datorit unei dizolvri ale cristalelor de zahr din miere. Mierea de salcm analizat n anul 2011 a prezentat comportament reologic diferit, i anume nenewtonian dovada fiind apariia buclei de histerezis care confirm prezena fenomenul de tixotropie. Comportarea tixotrop este evideniat n figura 7.6, manifestndu-se printr-o descretere izoterm a vscozitii la creterea progresiva a vitezei de forfecare , ca urmare a destucturrii probelor analizate. La descreterea progresiva a vitezei de forfecare are loc o restructurare a mierii. Dar viteza de restructurare este mai mic dect cea de destructurare motiv pentru care reogramele probelor de salcm prezinta bucle de histerezis. La temperatura de 20C valoarea maxim a tensiunii de deformare a fost de 4256 Pa la ncrcare i 4195 Pa la descrcare. n timp ce, la 40C, valoarea tensiunii de deformare a sczut pn la 0,1 Pa la ncrcare, respectiv 0,19 Pa la descrcare.

34

n figurile 7.5 i 7.6 poate fi observat diferena comportamentului reologic al mierii de salcm dup 1 an i jumtate, fapt datorat spectrului polenic i spectrului glucidelor. Acest mecanism de destructurare-restructurare al mierii de salcm este interpretat de Smanalieva i Senge [22] ca fiind datorat solubilitii mono- i dizaharidelor i gradului de saturaie al soluiilor ce se formeaz n intervalul de temperatur la care au avut loc analizele. Juszczak i Fortuna [23] au studiat comportamentul reologic al unor tipuri de miere (salcm, tei, hric, rapi, poliflor i man) din Polonia, i au conchis c toate probele de miere au manifestat comportament newtonian, fr apariia vreunui fenomen de tixotropie sau dilatan. De asemenea, Lazaridou i colab. [21] au evaluat comportamentul reologic dar i proprietile termale ale mierii de albine (man i floral). Din nou, s-a nregistrat un caracter newtonian specific tuturor probelor supuse analizei. 7.3.2. Profilul reologic al mierii de tei Din acest grup au fcut parte 14 probe de miere de tei din diferite regiuni ale Romniei, predominnd zona Moldovei. n urma analizei denumit baleiaj de frecven se observ valoarea destul de ridicat a modulului vscos G'' (cu un maxim de 1217 Pa n anul 2010 i 3925,4 Pa n anul 2011) comparativ cu modulul de elasticitate care a nregistrat valori medii ntre 13,8 Pa (anul 2010) i 33,3 Pa (anul 2011). Din reograma mierii de tei analizat n anul 2010 se observ prezena comportamentului reologic newtonian, dovada fiind suprapunerea curbelor de curgere la ncrcare i descrcare. Rspunsul materialului la deformarea aplicat cu o vitez de forfecare de la 0,1 la 500 1/s i viceversa a urmat acelai traseu, fapt ce confirm existena memoriei materialului studiat (att n cazul mierii de tei, ct i a celei de salcm). La temperatura de 20C, valoarea maxim a tensiunii de deformare a fost de 845,9 Pa la ncrcare i 845,4 Pa la descrcare (mult mai sczut comparativ cu tensiunea de deformare a mierii de salcm). n timp ce, la temperatura de 40C, valoarea tensiunii de deformare a sczut pn la 0,03 Pa la ncrcare, respectiv 0,04 Pa la descrcare. Mierea de tei analizat n anul 2011 a prezentat comportament reologic diferit, i anume nenewtonian, formnd bucl de histerezis. Comportarea tixotrop a mierii pstrate 18 luni este evideniat n figura 7.8, manifestndu-se printr-o descretere izoterm a vscozitii la creterea progresiva a vitezei de forfecare, ca urmare a destucturrii probelor analizate (ca i n cazul mierii de salcm). La descreterea progresiva a vitezei de forfecare are loc o restructurare a mierii.

35

7.3.3. Profilul reologic al mierii de rapi n urma analizei denumit baleiaj de frecven s-a observat o valoare destul de ridicat a modulului vscos G'' (cu un maxim de 3155 Pa n anul 2010 i 1737 Pa n anul 2011) comparativ cu modulul de elasticitate care a nregistrat valori medii ntre 222,9 Pa (anul 2010) i 16,5 Pa (anul 2011). Mierea de rapi analizat n anul 2010 a prezentat proprieti reologice diferite fa de cele studiate anterior, fiind tipul de miere care a manifestat comportament nenewtonian. Se poate observa prezena curbei de tixotropie format la temperatura de 20C, ceea ce include mierea de rapi n categoria fluidelor nenewtoniene. Acest fapt poate fi explicat att din perspectiv palinologic, ct i a compoziiei chimice. De exemplu, n prezentul studiu, n spectrele polenice ale mierii de rapi, tipul Brassica napus a fost hiperreprezentat, fiind prezent n concentraii foarte ridicate comparativ cu celelalte tipuri de miere (80-95%). Abundena polenului de rapi a condus ulterior la concluzia c densitatea polenic influeneaz concentraia de zaharuri din miere, deoarece mierea de rapi a nregistrat cele mai ridicate valori ale zaharurilor, ajungnd pn la 90%. Mierea de rapi analizat n anul 2011 s-a comportat ca un fluid nenewtonian. Prezena buclei de histerezis din figura 7.10 confirm apariia fenomenului de tixotropie. n acest caz ns, mierea de rapi posed un comportament diferit fa de celelalte 5 tipuri de miere studiate. Se poate observa, cum la temperatura de 10C att la creterea progresiv a vitezei de forfecare ct i la descretere, structura molecular a mierii de albine este distrus, refcndu-se foarte lent. n acest caz, o vitez de forfecare mai mare de 180 1/s conduce la destructurarea total a mierii de rapi, n condiii similare. n schimb, n cazul temperaturii de 20C, probele de rapi analizate prezint o bucl perfect de histerezis, valoarea maxim a tensiunii de deformare fiind n acest caz de 1426 Pa la ncrcare i 1385 Pa la descrcare (valori mult mai sczute fa de cele din anul 2010). Aceste diferene ntre valorile tensiunilor de deformare obinute n 2010 i 2011 ne conduc la concluzia c deformarea mierii de rapi, ca rspuns asupra unui efort aplicat din exterior, scade odat cu trecerea timpului. Comportamentul nenewtonian al mierii de rapi a fost raportat de diferii cercettori n domeniu. 7.3.4. Profilul reologic al mierii de floarea-soarelui n urma analizei de baleiaj de frecven, s-a observat valoarea destul de ridicat a modulului vscos G'' (cu un maxim de 2510 Pa n anul 2010 i 1565 Pa n anul 2011) comparativ cu modulul de elasticitate care a nregistrat valori medii ntre 13,8 Pa (anul 2010) i 47,5 Pa (anul 2011). Astfel n anul 2010, probele de floarea-soarelui analizate au prezentat la T=20C bucle de histerezis, ns cu o arie nesemnificativ de mic. n acest caz, acest tip de miere a fost introdus n categoria fluidelor newtoniene.

36

Dup un an i jumtate, reogramele (figura 7.12) evideniaz caracterul nenewtonian a mierii de floarea-soarelui, manifestndu-se prin apariia fenomenului de tixotropie att la 10C, 20C i, foarte puin vizibil, la temperatura de 30C. Acest tip de miere, a urmat mierii de rapi, cu cel mai mare coninut de zaharuri. Diferena fa de mierea de rapi este c mierea de floarea-soarelui a cristalizat, prezentnd granulaie avansat. 7.3.5. Profilul reologic al mierii poliflorale n urma primei proceduri aplicate (baleiaj de frecven), s-a observat valoarea destul de ridicat a modulului vscos G'' (cu un maxim de 3245 Pa n anul 2010 i 4820 Pa n anul 2011) comparativ cu modulul de elasticitate care a nregistrat valori medii ntre 60,4 Pa (anul 2010) i 29,5 Pa (anul 2011). Astfel n anul 2010, probele de miere poliflor analizate au prezentat la t=20C comportament newtonian. Dup 18 luni, reogramele au evideniat caracterul nenewtonian al mierii poliflorale, manifestndu-se prin prezena buclelor de histerezis la 10C, 20C i, foarte puin vizibil, la temperatura de 30C. De remarcat a fost faptul c n cazul mierii poliflore, tensiunea de deformare la 20C a prezentat valori apropiate pentru anul 2010 (cu o valoare medie de 1963 Pa pentru curba de ncrcare) i respectiv 2011 (cu o valoare medie de 2566 Pa la ncrcare). Mierea poliflor analizat a prezentat un comportament nenewtonian n anul 2011, transformrile ce au avut loc la nivel molecular fiind destul de mici i implicit deformarea aprut n urma aplicrii unei fore exterioare. 7.3.6. Profilul reologic al mierii de man n urma analizei melisopalinologice, din ntregul grup de probe, doar trei s-au dovedit a aparine mierii de man, datorit prezenei indicatorilor de man (hife, alge etc) n preparatele microscopice. Acest tip de miere a prezentat cele mai ridicate valori ale modulului de vscozitate studiat prin procedura de baleiaj de frecven. Astfel, modulul de vscozitate a nregistrat o valoare maxim de 4220 Pa n anul 2010 i 6990 Pa n anul 2011 comparativ cu modulul de elasticitate, care a nregistrat valori medii ntre 64 Pa (anul 2010) i 82,3 Pa (anul 2011). Mierea de man analizat n anul 2010 a prezentat comportament reologic newtonian (figura 7.14). Rspunsul materialului la deformarea aplicat cu o vitez de forfecare de la 0,1 la 500 1/s i viceversa confirm, din nou, existena memoriei materialului studiat (n cazul mierii de tei, salcm i man). Mierea de man analizat n anul 2011 a prezentat comportament reologic diferit, i anume nenewtonian dovada fiind apariia buclei de histerezis care confirm prezena fenomenul de tixotropie (figura 7.15).

37

De asemenea, la temperatura de 20C valoarea maxim a tensiunii de deformare a fost de 4523 Pa la ncrcare i 4471 Pa la descrcare. n timp ce, la temperatura de 40C, valoarea tensiunii de deformare a sczut pn la 663 Pa la ncrcare, respectiv 663 Pa la descrcare. Diferena de vscozitate dintre probele studiate a fost explicat prin urmtorii parametrii: umiditate, temperatur, coninut polenic i zaharuri, grad de cristalizare. 7.3.8. Prelucrarea statistic a rezultatelor Privind prelucrarea statistic a rezultatelor s-au utilizat dou analize (Analiza de varian unifactorial ANOVA i Analiza de clusterizare ierarhic-metoda celui mai apropiat vecin), n scopul obinerii unor diferenieri, respectiv clasificri, a tipurilor de miere de diferite origini botanice. Din figurile 7.19 i 7.20 se observ clasificarea probelor de miere analizate n funcie de valoarea vscozitii nregistrate a fost observat. Iniial s-au obinut dou clase principale diferite n care clusterul mparte: n prima clas- mierea de man (deoarece aceasta a nregistrat cea mai mare valoare n anul 2010, 24,3 Pa.s), iar din cea de-a doua clas, mierea poliflor i cea monofloral (Figura 7.19). Mierea de floarea-soarelui a fost singura care nu a format un grup specific, valorile acesteia aparinnd mierii de salcm i rapi. n funcie de aceast clasificare bazat pe algoritmii matematici ai metodei celui mai apropiat vecin putem prezice originea botanic a mierii n funcie de vscozitatea acesteia.

Figura 7.19. Reprezentarea grafic a clusterului format n funcie de vscozitatea nregistrat de probele de miere analizate n anul 2010 (1-salcm, 2- tei, 3-rapi, 4- floarea-soarelui, 5poliflor, 6- man)

38

n figura 7.20 se observ clasificarea probelor de miere n funcie de vscozitatea obinut n anul 2011. Se remarc, de aceast dat, o clasificare precis n ase grupuri diferite de miere.

Figura 7.20. Reprezentarea grafic a clusterului format n funcie de vscozitatea nregistrat de probele de miere analizate n anul 2011 (1-salcm, 2- tei, 3-rapi, 4- floareasoarelui, 5-poliflor, 6- man)

De aceast dat, clusterul formeaz dou clase, i anume: Clasa 1 n care intr mierea de man i cea poliflor. Clasa 2 creia i aparin doar tipurile de miere monoflorale.

Ordinea descresctoare a vscozitii grupurilor de miere formate n dendogram este: man, poliflor, floarea-soarelui, rapi, salcm i tei. n aceleai condiii experimentale (procedur, parametrii utilizai, echipament), poate fi identificat originea botanic a unei mieri n funcie de vscozitatea acesteia. Pentru verificarea acurateii rezultului obinut se poate recurge ulterior i la stabilirea spectrului polenic al mierii supuse analizei. Pentru a evalua diferenele statistice ntre diferitele tipuri de miere a fost utilizat metoda ANOVA, la un nivel de ncredere stabilit la 95%. Diferenele au fost considerate ca semnificative statistic la o valoare p<0,05. Analiza furnizeaz o testare a ipotezei c fiecare grup de miere este derivat din aceeai distribuie de probabilitate de baz fa de ipoteza c distribuia de probabilitate de baz nu este aceeai pentru toate eantioanele.
39

7.4. CONCLUZII n urma evoluiei n timp a comportamentului reologic, probele de miere analizate au prezentat un modul de vscozitate (G'') mult mai mare dect modulul de elasticitate (G'). Acest fapt claseaz mierea de albine n categoria fluidelor vscoase (comportament obinut pentru probele de miere analizate att n anul 2010, ct i n 2011). Ordinea descresctoare a probelor de miere supuse analizei n anul 2010 , n funcie de G'', a fost: man, salcm, rapi, poliflor, floarea-soarelui i tei. Mierea de man a nregistrat valoarea maxim pentru modulul de vscozitate, pe cnd mierea de tei a prezentat cea mai joas valoare. n cazul aceleiai analize, ns dup un an i jumtate, s-a observat o cretere dubl a modulului de vscozitate comparativ cu G'' al probelor de miere analizate n anul 2010. Ordinea descresctoare privind G'' a fost: man, salcm, poliflor, tei, rapi i floareasoarelui. Modificarea vscozitii n cazul probelor de miere analizate la diferen de 1 an i jumtate sugereaz prezena unor transformri continue la nivel molecular i structural , sub aspect fizico-chimic i biochimic ce au loc n miere. Aceast afirmaie este ntrit tiinific prin studiul unor diferii parametri fizico-chimici care au condus la aceast observaie, cum ar fi: coninutul de ap, spectrul glucidic analizat prin tehnici moderne cromatografice, dar i activitatea enzimatic (amilazic, invertazic) a probelor de miere. n cea de-a doua parte a studiului au fost evaluate curbele de curgere la diferite temperaturi. Astfel, n urma analizei aplicate n anul 2010 toate tipurile de miere au prezentat comportament newtonian, cu excepia probelor de rapi i floare-soarelui (au prezentat fenomenul de tixotropie). Acestea s-au comportat precum fluidele nenewtoniene, fapt datorat concentraiei ridicate de zaharuri din compoziie dar i a unor procente mari de polen n spectrul lor polenic (tipul Brassica napus, respectiv Helianthus annuus). n cazul tipurilor de miere care au manifestat un comportament newtonian acesta s-a datorat vscozitii. Datorit vscozitii iau natere fore de frecare intern care interzic deformarea; n timp, s-a stabilit un echilibru ntre forele de solicitare exterioar i forele interioare de frecare vscoas, ceea ce a determinat curgerea cu reopant constant. n urma evalurii reogramenlor dup un an i jumtate de la prima analiz, se observ prezena comportamentului nenewtonian al tuturor probelor de miere luate n lucru. Mierea de floarea-soarelui care a prezentat comportament nenewtonian att n anul 2010, ct i n anul 2011, a avut cel mai ridicat coninut de zaharuri, dup mierea de rapi, iar n anul 2011 probele erau cristalizate cu granule de dimensiuni mari (peste 0,5 mm). Structura mierii fiind deja modificat, glucoza cristaliznd la un nivel foarte avansat, s-a demonstrat existena corelaiei dintre: tipul polenic, compoziia chimic (spectrul glucidelor, dar i al enzimelor) i comportamentul reologic. Factorii care conduc la acelai comportament reologic ca al mierii de floarea -soarelui, pentru mierea de rapi, sunt: cristalizarea (n cazul mierii de rapi are loc o cristalizare timpurie, uneori chiar n fagure, dar cu granule fine prezentnd o consisten cremoas), coninutul ridicat n zaharuri (n special glucoz), procentajul tipului de polen dominant ridicat, coninutul de ap.

40

S-a remarcat prezena unei scderi a vscozitii i a tensiunii de deformare odat cu creterea temperaturii (10C, 20C, 30C i 40C). Pentru a demonstra corelaia dintre vscozitate i temperatur s-a recurs la aplicarea modelelor matematice (Arrhenius i Herschel Bulkley). Creterea vscozitii mierii n timp a prezentat urmtoarea evoluie: n anul 2010 , valoarea maxim a vscozitii a fost nregistrat de mierea de man, pe cnd n anul 2011 , aceast valoare a crescut destul de mult n cazul mierii poliflorale. n urma aplicrii analizei Cluster bazat pe algoritmi matematici a putu fi prezis originea botanic a tipurilor de miere n funcie de vscozitate. Prin aplicarea analizei statistice multivariate (Cluster analysis), s-au format 6 grupuri diferite de miere n funcie de vscozitatea acestora. Probele de miere analizate au fost clasificate dup metoda celui mai apropiat vecin n funcie de distanele euclidiene calculate cu ajutorul software-ului. Astfel, ordinea grupurilor formate a fost: man, poliflor, floareasoarelui, rapi, salcm i tei. Pentru a verifica diferenele existente ntre grupurile formate de miere s -a aplicat analiza de varian dispersional (ANOVA). S-a constatat c valoarea lui p a testului Fstatistic a fost mai mic de 0,05, astfel a existat o diferen semnificativ ntre grupurile de miere formate n ceea ce privete vscozitatea acestora, la un nivel de ncredere de 95,0%.

CAPITOL 8. STUDIUL ACTIVITII ANTIOXIDANTE A MIERII ROMNETI ANALIZATE

8.2. MATERIALE I METODE 8.2.1.Material de lucru n prezentul studiu s-au utilizat 54 probe de miere de diferite origini florale dintre care 3 probe de miere de man, de pe teritoriul Romniei. Probele au fost achiziionate direct de la apicultori sau de la ACA care au garantat pentru originea lor botanic. 8.2.2. Determinarea coninutului total de polifenoli prin metoda Folin-Cioclteu Coninutul de polifenoli totali s-a determinat pe baza metodei Folin-Cioclteu propus de Singleton i Rossi [19] i adoptat ulterior de Singleton i colab. [20]. innd cont de cantitatea de miere luat n lucru, rezultatele s-au exprimat n mg acid galic/100g miere.

41

Tabelul 8.2. Ecuaia dreptei etalon trasat cu acid galic pentru determinarea polifenolilor totali
Ecuaia dreptei etalon Interval de concentraii R2 (acid galic) (mg/mL) A = 84,64C + 0,0152 0,998 0,02-0,2 A-Absorban (nm), C-concentraie (mg/mL)

8.2.3. Determinarea coninutului total de flavonoide Pentru trasarea dreptei etalon cu quercetin s-au utilizat diferite volume (mL) de soluie standard de quercetin. Coninutul total de flavonoide s-a determinat prin metoda propus de Dowd i adaptat ulterior de Arvouet-Grand i colab. [23]. Coninutul de flavonoide s-a exprimat n mg quercetin/100g miere.

Tabelul 8.4. Ecuaia dreptei etalon trasat cu quercetin la determinarea flavonoidelor

Ecuaia dreptei etalon Interval de concentraii R2 (quercetin) (mg/mL) A = 73,66C + 0,0009 0,999 0,00008-0,008 A-Absorban (nm), C-concentraie (mg/mL)

8.2.4. Determinarea activitii antiradicalice cu DPPHActivitatea antiradicalic a mierii de albine a fost determinat cu ajutorul metodei de decolorare a reactivului DPPH. Aceast metod implic msurarea capacitii antiradicalice a antioxidanilor din miere prin captarea radicalului liber, stabil 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl, prezentnd o intens culoarea violet [24,25]. Modul de calcul utilizat a fost: RSA%= (AB-AP)/AB x 100 n care AB reprezint absorbana probei martor msurat la 520 nm dup 30 minute, AP reprezint absorbana probei de miere citit la 520 nm dup 30 minute, RSA- activitatea de ndeprtare a radicalilor liberi. 8.2.5. Determinarea indicelui de oxidare Indicele de oxidare (IO) reprezint timpul de decolorare, n secunde, a unei soluii de permanganat de potasiu 0,1 N, prin aciunea compuilor antioxidani ai mierii. Pentru
42

determinarea indicelui de oxidare s-a utilizat metodologia propus de Bedascarrasbure [26] pentru propolis, cu unele modificri. 8.2.6. Tehnici statistice n ceea ce privete prelucrarea statistic a rezultatelor obinute n urma determinrilor s-au utililizat dou metode statistice precum: ANOVA i Clusterizarea ierarhic (Cluster analysis). Pentru a descrie posibile corelaii ntre metodele diferite de determinare a activitii antioxidante s-a aplicat o analiz de corelaie bivariat canonic, iar pentru a evidenia diferenele dintre grupurile de miere s-au utilizat reprezentrile grafice Box-Whisker. 8.3. REZULTATE I DISCUII 8.3.1. Evaluarea coninutului total de polifenoli Coninutul de polifenoli n probele de miere analizate a nregistrat o variaie semnificativ. Cel mai sczut coninut de polifenoli l-a prezentat una din probele de rapi (4,5 mg/100g miere), iar cel mai ridicat coninut a aparinut unei mieri de man (98,1 mg/100g miere). Grupul mierii de salcm a reprezentat tipul de miere cu cel mai sczut potenial antioxidant, acesta nregistrnd valori minime de 9,7 mg/100g miere i maxime de 31,4 mg/100g miere. Studii recente prezint rezultate similare n ceea ce privete mierea de salcm produs n Slovenia, obinute de ctre Bertoncelj i colab. [9]. Grupul mierii de floarea-soarelui i de rapi reprezint tipuri de miere cu o capacitate antioxidant relativ sczut, cu valori medii ale coninutului de polifenoli de 20,5 mg/100g miere, respectiv 21,9 mg/100g miere.

Figura 8.1. Diagrama Box-Whisker pentru coninutul total de polifenoli al celor 7 grupuri de miere

43

Dintre toate tipurile de miere floral din Romnia, cel mai ridicat coninut polifenolic l-a nregistrat mierea de tei, cu valori cuprinse ntre 23,7 i 57,2 mg/100g miere. De asemenea, mierea ce a prezentat cea mai ridicat valoare medie a concentraiei de polifenoli din compoziie a fost cea de man, coninutul total de polifenoli al mierii de man fiind de 5 ori mai mare fa de cel al mierii de salcm. Cu ajutorul analizei de varian dispersional ANOVA au fost identificate diferene semnificate ntre tipurile de miere, n ceea ce privete coninutul de polifenoli la p<0,005 i F=22,56. Pentru evidenierea acestor diferene s-a utilizat diagrama Box-Whisker (figura 8.1). Din aceast diagram reiese c polifenolii reprezint un factor discriminant ntre mierea floral i cea de man. 8.3.2. Evaluarea coninutului total de flavonoide Rezultatele obinute (tabelulul 8.6) evideniaz diferena ntre tipurile de miere analizate n ceea ce privete coninutul total de flavonoide (mg quercetin/100g miere). n tabelul 8.6 sunt prezentate rezultatele medii, minime, maxime dar i ali parametri statistici descriptivi pentru coninutul total de flavonoide din probele de miere analizate (pe grupuri). Utiliznd ecuaia dreptei de calibrare cu quercetin (R2 = 0,999), coninutul total de flavonoide al probelor de miere analizate a variat ntre 0,6-2,5 mg/100g miere pentru mierea de salcm, 2,4-5,5 mg/100g miere pentru mierea de tei, 1,0-4,0 mg/100g miere pentru cea de rapi, 2,6-3,8 mg/100g pentru mierea de floarea-soarelui. Probele de salcm analizate au prezentat valori mai ridicate fa de cele obinute de Meda i colab. [7].

Figura 8.2. Diagrama Box-Whisker pentru coninutul total de flavonoide a celor 7 grupuri de miere

44

Un coninut ridicat de flavonoide a prezentat mierea de man , variind ntre 5,5-6,9 mg/100g miere dar i n cazul mierii poliflorale s-au nregistrat valori destul de mari: 1,4-4,9 mg/100g miere. Ordinea cresctoare n care a variat coninutul total de flavonoide pentru cele 7 grupuri diferite de miere este urmtoarea: Salcm < Rapi < Poliflor < Floarea-soarelui < Tei < Man < Prunus. Cele mai ridicate valori au fost obinute pentru mierea de Prunus i cea de man, fapt confirmat i de ali autori [5,9,12]. Cu ajutorul analizei de varian dispersional ANOVA au fost identificate diferene semnificate ntre tipurile de miere n ceea ce privete coninutul de flavonoide la p<0,005 i F=18,46. Pentru evidenierea acestor diferene s-a utilizat diagrama Box-Whisker (figura 8.2). 8.3.3. Evaluarea procentului de RSA (engl. radical scavenging activity) Cea mai mic valoare a RSA a nregistrat-o mierea de salcm (cu o valoare medie de 10,5%), n timp ce mierea de man a avut cea mai mare valoare (cu o valoare medie de 62,3%). Cu ajutorul analizei de varian dispersional ANOVA au fost identificate diferene semnificate ntre tipurile de miere n ceea ce privete procentul de inhibiie a radicalului DPPH pentru p<0,005 i F=21,24. Pentru evidenierea acestor diferene s-a utilizat diagrama Box-Whisker (figura 8.3).

Figura 8.3. Diagrama Box-Whisker pentru activitatea antiradicalic (RSA) a celor 7 grupuri de miere Din aceast diagram reiese c activitatea antiradicalic reprezint un factor discriminant ntre mierea floral i cea de man.

45

8.3.4. Evaluarea indicelui de oxidare Timpul mediu de decolorare a unei soluii de permanganat de potasiu 0,1 N de ctre antioxidanii din mierea analizat a fost de 9 s, cu o valoare minim de 1 s (pentru o prob de man), i o valoare maxim de 20 s (pentru o prob de salcm). Grupurile de salcm, rapi, floarea-soarelui i poliflor au prezentat cele mai ridicate valori ale indicelui de oxidare ceea ce se explic prin activitatea antioxidant relativ mic a acestor probe de miere analizate.

Figura 8.4. Diagrama Box-Whisker pentru indicele de oxidare a celor 7 grupuri de miere Tabelul 8.9. Mrimile statistice ale corelaiilor canonice ntre cele 4 metode de determinare a activitii antioxidante
Corelaii PolifenoliFlavonoide PolifenoliRSA FlavonoideRSA Indice de oxidare-RSA Valoare proprie 0,6 0,7 0,4 0,3 Corelaii canonice 0,800 0,817 0,664 0,603 Wilks Lambda 0,359 0,331 0,557 0,636 ChiSquare 52,757 56,789 30,050 23,285 D.F. 1 1 1 1 p 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

Din nou, cele mai sczute valori ale timpului de decolorare le-au prezentat probele de tei i man. Grupul de tei a prezentat o valoare medie a indicelui de oxidare de 5 s, lund valori n intervalul 1-9 s. Grupul de man a nregistrat cea mai mic valoare dintre toate grupurile de miere studiate (valoare medie de 3 s), ceea ce confirm nc o dat potenialul antioxidant cel mai puternic.

46

Cu ajutorul analizei de varian dispersional ANOVA au fost identificate diferene semnificative ntre tipurile de miere n ceea ce privete timpul de decolorare pentru p<0,005 i F=10,29. Pentru evidenierea acestor diferene s-a utilizat diagrama Box-Whisker (figura 8.4). Pentru a observa interdependena celor 4 parametrii studiai ce stabilesc activitatea antioxidant a mierii s-a recurs la reprezentarea tabelar (tabelulul 8.9) i grafic (figura 8.5) a corelaiilor canonice, pentru toate cele 7 grupuri de miere analizate. Cele mai semnificative corelaii identificate au fost ntre coninutul total de polifenoli i activitatea antiradicalic (0,817), coninutul total de flavonoide i polifenoli (0,800) dar i ntre activitatea antiradicalic i coninutul total de flavonoide (0,664). Cu ajutorul clusterizrii ierarhice n funcie de cei mai importani parametrii ce stabilesc capacitatea antioxidant, s-au format 2 grupuri distincte (figura 8.9). Unul dintre grupuri a fost reprezentat de mierea de man (care a prezentat cel mai puternic potenial antioxidant), iar cellalt grup, de cea floral. n funcie de centroizii fiecrei probe i de distana euclidian calculat cu ajutorul software-ului Statgraphics Centurion XVI, unele din probele de miere monofloral au fost grupate (salcm-1, tei-2, rapi-3, fl-soarelui-4).

Figura 8.9. Reprezentarea grafic a clusterului format n funcie de coninutul total de polifenoli, de flavonoide i RSA ale probelor de miere analizate (1-salcm, 2- tei, 3-rapi, 4floarea-soarelui, 5-poliflor, 6- man)

8.4. CONCLUZII n ceea ce privete coninutul total de polifenoli, cele mai ridicate valori au fost obinute pentru mierea de man, mierea Prunus i cea de tei , coninutul fenolic al mierii de

47

man fiind de 5 ori mai mare fa de cel al mierii de salcm. Aceeai situaie a fost nregistrat i n cazul coninutului total de flavonoide. Rezultate comparative obinute privind evaluarea capacitii antioxidante claseaz diferitele tipuri de miere analizate, din acest punct de vedere, n urmtoarea ordine cresctoare: salcm < floarea-soarelui < rapi < poliflor < tei < Prunus < man.

CAPITOLUL 9. EVALUAREA CALITATIV A MIERII ROMNETI PE BAZA ANALIZEI SENZORIALE

9.2. MATERIALE I METODE 9.2.1. Materiale S-au utilizat n total 54 de probe de miere din diferite regiuni ale Romniei, obinute din 2 culturi consecutive (2009/2010). Probele de miere au fost achiziionate direct de la apicultor care a garantat originea lor botanic i geografic i de la Asociaia Cresctorilor de Albine (ACA). 9.2.2. Mediul ambiant Sala n care au avut loc degustrile a prezentat urmtoarele caracteristici: izolat fonic, lipsit de mirosuri strine, temperatura de aproximativ 20C, umezeala relativ a aerului de aproximativ 60%, foarte luminoas, culoarea pereilor alb (neutr).

9.2.3. Grupul de degusttori Grupul de degusttori a fost format din 8 paneliti specializai care profeseaz n acest domeniu n cadrul institutului Tcnica del Consejo Regulador Geogrfica Protejida Miel de Galicia, Spania. Au fost ndeplinite anumite norme de igien: nu s-a fumat, nu s-au consumat: cafea, buturi alcoolice sau buturi ce conin substane aromatice puternice nainte cu o or de nceperea analizei senzoriale, nu s-au utilizat spunuri puternic parfumate, deodorante sau parfumuri,

48

nu s-au degustat mai mult de 7 probe de miere per sesiune (ntre degustri s-au consumat pine fr sare i ap).

9.2.4. Pregtirea probelor Recipientele cu miere au fost anonime pentru degusttori, primind doar coduri specifice: 1A, 2A...1B...7C. Masa de miere utilizat pentru fiecare recipient a fost de 30-40 g, iar n cazul n care aceasta a prezentat fenomenul de cristalizare, transferul a avut loc cu grij pentru a pstra intact structura produsului. Probele astfel pregtite au fost duse n sala de degustare nainte cu dou ore de nceperea sesiunii pentru ca mierea s fie n echilibru cu temperatura mediului. 9.2.5. Tehnica de lucru Degustarea se efectueaz n trei faze succesive: examen vizual, olfactiv i gustativ. n cadrul examenului vizual se ine cont de o serie de atribute precum: Culoare: (pe o scal de la 1 la 10): incolor, alb, galben pai, galben foarte deschis, galben deschis, galben, galben nchis, galben-brun, brun, brun nchis. Fluiditate: (pe o scal de la 1 la 10): foarte fluid (atunci cnd umiditatea evaluat vizual este mai mare dect 19%), fluid (atunci cnd umiditatea este mai mic dect 19%), prezena cristalelor fine, medii i groase. Turbiditate: pur, turbiditate slab, turbiditate important. Omogenitatea coninutului

Pentru mierea fluid: foarte omogen, omogen, slab prezen a straturilor de diferite culori, prezena abundent a straturilor de diferite culori (poate fi menioneat existena bulelor de aer n masa de miere). Pentru mierea cristalizat: cristalizare incomplet, fracionat, separare n dou faze (pelicul fin i lichid la suprafa, strat gros important la suprafa). Examenul olfactiv care are loc prin inspirarea lent a probei timp de cte va secunde subliniaz unele aspecte importante precum: Caracteristici generale: vegetal, floral, fructat, animal. Intensitatea mirosului (pe o scal de la 1-10). Persistena mirosului (pe o scal de la 1-10). Defecte: miros de fum, saci vechi, prezena fermentaiei.

Examen gustativ: cu ajutorul unei lingurie de plastic de unic folosin se introduc 1 -2 g de miere n cavitatea bucal i se menine cteva secunde pn la mestecare. Se urmresc urmtoarele atribute senzoriale:

49

Caracteristici generale: vegetal, floral, fructat, animal. Intensitate (pe o scal de la 1-10). Persisten (pe o scal de la 1-10). Gust dulce (pe o scal de la 1-10). Gust acid (pe o scal de la 1-10). Aftertaste: intensitate i persisten Astringen: intensitate i persisten. Defecte: gust de fenol, migdal amar, miere nclzit (caramel), aciditate ridicat (fermentaie), arome strine.

9.2.6. Prelucrarea statistic a rezultatelor Datele senzoriale obinute au fost prelucrate cu software -ul statistic StatGraphics Centurion Versiunea XVI pentru Windows. La interpretarea rezultatelor s-au folosit metode precum: Analiza clusterizrii/clasificrii ierarhice (Cluster Analysis), Analiza componentelor principale (PCA), corelaii Pearson i diagrame radar. 9.3. REZULTATE I DISCUII 9.3.1. Grupul mierii de salcm Panelitii specializai au evaluat pentru fiecare prob 17 atribute senzoriale prezentate n partea de Tehnic de lucru. Culoarea mierii de salcm a variat de la incolor la galben pai, unele probe prezentnd fluiditate destul de ridicat (minimum 3 - maximum 7), iar intensitatea mirosului a nregistrat valori destul de sczute fa de celelalte tipuri de miere analizate. Atributul caracteristic acestui grup de miere a fost reprezentat de gustul dulce. Acesta a prezentat o valoare medie de 6,7 cu un minim de 6 i un maxim de 7 (figura 9.1). Niciuna din probele supuse analizei senzoriale nu a prezentat astringen.

50

Grupul de salcm (n=12)

Astringen

10

Culoare

8 6

Fluiditate

Aftertaste

4
2 0

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate Gust acid

Gust dulce

Figura 9.1. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru grupul mierii de salcm 9.3.2. Grupul mierii de tei Cele mai edificatoare atribute senzoriale evaluate sunt prezentate n diagrama radar (figura 9.2).

Grupul de tei (n=14)

Astringen

10

Culoare

8 6 4 2 0

Fluiditate

Aftertaste

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate Gust acid

Gust dulce

Figura 9.2. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru grupul mierii de tei

Se observ intensitatea culorii mult mai proeminent fa de cea a mierii de salcm (galben deschis- galben -galben nchis), dar i intensitatea floral a mirosului care a prezentat

51

valori ntre 5 i 7. Mierea de tei prezint un miros specific i puternic datorit compuilor aromatici, volatili din compoziie. De asemenea, acest tip de miere a prezentat aftertaste cu valori cuprinse n intervalul 5-6. 9.3.3. Grupul mierii de rapi

Grupul de rapi (n=11)

Astringen

10

Culoare

Fluiditate

6
Aftertaste

4 2 0

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate Gust acid

Gust dulce

Figura 9.3. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru grupul mierii de rapi Acest tip de miere a prezentat intensiti sczute ale culorii (alb-galben deschis), fiind n general cristalizat cu dimensiunea granulelor mic, cristalizare care a avut loc n toat masa produsului, prezentnd o structur cremoas (figura 9.3). Acest fapt este explicat de existena unei fluiditi relativ sczute. De remarcat ns intensitatea puternic a gustului dulce care a variat ntre 7 i 8. Acest tip de miere a prezentat n compoziie cele mai ridicate concentraii de zaharuri identificate, ajungnd n unele probe pn la 90%. Majoritatea degusttorilor au evideniat un gust dulce mentolat relativ persistent n timp. 9.3.4. Grupul mierii de floarea-soarelui Patru probe au fcut parte din componena acestui tip de miere, identificarea botanic bazndu-se pe tehnicile melisopalinologice efectuate n prealabil.

52

Grupul de floarea-soarelui (n=4)

10
Astringen

Culoare

8
6 4 2 0

Fluiditate

Aftertaste

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate
Gust acid

Gust dulce

Figura 9.4. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru grupul mierii de floarea-soarelui Acest tip de miere, ca i mierea de tei, a prezentat o intensitate a mirosului i gustului relativ ridicat datorit compuilor volatili din compoziie. S-a observat din nou, ca i n cazul mierii de rapi prezena gustului dulce perceput de degusttori ca fiind destul de ridicat (cu valori cuprinse ntre 7-8). Aceste probe au prezentat, de asemenea, un gust acid relativ mediu. Degustrtorii au identificat un gust specific, puin uleios, n unele cazuri chiar originea botanic (Helianthus annuus). 9.3.5. Mierea de Prunus Aceasta a fost singura miere identificat astfel n urma analizei palinologice dar etichetat cu denumirea: miere de pomi fructiferi, achiziionat din zona Clujului.

53

Mierea de Prunus (n=1)

Astringen

10

Culoare

8 6 4 2 0

Fluiditate

Aftertaste

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate Gust acid

Gust dulce

Figura 9.5. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru mierea de Prunus Aceast miere a prezentat o structur cristalizat cu dimensiunea granulelor foarte mare (figura 9.5). Majoritatea degusttorilor au caracterizat aceast miere ca prezentnd un gust dulce, de cire. Intensitatea gustului acestei mieri a fost relativ ridicat, lsnd senzaia de astringen n cavitatea bucal la finalul examenului gustativ. 9.3.6. Grupul mierii poliflore

Grupul poliflor (n=8)

Astringen

10

Culoare

8 6 4 2 0

Fluiditate

Aftertaste

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate
Gust acid

Gust dulce

Figura 9.6. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru mierea poliflor

54

n componena acestui grup intr 9 probe de miere, din care o prob a fost respins datorit prezenei unei fermentaii avansate care au fcut-o neconform din punct de vedere senzorial. Intensitatea culorii este similar cu cea a mierii de floarea soarelui i Prunus, lund valori n intervalul 5-6. Gustul dulce predominant ridicat a prezentat o valoare medie de 7. n majoritatea cazurilor, gustul detectat a fost cel floral i uneori fructat, iar 2 probe au prezentat un defect, mai precis o fermentaie uoar care s-a corelat cu gustului acid. 9.3.7. Mierea de man Trei probe din cele 53 analizate au intrat n categoria mierii de man prezentnd caracteristici specifice acestui grup, obinute n urma analizei melisopalinologice dar i a unor studii fizico-chimice. De remarcat este intensitatea culorii acestui tip de miere (brun, brun-nchis). Dup cum bine se tie, aceast culoare este caracteristic mierii de man alturi de o conductivitate electric ridicat, implicit un coninut n sruri minerale, i nu n ultimul rnd, cea mai puternic activitate antioxidant fa de tipurile de miere floral studiate.

Grupul de man (n=3)

Astringen

10

Culoare

8 6 4 2 0

Fluiditate

Aftertaste

Miros Intensitate

Gust Persisten

Miros Persisten

Gust Intensitate Gust acid

Gust dulce

Figura 9.7. Diagrama radar a descriptorilor senzoriali pentru mierea de man

Degusttorii au evideniat, pentru toate probele, un gust pregnant de caramel, prezentnd cea mai ridicat persisten n cavitatea bucal (aftertaste). Gonzalez i colab. [22] au evaluat atributele senzoriale ale mierii de diferite origini florale din Madrid. n cazul mierii poliflorale, acetia au detectat, ca i n prezentul studiu, o

55

arom intens fructat dar i un gust picant la finalul testrii organoleptice. Intensitatea de aroma i gust fiind similare cu cele obinute pentru mierea romneasc. 9.3.8. Combinarea tehnicilor chemometrice cu analiza senzorial Grupurile de miere supuse analizei de varian ANOVA au nregistrat diferene statistice pentru p<0,005. Pentru a demonstra grafic aceste diferene s-a recurs la aplicarea Analizei Componentelor Principale (analiz discriminant). Astfel, n figura 9.8 sunt evideniai cei mai importani descriptori senzoriali: intensitate gust i miros, culoare, fluiditate, gust dulce i aftertaste , n funcie de care probele de miere s-au clasificat.

Figura 9.8. Diagrama analizei componentelor principale clasificnd probele n funcie de atributele senzoriale cele mai edificatoare n acest caz, 2 componente au fost extrase, deoarece 2 componente au avut valori proprii mai mare dect 1. mpreun, acestea reprezint 54,27% din variabilitatea datelor originale. Dup ce analiza componentelor principale a identificat atributele senzoriale cele mai edificatoare pentru analiza organoleptic a mierii romneti, s-au aplicat corelaiile Pearson ntre aceti descriptori senzoriali (tabelul 9.2). Se remarc din tabelul 9.2 c cele mai semnificative corelaii au fost obinute ntre: intensitate gust-culoare, intensitate gust i aftertaste (p<0,01). Alte corelaii obinute au fost ntre intensitate gust i gustul dulce, dar i ntre fluiditate i culoare (p<0,05).

56

Tabelul 9.2. Coeficienii de corelaie Pearson pentru descriptorii senzoriali ai mierii romneti
Descriptori Culoare Fluiditate senzoriali Culoare Fluiditate 0,2696* Intensitate miros 0,1701 0,0532 Gust dulce 0,0619 0,1762 Intensitate gust 0,3338** 0,2503 Aftertaste 0,2423 -0,1610 Nivel de semnifican: * p<0,05; ** p<0,01 Intensitate miros Gust dulce Intensitate gust

0,1143 0,3759** 0,1840

0,2747* -0,0662

0,3736**

Urmtoarea analiz aplicat datelor obinute n urma analizei senzoriale a fost analiza de clusterizare (clustering).

Figura 9.9. Reprezentarea grafic a clusterului format n funcie de culoare obinut n urma analizei senzoriale (1-salcm, 2- tei, 3-rapi, 4- floarea-soarelui, 5-Prunus, 6- man, 7poliflor) Astfel, dendograma formeaz grupuri diferite de miere monofloral n funcie de variabilele cu putere discriminant obinute n urma analizei componentelor principale culoare i gust dulce

57

Figura 9.10. Reprezentarea grafic a clusterului format n funcie de gustul dulce obinut n urma analizei senzoriale (1-salcm, 2- tei, 3-rapi, 4- floarea-soarelui, 5-Prunus, 6- man, 7poliflor) Se poate observa din diagrame formarea unor grupuri de miere. Grupurile formate se remarc n cazul mierii de salcm, tei, rapi, poliflor i floarea-soarelui. n cazul reprezentrii grafice a clusterului n funcie de culoare, de subliniat este discriminarea dintre mierea de man i cea floral. 9.4. CONCLUZII Cele mai apreciate tipuri de miere au fcut parte din grupul de tei i cel de rapi, sub aspect structural i organoleptic. Mierea care a prezentat gustul cel mai dulce identificat de paneliti (dar demonstrat i prin analiza spectrului glucidic) a fost cea de floarea-soarelui. n prezentul studiu s-a realizat trasarea profilelor senzoriale clasificnd atributele organoleptice specifice mierii romneti analizate. Prin aplicarea analizei componentelor principale (PCA) s-au stabilit cei mai importani descriptori senzoriali (intensitate gust, miros, culoare, fluiditate, gust dulce i aftertaste) care discrimineaz puternic ntre tipurile de miere evaluate. Prin clusterizare ierarhic n funcie de atributul evaluat n cadrul examenului vizual (culoare), s-a obinut o grupare/difereniere ntre mierea floral i cea de man.

58

CAPITOLUL 10. AUTENTIFICAREA ORIGINII BOTANICE A MIERII ROMNETI BAZAT PE COMBINAREA ANALIZELOR FIZICO-CHIMICE I CHEMOMETRICE

10.2. MATERIALE I METODE Materialul de lucru utilizat n prezentul studiu a constat n 54 probe de miere de diferite origini florale i geografice. Probele au fost obinute direct de la apicultori sau de la ACA- care au garantat pentru originea lor botanic i geografic. n vederea identificrii parametrilor cu putere discriminant mare , care s ajute la autentificarea originii botanice a mierii, s-a apelat la aplicarea diferitelor tehnici chemometrice bazate pe diverse modele matematice. Astfel, s-au folosit: 10.2.1. Analiza componentelor principale (engl. Principal Component Analysis, PCA) 10.2.2. Analiza discriminant linear (Linear Discriminant Analysis , LDA) 10.3. REZULTATE I DISCUII 10.3.1. Autentificarea prospeimii mierii romneti analizate Aceast autentificare presupune identificarea posibilelor tratamente nepermise aplicate asupra probelor evaluate n acest studiu. S-au avut n vedere compuii cu ajutorul crora se stabilete prospeimea mierii precum: hidroximetilfurfuralul (HMF), activitatea enzimatic msurat prin cuantificarea coninutului de amilaz, respectiv invertaz . Aceste dou enzime fiind sensibile la temperatur vor conduce la rezultate edificatoare n cazul identificrii de tratamentelor termice folosite, dar i a conservrii mierii n condiii necorespunztoare. Analiza componentelor principale utiliznd variabilele alese (coninutul de glucoz, HMF, invertaz i amilaz), a condus la formarea unui grup omogen detaat de celelalte probe care au depit limitele admise pentru respectivii parametrii analizai (figura 10.1). Analiza componentelor principale a format dou componente din cei 4 parametrii introdui la rularea programului, care mpreun discrimineaz cu un procent semnificativ de 80,6% ntre probele de miere natural i cele falsificate. Astfel, graficul arat cum cele 6 probe de miere (o prob de salcm, dou de poliflor i trei probe de tei), sunt n afara grupului omogen format, acestea fiind respinse n urma examenului de calitate, fapt demonstrat ulterior i de analiza senzorial. Pentru dou probe de tei (T15 i T1), coninutul de amilaz a prezentat valori nule, ceea ce demonstreaz faptul c acestea au fost supuse unui tratament termic brutal.

59

Figura 10.1. Diagrama probelor de miere obinut n urma analizei componentelor principale (PCA)

Celelalte patru probe (S13, S17, T7, T9), au prezentat un coninut de hidroximetilfurfural mult peste limita admis, de 40 mg/kg. Aceste probe au prezentat turbiditate i stadiu avansat de fermentaie, fapt semnalizat i de ctre degusttori n urma examenului organoleptic. n cazul mierii de salcm (S17), care a prezentat o valoare medie a 3 determinri a HMF, de 56,2 mg/kg, a nregistrat valori aberante ale zaharurilor (glucoz: 29,4%, fructoz: 19,33%, zaharoz: 1,4% i maltoz: 3%). Este singurul caz, mai ales n cadrul grupului de salcm, n care o prob prezint valori ale fructozei mult mai mici dect ale glucozei, de remarcat fiind i coninutul destul de ridicat al maltozei. Aceast prob fiind suspect i de falsificare prin adaos de ap, glucoz, dextroz i amidon iar apoi supus unui trata ment termic la temperaturi de peste 60C. 10.3.2. Autentificarea originii botanice a mierii romneti bazat pe tehnici palinologice Analizele statistice multivariate au condus la clasificri i chiar autentificri ale originii botanice ntre diferite tipuri de miere. n literatura de specialitate exist date care arat c analiza discriminant liniar a n prezentul studiu, pentru interpretarea statistic a datelor, s -a utilizat frecvena relativ a speciilor semnificative de polen: Robinia pseudoacacia, tipul Brassica napus, tipul Prunus, tipul Tilia i Helianthus annuus.

60

Figura 10.3. Diagrama probelor de miere obinut n urma analizei discriminante liniare (LDA) Pentru o clasificare ct mai precis a probelor de miere n funcie de originea floral, s-a aplicat analiza discriminant liniar (figura 10.3), n care s-au introdus doar datele tipurilor de miere monofloral i de man, eliminnd grupul de miere poliflor care prezint un spectru vast de specii polenice. Aceast analiz a condus la formarea a 6 grupuri corespunztoare celor 6 tipuri de miere evaluate: Prunus, salcm, rapi, tei, floarea -soarelui i man. Utiliznd variabilele anterior specificate, procentul de clasificare corect a diferitelor tipuri de miere a fost de 93,33%. Cel mai sczut procent de clasificare l-a prezentat grupul de salcm (75%). Din acest grup 9 probe de salcm au fost clasificate corect (conform originii botanice: Robinia pseudoacacia), dou din probe intrnd n grupul de man i una n grupul de rapi datorit prezenei speciei Brassica napus n concentraii ridicate n probele de salcm. Celelalte tipuri de miere au fost corect clasificate n funcie de originea floral , prezentnt un procent de 100%.

10.3.3. Autentificarea originii botanice a mierii romneti bazat pe metode fizico-chimice i biochimice n cea de-a treia parte de autentificare a originii botanice, prin utilizarea parametrilor fizico-chimici i biochimici determinai, au fost definite i evaluate patru profile alctuite din diferite variabile.

61

Scopul prezentului studiu a fost de identificare a profilului compus din variabile fizicochimice i biochimice care s discrimineze cel mai puternic ntre tipurile de mieri, dar i ca raportul dintre clasificare corect- consum de timp-consum de reactivi-necesitatea echipamentelor performante s fie optim. Astfel, s-a urmrit obinerea profilului cel mai avantajos din diferite puncte de vedere (anterior amintite), care s prezinte cea mai ridicat precizie pentru autentificarea originii botanice a mierii romneti. n acest studiu s-au utilizat doar probele de miere cu caracteristici de calitate superioare, cele ce au fost evaluate i au prezentat urme de posibile fraude fiind eliminate. Profilul I a fost compus din urmtoarele variabile: coninut de glucoz, fructoz, zaharoz, maltoz, trehaloz, melezitoz, suma dintre glucoz i fructoz, coninutul de zaharuri totale, raportul dintre fructoz i glucoz (tabelulul 10.2). Spectrul glucidic trasat pentru fiecare prob prin cromatografie de schimb ionic a fost utilizat pentru discriminarea dintre tipurile diferite de miere. n acest caz, procentul de clasificare corect a probelor a fost de 71,11%. Conform acestor date utilizate, singurul grup clasificat corect 100% a fost reprezentat de mierea de Prunus. Un procent de clasificare ridicat a fost nregistrat de mierea de salcm (90,9%) datorit coninutului mare de fructoz i, implicit, a raportului ridicat F/G. Astfel, aceasta a discriminat semnificativ fa de restul tipurilor de miere. Din 11 probe de tei doar 9 au fost corect clasificate (81,8%), celelalte dou fiind redistribuite n grupul mierii de rapi i floarea-soarelui. Grupul de rapi (n=11) a prezentat cel mai sczut procent de clasificare (54,55%) n funcie de spectrul glucidic, 5 probe intrnd n grupuri precum: salcm, tei i floarea-soarelui. Urmtorul profil, profilul II, utilizat a fost alctuit din parametrii fizico-chimici: coninutul de ap, conductivitatea electric, pH, HMF, indicele amilazic i coninutul de zaharuri totale Utiliznd variabilele anterior specificate, procentul de clasificare corect a tuturor probelor de miere a crescut, fiind de 81%. De aceast dat, mierea de salcm i mierea de Prunus au fost corect clasificate, cu un procent de 100%. Mierea de rapi, din nou, a nregistrat cel mai sczut procent de clasificare n funcie de parametrii fizico-chimici, 4 probe din 11 fiind distribuite n grupul mierii de salcm, tei i rapi. n urma datelor obinute n funcie de cele dou profile, s-a recurs ulterior la ntregirea variabilelor fizico-chimice cu scopul obinerii unor procente de clasificare mult mai ridicate, n ceea ce privete autentificarea originii botanice a mierii romneti. Profilul III a fost compus din urmtorii parametri: densitate polenic, coninut d e ap, conductivitate electric, pH, indice colorimetric, HMF, indice amilazic, indice invertazic, coninutul de zaharuri totale, raportul F/G i raportul glucoz/ap (tabelulul 10.4).

62

Putem observa c patru grupuri (mierea de salcm, floarea-soarelui, Prunus i man), din cele ase grupuri supuse discriminrii cu variabilele specificate anterior au fost corect clasificate n procent de 100% Profilul IV a fost alctuit pe lng parametrii fizico-chimici (pH, conductivitate electric, indice colorimetric, coninut de zaharuri totale, raportul F/G), din parametri biochimici precum: coninutul total de polifenoli i RSA (radical scavenging activity). ns fa de 11 variabile din ct a fost alctuit profilul III care pn acum a prezentat cel mai mare procent de clasificare al probelor, profilul IV a fost compus din 7 parametri, reducnd astfel numrul de analize ce vor conduce la autentificarea originii bot anice a mierii romneti (tabelulul 10.5).

Tabelul 10.5. Procentul de clasificare prin LDA n funcie de Profilul IV al probelor de miere monoflorale i de man
Procent de clasificare (%)- Profilul IV Salcm Tei Rapi F-soarelui Prunus 11 0 0 0 0 Salcm 11 (100,00) (0,00) (0,00) (0,00) (0,00) 0 10 0 1 0 Tei 11 (0,00) (90,91) (0,00) (9,09) (0,00) 2 1 6 2 0 Rapi 11 (18,18) (9,09) (54,55) (18,18) (0,00) 0 0 0 4 0 F-soarelui 4 (0,00) (0,00) (0,00) (100,00) (0,00) 0 0 0 0 1 Prunus 1 (0,00) (0,00) (0,00) (0,00) (100,00) 0 0 0 0 0 Man 3 (0,00) (0,00) (0,00) (0,00) (0,00) Procentul total al cazurilor corect clasificate: 86,36% N Man 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00) 3 (100,00)

n urma rulrii datelor din acest profil n analiza discriminant, s-a obinut cel mai ridicat procent de clasificare corect a probelor de miere n funcie de originea lor botanic (86,36%). Astfel, a fost validat un profil alctuit dintr-un numr relativ mic de variabile att fizico-chimice ct i biochimice, care conduce la o clasificare precis a probelor de miere din Romnia i implicit la autentificarea botanic a acestora. 10.4. CONCLUZII Analiza componentelor principale n funcie de indicatorii de prospeime ai mierii (HMF, indice amilazic i indice invertazic), a separat ase din cele 54 de probe, acestea fiind respinse datorit unui coninut de HMF i diastaz n afara limitelor admise de Codex Alimentarius i International Honey Commission.
63

Astfel, n funcie de cele mai semnificative specii polenice a avut loc autentificarea originii botanice a probelor de miere evaluate n urma analizei discriminante lineare pentru care a fost obinut un procent de clasificare a probelor foarte ridicat. Pentru obinerea unei autentificri precise folosind parametrii fizico -chimici i biochimici s-a recurs la optimizarea unui profil alctuit din variabile ce caracterizeaz mierea i care au prezentat o putere discriminant ridicat ntre tipurile diferite evaluate. Astfel, din patru profile care au fost rulate, cel ales pentru validare a fost alctuit din 7 variabile (pH, conductivitate electric, indice colorimetric, coninut de zaharuri totale, raportul F/G, coninutul total de polifenoli i RSA), acesta conducnd la o clasificare precis a probelor de miere din Romnia (86,36%) i implicit la autentificarea botanic a acestora.

CONCLUZII GENERALE
Clasificarea tipurilor de miere din prezentul studiu a avut loc n urma anal izei melisopalinologice n care spectrele polenice au fost trasate pentru fiecare prob. Au fost identificate 73 tipuri (specii) polenice aparinnd la 35 de familii corespunztoare. Tipul Brassica napus a fost prezent n diferite concentraii n toate cele 54 probe supuse analizei. n urma autentificrii originii botanice prin tehnicile palinologice, probele de miere au fost clasificate astfel: salcm- Robinia pseudoacacia (n=12), tei- tipul Tilia (n=14), rapi- tipul Brassica napus (n=11), floarea-soarelui- Helianthus annuus (n=4), Prunus (n=1), poliflor (n=9) i miere de man (n=3). Pe baza controlului de calitate, 6 probe din cele 54 au fost eliminate deoarece prezentau cantiti n afara limitelor admise ale HMF, activitii invertazice i amilazice. Aceste probe au fost suspectate ca fiind falsificate prin diferite adaosuri ilicite, supuse unor tratamente termice brutale i/sau pstrate n condiii necorespunztoare. Spectrul glucidic, nglobnd peste 90% zaharuri din materia uscat a mierii, a fost trasat utiliznd metode cromatografice de schimb ionic cu detector amperometric. De asemenea, a fost studiat evoluia n timp (anii 2010 i 2011) a comportamentului reologic, obinndu-se o valoare a componentei vscoase (G) mult mai mare dect componenta elastic (G), mierea analizat fiind clasat n categoria fluidelor vscoase. n urma evalurii comportamentului la curgere (anul 2010) toate tipurile de miere au prezentat comportament newtonian, cu excepia mierii de rapi i de floareasoarelui care au dovedit a fi fluide nenewtoniene datorit prezenei n structur a unui fenomen de cristalizare avansat. Dup un an i jumtate ( anul 2011), toate probele au prezentat caracter reologic ne- Newtonian, modificarea vscozitii sugernd existena transformrilor continue la nivel molecular i implicit structural. Prin aplicarea analizei de clusterizare ierarhic bazat pe algoritmi matematici a fost posibil prezicerea originii botanice a mierii n funcie de vscozitatea determinat la 10C.

64

 S-a evaluat activitatea antioxidant a mierii prin aplicarea a 4 metode diferite, ordinea cresctoare a potenialului antioxidant obinut fiind: salcm, floarea -soarelui, rapi, poliflor, tei, Prunus, man. Corelaiile canonice au stabilit interdependea dintre metodele aplicate, iar prin analiza de clusterizare ierarhic n funcie de coninutul total de polifenoli i flavonoide a fost posibil discriminarea dintre mierea floral i de man, cea din urm avnd un potenial antioxidant foarte ridicat. De asemenea, n prezentul studiu, s-a realizat trasarea profilelor senzoriale de ctre o echip de paneliti specializai n Spania, i s-au stabilit atributele organoleptice de major importan pentru mierea romneasc. n scopul unei autentificri precise a originii botanice, a fost identificat i optimizat un profil alctuit din 7 variabile fizico-chimice i biochimice caracteristice mierii analizate, care a condus la o discriminare optim ntre probe, procentul de clasificare corect a probelor n urma rulrii programului fiind de 86,36%. De remarcat, importana metodelor melisopalinologice (ce identific i traseaz spectrele polenice) la autentificarea originii botanice a mierii, dar i a combinrii dintre acestea i tehnicile moderne chemometrice care joac un rol important n clasificarea acestor mieri (prin robusteea i precizia modelelor i algoritmilor matematici utilizai). Concluzionnd, aducem n prim plan impactul deosebit de important pe care l-au prezentat caracteristicile palinologice, fizico-chimice, biochimice combinate cu cele chemometrice, asupra autentificrii originii botanice a mierii romneti.

DISEMINAREA REZULTATELOR CERCETRII

Diseminarea rezultatelor cercetrii din actuala tez de doctorat a fost vizibil dup cum urmeaz: Articole tiinifice: ISI Irina Dobre, Petru Alexe, Olga Escuredo, Maria Carmen Seijo, 2012. Palynological study of selected honeys from Romania, Grana, (acceptat). Irina Dobre, Luminita Anca Georgescu, Petru Alexe, Olga Escuredo, Maria Carmen Seijo, 2012. Rheological behavior of different honey types from Romania , Food Research International, (acceptat). Irina Dobre and Maria Carmen Seijo, 2012. Evaluation of several Romanian honeys based on their palynological and biochemical profiles, International Journal of Food Properties, (revizie minor). BDI Irina Dobre, Georgiana Gdei, Livia Patrascu, Alina Mihaela Elisei, Rodica Segal, 2010. The antioxidant activity of selected Romanian honeys, The Annals of the University Dunarea de Jos of Galati, Fascicule VI-Food Technology, 34 (2), 7. (publicat).

65

Lucrri comunicate la conferie/simpozioane internaionale (doar prezentri orale) Escuredo Olga, Dobre Irina, Rodrguez-Flores M. Shantal & Seijo M. Carmen, 2012. Sugar composition and crystallization tendencies of different types of unifloral honeys, II International Symposium on Bee Products Annual meeting of the International Honey Commission, Bragana, Portugal. Irina Dobre, Ecaterina Brajdes, Valentina Serea, Vizireanu Camelia, Petru Alexe, 2012. valuation et classification des differents types de miel sur la base des analyses palynologiques et biochimiques, 7me Colloque Franco-Roumain de Chimie Applique (COFrRoCA), Bacau, Romania. Irina Dobre, Petru Alexe, Olga Escuredo Perez, Maria Carmen Seijo Coello, 2011. Authentication of botanical origin of Romanian honeys based on melissopalynological and physico-chemical analysis, International Conference Enviromental capacity building, Bucharest, Romania. Irina Dobre, Petru Alexe, Olga Escuredo Perez, Maria Carmen Seijo Coello, 2011. Multicriterial classification of Romanian honeys by palynological and physicochemical parameters, 5th International Euro-aliment Symposium, Galai, Romania. Irina Dobre, Petru Alexe, Olga Escuredo Perez, Maria Carmen Seijo Coello, 2011. Preliminary contribution to the evaluation of Romanian honeys based on palynological data, Symposium conjoint APLF-APLE Palynologie et Diversites, Meudon-Bellevue, Paris, France. Dobre Irina, Patrascu Livia, Flores M. Shantal Rodriguez, Escuredo Olga, Coello M. Carmen Seijo, 2011. Comportamiento reologico de mieles de Rumania, Congresso Iberico de Apicultura, Castelo Branco, Portugalia. Irina Dobre, Livia Patrascu, Petru Alexe, 2010. The rheological behaviour of selected honeys, 7th International Conference of Chemical Societies from South-East European Countries, Bucharest, Romania. Irina Dobre, Georgiana Gadei, 2009. The antioxidant activity by modern techniques of honey, International Symposium Fundatia pentru alimentatie sanatoasa, Bucharest, Romania.

66