Mdulo Prctico 3

OBTENCIN Y ANLISIS DE ALGUNAS FRACCIONES SUBCELULARES Objetivos:

Introduccin a los mtodos de obtencin de fracciones subcelulares: conceptos de homogeneizacin, centrifugacin diferencial y en gradiente. Identificacin, caracterizacin y anlisis de pureza de las fracciones subcelulares obtenidas (ncleos, mitocondrias y cloroplastos). Observacin de la morfologa microscpica de los organelos aislados y/o en cortes.

Fraccionamiento subcelular:
Los mtodos de microscopa permiten analizar en gran medida la anatoma y localizacin de los organelos celulares, pero si se quiere ahondar en su funcionamiento deben realizarse ensayos bioqumicos, para lo cual generalmente el primer paso es obtener fracciones enriquecidas en los distintos organelos. La obtencin de esta fraccin puede dividirse en dos partes denominadas homogeneizacin y fraccionamiento. La homogenizacin consiste en disgregar los tejidos en las clulas que los componen y luego realizar la lisis de las clulas, de tal modo que se liberen sus componentes, en particular sus organelos, sin que estos sufran mayores daos. El uso de instrumentos como morteros, jeringas, homogeneizadores permiten la disgregacin y lisis celular. Si se parte de un cultivo celular, no es necesario separar las clulas y se pasa directamente a la lisis celular. Para esto tambin existen diversas alternativas como el uso de detergentes que solubilicen las membranas, el shock osmtico y el uso de ultrasonido. Una vez que se tienen todos los componentes celulares libres, es necesario separarlos en fracciones, es decir, realizar su fraccionamiento. El mtodo ms utilizado para este fin es la centrifugacin diferencial. Cuando los diferentes componentes celulares se encuentran suspendidos en un lquido, tienden a sedimentar hacia el fondo por el efecto de la gravedad. Para acelerar este proceso, se puede colocar a un tubo conteniendo esta suspensin en un rotor giratorio, de forma de someter a las partculas a una fuerza centrfuga. Este procedimiento se denomina centrifugacin, y el rotor especializado en el que se realiza se denomina centrfuga. Qu sucede cuando las partculas suspendidas son sometidas a una fuerza centrfuga? Las partculas van a moverse hacia el fondo del tubo, pero a su vez dos fuerzas van a oponerse a este movimiento, la fuerza de friccin y la fuerza de flotacin generada por el lquido desplazado. Esta contraposicin de fuerzas hace que eventualmente cada partcula sedimente a velocidad constante, de acuerdo a la siguiente ecuacin: v = (m 2 r) (1 - o/) f m es la masa de la partcula, 2r es la aceleracin que se genera en el rotor, o es la densidad del lquido en el que estn suspendidas las partculas, es la densidad de la partcula y f es el coeficiente de friccin de la partcula.

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Rearreglando esta ecuacin, obtenemos: v = m (1 - o/) 2 f r Esta ecuacin implica que, para una aceleracin constante, la velocidad de sedimentacin depende de la masa de la partcula, de su densidad y coeficiente de friccin, y de la densidad del lquido. En particular, mientras mayor sea la masa de la partcula, ms rpido sedimentar. Tambin vale la pena notar que la partcula solo sedimentar si su densidad es mayor a la del lquido ( o/ < 1), mientras que si es igual o menor permanecer quieta o flotar. El cociente v / (2 r) es una constante que se denomina coeficiente de sedimentacin, y la unidad en que se expresa es el Svedberg (S), en homenaje a uno de los pioneros de la centrifugacin. Mientras ms grande este coeficiente mayor ser la velocidad de sedimentacin. Frecuentemente la velocidad de centrifugacin se expresa indirectamente en trminos de la fuerza centrfuga resultante y su relacin con la constante g de gravedad. Por ejemplo, una velocidad correspondiente a 1000g es aquella a la cual las partculas son sometidas a una aceleracin 1000 veces mayor que la gravedad. Puesto que los distintos componentes celulares difieren en su masa y densidad, van a tender a sedimentar a distintas velocidades. Esto implica que, realizando sucesivos pasos de centrifugacin variando la fuerza centrfuga y la duracin, puede hacerse que algunos componentes celulares sedimenten mientras que otros permanezcan en suspensin. Esta metodologa se conoce como centrifugacin diferencial. 1. Homogenizacin
Disgregacin; Lisis Lisis celular

Tejido

Clulas disgregadas

Clulas lisadas

2. Centrifugacin Diferencial

1 centrifugacin

2 centrifugacin

3 centrifugacin

10 min 800g

15 min 20.000g

60 min 105.000g

pellet

Fraccin nuclear Fraccin mitocondrial Fraccin microsomal

Homogeneizado
sobrenadante

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En la figura se esquematiza un ejemplo de fraccionamiento subcelular. Por ejemplo, partiendo de un rgano como puede ser el hgado, se procede a la disgregacin mecnica y lisis celular obtenindose un homogeneizado, es decir una suspensin con los componentes celulares. Si se centrifuga este homogeneizado, a baja velocidad por un tiempo corto (10 minutos a 800g) se obtiene un sedimento o pellet que contiene los ncleos, es decir la fraccin nuclear. Los ncleos son las primeras partculas en sedimentar ya que poseen el coeficiente de sedimentacin ms grande (106 -107 S). Si se extrae el sobrenadante (todo aquello del homogeneizado que no sediment) se transfiere a otro tubo y se vuelve a centrifugar ahora a mayor velocidad y durante ms tiempo (15 minutos a 20.000g), se obtiene un segundo pellet que contiene la fraccin mitocondrial. Si se repite el procedimiento y se centrifuga el segundo sobrenadante (60 minutos a 105.000g) se obtiene la fraccin microsomal, es decir vesculas de membrana intracelular y ribosomas principalmente. El sobrenadante de esta tercera centrifugacin constituye la fase soluble o citosol de la clula, que contiene protenas solubles, cidos nucleicos, polisacridos, lpidos y otras partculas pequeas. Cuando comienza la centrifugacin las partculas se encuentran distribuidas en todo el tubo, por tal motivo, partculas pequeas que se encuentren cerca del fondo llegarn rpidamente al sedimento o sern arrastradas por las partculas ms grandes. Esto hace que las fracciones de los organelos ms grandes estn contaminados con organelos ms pequeos. Por lo tanto si se quieren eliminar organelos ms pequeos de las fracciones de organelos ms grandes, deben hacerse varias centrifugaciones para deshacerse de los primeros. Alternativamente se pueden realizar centrifugaciones en gradiente de densidad. En un tubo se colocan soluciones (sacarosa, percoll, ficoll, etc) de densidad creciente hacia el fondo del tubo, y en la parte superior se coloca el homogeneizado. La partcula sedimentar hasta alcanzar la posicin en el gradiente que presente igual densidad.

Homogeneizado en Sacarosa 1M Sacarosa 2M

En el esquema, por ejemplo, se coloca un homogeneizado sobre una solucin de sacarosa 2M. En estas condiciones slo son capaces de sedimentar los ncleos, que son las partculas ms densas, y no as el resto de los organelos, que permanecern en la parte superior del tubo.

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Da 1: NUCLEO Objetivo:
Identificacin de una fraccin subcelular enriquecida en ncleos mediante la reaccin de Feulgen y comparacin con ncleos en cortes histolgicos. Estudio de la ultraestructura del ncleo.

Introduccin:
El ncleo es el organelo celular donde se localiza el ADN. Su forma vara dependiendo del tipo celular, puede ser esfrico, ovoide o multilobulado. Su tamao oscila entre 3 a 15 m y su posicin depende del tipo celular. Est delimitado por una envoltura nuclear constituida por dos membranas celulares (dos bicapas lipdicas) separadas por una cisterna perinuclear. Esta envoltura se contina en el citoplasma con el retculo endoplsmico rugoso y por lo tanto su cara externa presenta ribosomas asociados.

poro nuclear Componente fibrilar denso Eucromatina

Nucleolo

Envoltura nuclear Heterocromatina Componente granular

Componente fibrilar

Retculo endoplsmico rugoso

Imagen cedida por la Unidad de Microscopa Electrnica de la Facultad de Ciencias

En la cara interna de la envoltura se localiza una red de filamentos intermedios denominada lmina nuclear, constituida por las protenas denominadas laminas. Tanto la lmina nuclear como la envoltura se ven interrumpidas en regiones denominadas poros nucleares, destinados al transporte de molculas desde y hacia el citosol. En el interior del ncleo el ADN que constituye los cromosomas se empaqueta con protenas denominadas histonas. El conjunto del ADN, las histonas, y protenas cromosmicas no histonas, se denomina cromatina. La unidad fundamental de empaquetado recibe el nombre de nucleosoma y est constituido por un octmero de histonas rodeado por dos vueltas de ADN. La cromatina posee diversos grados de compactacin dentro del ncleo, y pueden existir variaciones durante el ciclo celular. En su estado ms laxo o descondensado la cromatina se denomina eucromatina y se aprecia en microscopa electrnica de transmisin como regiones electrn-lcidas (ver figura). Esta cromatina es transcripcionalmente activa ya 36

que permite el acceso de factores de transcripcin y toda la maquinaria enzimtica necesaria para la transcripcin. La cromatina condensada se denomina heterocromatina y se observa en microscopa electrnica de transmisin como regiones electrn-densas, generalmente asociadas a la envoltura nuclear. Esta cromatina se asocia con estados transcripcionalmente inactivos ya que dificulta el acceso de factores de transcripcin al ADN. Es importante recordar que la compactacin y descompactacin de la cromatina son fenmenos reversibles. El nucleolo es una regin dentro del ncleo, no delimitada por membrana, donde ocurre la transcripcin del ARNr y ensamblado de las subunidades ribosomales. All se localizan loops de ADN de distintos cromosomas, que contienen clusters de genes de ARNr. Cada uno de estos clusters se denomina Regin Organizadora Nucleolar (NOR). En una micrografa electrnica de transmisin pueden distinguirse tres regiones en el nulceolo: (1) una regin plida denominada componente fibrilar o centro fibrilar que contiene ADN que no est siendo transcrito, (2) un componente fibrilar denso que contiene molculas de ARN que estn siendo sintetizadas, y (3) componente granular que contiene particular precursoras ribosomales en maduracin. El tamao del nucleolo refleja su actividad por lo que vara en distintos tipos celulares y puede variar tambin dentro de una misma clula. En esta prctica, analizaremos una fraccin subcelular obtenida mediante el siguiente protocolo a partir de un hgado de rata: (no ser realizado en la clase)
- Homogeneizacin del hgado de rata en un homogeneizador Potter-Elvehjem, (10% peso/volumen) en 0.32 M sacarosa, 3 mM MgCl2 en bao de hielo con 20 incursiones del mbolo. - Filtracin en gasa del homogeneizado. - Centrifugacin del filtrado a 700g, durante 10 min a 4C. - Resuspensin del pellet en 2.4 M sacarosa, 1 mM MgCl2 y centrifugacin a 50000g durante 1h a 4C. - El pellet resultante se resuspende en un pequeo volumen de 2.4 M sacarosa, 1 mM MgCl2, 10% glicerol y se conserva a -20C hasta el momento de usar.

Para realizar el anlisis de esta fraccin utilizaremos la reaccin de Feulgen. Este es un mtodo de determinacin cualitativa y cuantitativa de ADN in situ. Analizaremos adems de los ncleos ntegros (fraccin subcelular), los ncleos en cortes histolgicos utilizando la misma reaccin. El primer paso de esta reaccin incluye la hidrlisis del ADN con HCl 1N a 60C, de manera de extraer las purinas nicamente, dejando un grupo aldehdo expuesto en la posicin 1' de las desoxirribosas. La preparacin se incuba luego con el reactivo de Schiff (incoloro a causa del tratamiento con H2SO3), el que se combina con esos grupos aldehdo libres restaurando el grupo cromgeno de la molcula (cada molcula del reactivo de Schiff se combina con 2 grupos aldehdo), dando una coloracin fucsia. El ARN no se marca con esta tcnica ya que se hidroliza casi completamente durante el primer paso de la reaccin y el ARN remanente no se encuentra depurinado.

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purina

pirimidina

pirimidina

pirimidina

HCl 1N 60C

S: Ractivo de Schiff

Actividad Prctica: Parte A

1) Reaccin de Feulgen sobre macromolculas en solucin: validacin del mtodo. Prepare los tubos eppendorf 1, 2 y 3 de acuerdo a la tabla adjunta TUBO AGUA DESTILADA BSA (1mg/ml) ADN (1mg/ml) HCl (1N) REACTIVO DE SCHIFF
BSA = sero-albmina bovina (protena)

1 -----100 l -----100 l 100 l

2 ----------100 l 100 l 100 l

3 100l ----------100 l 100 l

DEJAR 10 MINUTOS A 60C y ajustar pH con 100l de Tris 0.5M pH11. AGITAR DEJAR 15 MIN EN OSCURIDAD (TEMPERATURA AMBIENTE )

2) Utilizacin de la reaccin de Feulgen para la identificacin de una fraccin subcelular enriquecida en ncleos. Traspase una gota de la fraccin nuclear a un portaobjetos para su observacin al microscopio. Utilice el volumen restante para la reaccin de Feulgen. Agregue 100 l de HCl 1N e incbelo a 60C durante 30 min. Ajuste el pH agregando 100 l de Tris 0.5M pH11. Agregue 100 l de reactivo de Schiff e incube 20 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Equilibre el tubo problema con otro tubo de centrfuga. 38

Centrifugue durante 1 minuto a 2000 rpm. Observe la fraccin nuclear (tratada y no tratada) al microscopio poniendo una gota entre porta y cubreobjeto.

3) Reaccin de Feulgen sobre cortes histolgicos ("in situ"). Cubra el corte con unas gotas de HCl 1N durante 20 min a 60 C (verificar que no se evapore el HCl). Enjuague brevemente con agua destilada. Incube el preparado con unas gotas de reactivo de Schiff durante 15 min a temperatura ambiente, mantenindolo en la oscuridad. Enjuague con agua destilada. Enjuague varias veces en baos sulfurosos (*) Enjuague con agua corriente y destilada. Tia el citoplasma con Fast Green durante 2-3 min. Enjuague con agua destilada. Monte el preparado y observe al microscopio.

(*) Baos sulfurosos: preparar en el momento, mezclando 3 ml de metabisulfito de sodio al 5%, 1,5 ml de HCl 1N y completando a un volumen final de 25 ml con agua destilada.

Parte B:
1) Observacin de preparaciones histolgicas Observe a mayor aumento la estructura de los ncleos en los siguientes preparados: - Msculo estriado esqueltico (hematoxilina y eosina). Observe los ncleos de las fibras musculares, que se ven como grandes clulas alargadas de citoplasma intensamente eosinfilo. - Mdula espinal, corte transversal (hematoxilina y eosina). Busque las motoneuronas en las astas ventrales de la mdula, identificables por su gran tamao y la intensa coloracin con hematoxilina del citoplasma. Compare sus ncleos con los de otras clulas que las rodean. - Testculo de pez, corte transversal de los tbulos seminferos (hematoxilina y eosina). Identifique las espermtidas maduras y los espermatozoides (muy similares en estructura), como las clulas de menor tamao del tejido. Compare sus ncleos con los de otras clulas que las rodean.

2) Observacin de micrografas electrnicas. Planchas 1 a 18 y 101 a 107

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INFORME: Mdulo 3, Da 1.
Parte A:
1) Indique si la reaccin de Feulgen sobre macromolculas en solucin fue positiva o negativa: Tubo 1 (BSA) _________________ Tubo 2 (ADN) _________________ Tubo 3 (Agua) _________________ a) Cul es la finalidad de los tubos 1 y 3? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ b) Qu concluye de este resultado? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ 2) a) Cmo se observa el sedimento luego de centrifugar la fraccin tratada con la reaccin de Feulgen? _______________________________________________________________________ b) Si al concluir la centrifugacin usted observa que el sobrenadante del tubo presenta una coloracin rosada: qu podra inferir sobre el estado de los ncleos de la preparacin? _______________________________________________________________________ 2) y 3) Realice un esquema de la observacin microscpica de la fraccin nuclear y del preparado histolgico de hgado de rata, sometidos a la reaccin de Feulgen. (Objetivo 40X) Fraccin nuclear Corte de hgado de rata

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Parte B:
1) Luego de observar los cortes histolgicos coloreados con hematoxilina y eosina, complete, siempre que sea posible, los casilleros del siguiente cuadro:
TIPO CELULAR Fibra muscular estriada Motoneurona Espermtida madura N NCLEOS POR CLULA FORMA DEL NCLEO UBICACIN DEL NCLEO ESTADO DE LA CROMATINA

2) Observe las micrografas y responda a las siguientes preguntas: 1) Cmo se observan, en microscopa electrnica de transmisin, los sectores de cromatina condensada o heterocromatina? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ 2) Plancha 101: cul de estas clulas podra tener una mayor actividad de sntesis proteica? En qu basa su respuesta? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ 3) Plancha 102: seale dos diferencias entre los ncleos de las clulas que se observan en las micrografas. _______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 41

4) La plancha 105 ilustra la ultraestructura del nuclolo a- Es el nucleolo una estructura permanente en las clulas? Justifique su respuesta. _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ b- Estas estructuras estn ms desarrolladas en clulas con sntesis proteica baja o activa? Justifique brevemente. _______________________________________________________________________ c- Como se denomina la regin del cromosoma involucrada en la formacin del nuclolo y qu genes contiene? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ d- Observe la plancha 105d. Cuando los nucleolos se disgregan sobre una interfase acuosa, aparecen estas estructuras en forma de pinos de navidad, que representan la hebra de ADN y las molculas de ARNr 45S en diferentes momentos de su transcripcin. En cada pino, cules son las molculas de ARNr ms avanzadas en su sntesis? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ 5) Qu tcnica microscpica utilizara para analizar la estructura del poro nuclear? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

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Da 2: MITOCONDRIA Objetivos:
Identificacin de una fraccin subcelular enriquecida en mitocondrias mediante la deteccin de actividad de la enzima succinato deshidrogenasa (SDH). Estudio de la ultraestructura de la mitocondria.

Introduccin
La mitocondria es el lugar donde ocurre la mayor parte de las reacciones del metabolismo oxidativo en las clulas eucariotas. Esto es, es el sitio en el cual se realiza la mayor parte de la degradacin oxidativa de compuestos como carbohidratos, cidos grasos y aminocidos, que terminan dando lugar a la generacin de energa en forma de sntesis de ATP. La mitocondria es un organelo de morfologa y tamao variables, pero que tpicamente tiene una forma elipsoide, de aproximadamente 0,5 m de dimetro y 1 m de largo. Las mitocondrias estn delimitados por dos membranas, una membrana externa lisa y una membrana interna extensamente invaginada. El espacio entre ambas membranas se conoce como espacio intermembrana, y las invaginaciones de la membrana interna, que amplan enormemente su rea, se denominan crestas. El compartimento interno de la mitocondria es la matriz mitocondrial. Mientras que la membrana externa permite la difusin libre de molculas de hasta 10 kD, la membrana interna solo deja pasar libremente O2, CO2 y H2O, y posee varios transportadores que controlan el pasaje de diversos metabolitos.
membrana externa membrana interna

espacio intermembrana

matriz mitocondrial cresta

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H+

espacio intermembrana
ee-

H+

H+

complejo NADH deshidrogena sa

complejo citocro mo b-c1

e-

cit c

e-

complejo citocro mo oxidasa

membrana interna
2 H 2O

FAD NAD+ 4 H+ + O2

acetil-CoA NADH NAD+ malato CICLO DE KREBS fumarato FADH2 FAD succinato succinil-CoA NADH oxalacetato citrato

matriz mitocondrial
NAD+

isocitrato

NADH -cetoglutarato NAD+

En la figura anterior se esquematizan dos de los principales procesos metablicos que ocurren en la mitocondria, y que nos van a permitir identificarla: el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. El resultado neto del ciclo de Krebs es la oxidacin de un grupo acetil (CH3C=O) perteneciente a la acetil-CoA a dos molculas de CO2, y en paralelo la reduccin de tres NAD+ y un FAD para dar 3 NADH y un FADH2, respectivamente. Todas las enzimas que catalizan las reacciones del ciclo de Krebs se hallan en la matriz mitocondrial, excepto la succinato deshidrogenasa, cuya actividad mediremos, que est inserta en la membrana interna mitocondrial. En la cadena respiratoria, los electrones de alta energa del NADH y el FADH2 pasan por sucesivos complejos aceptores de potencial redox creciente, con lo que esta energa se va liberando. En cada complejo se bombean protones hacia el espacio intermembrana, con lo que se establece una diferencia de concentracin de H+ (y de carga) a travs de la membrana mitocondrial interna. La energa liberada por el transporte de electrones queda almacenada en forma de un gradiente electroqumico. Los tres complejos, as como los dos transportadores, que constituyen la cadena respiratoria, estn insertos en la membrana mitocondrial interna. Los electrones provenientes del NADH pasan al complejo NADH deshidrogenasa, y de all pasan a la coenzima Q, una pequea molcula hidrofbica, que los transporta al complejo citocromo b-c1. Los citocromos son protenas que contienen grupos hemo, en los que un tomo de hierro alterna entre los estados de oxidacin Fe(II) y Fe(III). Existen varios tipos de 44

citocromos, que pueden hallarse formando parte de complejos, o bien aisladas, como el citocromo c, que transporta electrones del complejo citocromo b-c1 al complejo citocromo oxidasa. En este complejo, los electrones llegan a su aceptor final, el O2, para formar H2O. La oxidacin del FADH2 es menos favorable que la del NADH, y sus electrones entran en la cadena respiratoria ms adelante, siendo cedidos a la coenzima Q. El FADH2 est unido covalentemente a la succinato deshidrogenasa, que est inserta en la membrana mitocondrial interna, como mencionamos ms atrs. La succinato deshidrogenasa es una enzima que slo se encuentra en mitocondrias, y por lo tanto la medicin de su actividad puede usarse para detectar la presencia de mitocondrias en una fraccin subcelular.

Actividad Prctica: Parte 1.

Identificacin de mitocondrias en una fraccin subcelular: Deteccin de actividad succinato deshidrogenasa. La actividad de la enzima succinato deshidrogenasa se determinar indirectamente, midiendo la reduccin de un aceptor artificial de electrones por parte del FADH2, que se genera a consecuencia de la oxidacin de succinato catalizada por la enzima. El aceptor de electrones es el 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP), que en su forma oxidada es azul (con una absorbancia mxima a 600 nm) y en su forma reducida es incoloro. La reduccin del DCPIP se seguir espectrofotomtricamente. Succinato COO CH2 CH2 COO DCPIP reducido. (Incoloro) E-FAD E-FADH2 Fumarato COO CH CH COO DCPIP oxidado. (Azul)

Puesto que estamos trabajando con una fraccin enriquecida en mitocondrias, y no con la enzima purificada, hay que tener en cuenta lo siguiente: los electrones del FADH2 pueden, o bien entrar a la cadena respiratoria, o bien reducir al DCPIP. Si deseamos medir la actividad de la succinato deshidrogenasa mediante la reduccin del DCPIP, debemos asegurarnos que el FADH2 solamente ceda sus electrones al DCPIP. Por lo tanto, es necesario inhibir la cadena respiratoria, y para ello usaremos el NaN3 (azida de sodio), que inhibe el funcionamiento del complejo citocromo c oxidasa.

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Ud. contar con los siguientes reactivos; a partir de stos realice un diseo experimental que le permita cumplir los objetivos planteados: Succinato de sodio 0.24M DCPIP 1 mM NaN3 Buffer Agua Fraccin mitocondrial Proceda segn el siguiente protocolo experimental: Diluir la fraccin mitocondrial con 0.4 ml de buffer. Numere los y pipetee de acuerdo a lo indicado en el cuadro que Ud. elabor. BUFFER NaN3 SUCCIN. 0.24 M DCPIP 1 mM AGUA

TUBO

- Ajuste el espectrofotmetro a 600 nm (debe encenderse unos minutos antes de comenzar a medir). - Agite la suspensin de mitocondrias por inversin - Ajuste el aparato para llevar la absorbancia a 0, de forma de asegurarse de solo medir la absorbancia del DCPIP. - Agregue 0.1 ml de la suspensin de mitocondrias para desencadenar la reaccin y agite intensamente. - El curso de la reaccin se seguir espectrofotomtricamente, determinando la absorbancia del DCPIP a diferentes tiempos. - Mientras se realizan las medidas, los tubos deben ser agitados peridicamente para evitar la sedimentacin de la fraccin purificada.

Parte 2
Estudio de la ultraestructura de la mitocondria Para analizar la ultraestructura de la mitocondria, se observarn las micrografas electrnicas N 6, 109, 110 y 111.

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INFORME: Mdulo 3, Da 2.
PARTE 1
I) Registre las medidas de absorbancia a 600 nm en funcin del tiempo, en la siguiente tabla. MINUTOS TUBO

Represente en una grfica de absorbancia vs. tiempo los valores obtenidos.

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1. Qu indica el cambio de absorbancia observado? A qu se debe la diferencia en el cambio de absorbancia que hay entre los diferentes tubos? _______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________

2. La actividad enzimtica suele expresarse como la pendiente inicial de la grfica que sigue una reaccin enzimtica. Usualmente esta grfica registra la concentracin de sustratos o productos en funcin del tiempo, por lo que la actividad tiene unidades de concentracin sobre tiempo. En nuestro caso, la grfica es de absorbancia (que no tiene unidades) en funcin de tiempo. En trminos de esta grfica, exprese la actividad de la succinato deshidrogenasa. Qu tubo utilizar para esta determinacin? Justifique su respuesta. _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

3. Observ algn cambio en las lecturas de absorbancia en el tubo sin succinato de sodio? En caso de responder afirmativamente, a qu puede deberse? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ 4. Tomando en consideracin nicamente los datos espectrofotomtricos, se puede afirmar que hay mitocondrias en la suspensin estudiada? Puede afirmarse que slo haya mitocondrias? _______________________________________________________________________

Parte 2
Mida, en las micrografas, el dimetro mitocondrial y el espesor del espacio intermembrana. Dimetro mayor y menor de la mitocondria (si corresponde): ___________________ Espesor del espacio intermembrana: ___________________

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Da 3: CLOROPLASTO Objetivos:
Obtencin de una fraccin subcelular enriquecida en cloroplastos. Identificacin de cloroplastos en dicha fraccin. Estudio de la ultraestructura del cloroplasto.

Introduccin
En algas y plantas superiores, la fotosntesis ocurre en el cloroplasto. Este organelo posee, al igual que la mitocondria, una envoltura compuesta de dos membranas, una externa y una interna, pero adems posee un tercer sistema de membrana, la membrana tilacoidal. Esta membrana forma pequeos sacos aplanados, denominados tilacoides, cuyo lumen es el espacio tilacoidal. Los tilacoides se apilan, formando bloques denominados grana (cada bloque en singular es un granum). Los grana estn interconectados por regiones de la membrana tilacoidal alargadas, denominadas laminillas del estroma, cuyo lumen es continuo con el espacio tilacoidal. El estroma es el espacio interno del cloroplasto que queda por fuera de la membrana tilacoidal.
membrana externa membrana interna

espacio tilacoidal laminilla del estroma

tilacoide

estroma

grana

La fotosntesis es un complejo proceso en el cual la energa de la luz se usa para generar energa qumica en forma de ATP y poder reductor en forma de NADPH, que se usan a su vez para convertir el CO2 del aire en carbohidratos, liberndose paralelamente O2 a partir de agua (en plantas, algas y algunas bacterias). La reaccin global de la fotosntesis es: 6 CO2 + 6 H2O luz 6 O2 + C6H12O6

Las reacciones de la fotosntesis pueden agruparse en dos clases, las reacciones fotoqumicas, que ocurren en la membrana tilacoidal y en las que se generan ATP y NADPH, y las reacciones bioqumicas, que comienzan en el estroma del cloroplasto y continan en el citosol, en las que el CO2 es convertido en carbohidratos.

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luz

estroma

luz

NADP+ + H + membrana tilacoidal NADPH

fotosistema II e-

pQ

e-

complejo b6-f

e-

pC

e-

fotosistema I

e-

Fd

e-

NADP reductasa

4 H + + O2 2 H2 O
H+

espacio tilacoidal

Las reacciones fotoqumicas, mediante las que se obtiene ATP y NADPH. constituyen un proceso de dos fases, denominado fotofosforilacin no cclica, para distinguirlo de otro proceso, la fotofosforilacin cclica, en el que solo se genera ATP. En la primera fase de la fotofosforilacin no cclica, la absorcin de luz por el fotosistema II le permite remover electrones provenientes del agua y transferirlos a una cadena de transporte, hasta llegar al fotosistema I. All, una nueva absorcin de luz confiere suficiente energa a los electrones para poder reducir a su aceptor final, el NADP+, formando NADPH. Los fotosistemas son complejos formados por varios polipptidos y distintos tipos de pigmentos, y en ellos la luz absorbida se utiliza para excitar a un electrn en una molcula de clorofila particular. En el fotosistema II, este electrn es transferido a la plastoquinona, una pequea molcula anloga a la coenzima Q de la fosforilacin oxidativa. Cada electrn transferido por el fotosistema II se repone con uno proveniente del agua, en una compleja reaccin cuyo resultado final es la liberacin de O2 a partir de agua. La plastoquinona transfiere electrones al complejo b6-f, anlogo al complejo b-c1 de la mitocondria, el cual bombea protones dentro del espacio tilacoidal. La plastocianina, una pequea protena que contiene un tomo de cobre que vara de estado de oxidacin, transporta electrones desde el complejo b6-f hasta el fotosistema I. All, la absorcin de un fotn aumenta la energa de estos electrones, que pueden reducir a la ferredoxina, una pequea protena con un grupo prosttico que contiene hierro y azufre. Esta a su vez transfiere los electrones al NADP+, en una reaccin catalizada por la enzima NADP reductasa. Adems de generar NADPH, este proceso de transporte de electrones provoca la acumulacin de protones en el espacio tilacoidal, con la consecuente generacin de un gradiente electroqumico a travs de la membrana tilacoidal, el cual es usado para sintetizar ATP. En 1937, Robert Hill descubri que cuando cloroplastos aislados son iluminados en ausencia de CO2, son capaces de reducir un aceptor artificial, liberando O2 paralelamente. Este resultado fue una de las primeras demostraciones de que el CO2 no participa directamente en el proceso que produce O2, y puede resumirse en la siguiente reaccin qumica, denominada reaccin de Hill: H2O + A luz, cloroplastos AH2 + O2

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Actividad Prctica: Parte 1

Para identificar cloroplastos en una fraccin subcelular, pondremos en evidencia la reaccin de Hill, usando como aceptor artificial de electrones al 2,6-diclorofenolindofenol (DCPIP), el cual oxidado tiene un color azul y absorbe mximamente a 600 nm, mientras que reducido es incoloro. En la presente prctica se medir la velocidad normal de la reaccin de Hill comparndola con la velocidad obtenida en presencia de un inhibidor de la fotosntesis: 3,4-diclorofenil1,1-dimetilurea (DCMU). Este inhibidor, usado como herbicida, bloquea el transporte de electrones desde el fotosistema II a la plastoquinona. Tambin comprobaremos si la reaccin de Hill puede ocurrir en ausencia de luz. Proceda segn el siguiente protocolo experimental: 1. Obtencin de una fraccin subcelular rica en cloroplastos - Corte 4 hojas de espinaca o acelga, eliminando las nervaduras. - Tritrelos en un mortero previamente enfriado, con 10 ml de buffer 0.02M Tris-HCl, pH 7.5, 0.35M NaCl (levemente hipertnico). - Filtre en gasa. - Centrifugue el filtrado a 400g (50%) durante 1 min a 4C. - Centrifugue el sobrenadante a 1000g (90%) durante 5 min a 4C. - Resuspenda el precipitado en 10 ml de buffer inicial. - Esta solucin diluida es la que se emplear para seguir la Reaccin de Hill. 2. Identificacin de cloroplastos en la fraccin subcelular obtenida. Proceda segn el siguiente protocolo experimental: - Rotule 6 tubos y pipetee de acuerdo a lo indicado en el cuadro: TUBO 1 2 3 B (x3) BUFFER 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml 3.5 ml DCPIP (4x10-4 M) 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml ------DCMU (2x10-4 M) ------------0.5 ml ------AGUA 0.5 ml 0.5 ml ------1.1 ml

- Prepare tres tubos B - Ajuste la longitud de onda del espectrofotmetro a 600 nm. - Agregue 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos al tubo B y agtelo bien. Intente ajustar el espectrofotmetro a cero. Si ello no es posible debido a que el tubo B queda muy coloreado, agregue 0.3 ml de la suspensin al segundo tubo B. Si todava no es posible ajustar a cero, agregue un volumen menor (0.2 o 0.15 ml) al tercer tubo B. - Envuelva el tubo 1 en papel aluminio, agregue la misma cantidad de cloroplastos, agite y mida inmediatamente la absorbancia, este tubo ser el control no iluminado. La reaccin se desencadena con el agregado de la fraccin de cloroplastos (el mismo volumen que se agrega al tubo B) y la exposicin del tubo a la luz. La reaccin se sigue espectrofotomtricamente leyendo a intervalos de 1 min. Realice un ajuste de transmitancia y del blanco antes de tomar cada medida.

Parte 2: Observe las micrografas n 301, 302.

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INFORME: Mdulo 3, Da 3.
I) Realice un esquema de la fraccin enriquecida en cloroplastos obtenida, observada con el objetivo 40X.

Registre las medidas de absorbancia a 600 nm en funcin del tiempo, en la siguiente tabla. MINUTOS TUBO 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3

Represente los valores obtenidos en una grfica de absorbancia en funcin del tiempo:

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1. Es necesaria la luz para que ocurra la reaccin de Hill? Cules tubos elegira para fundamentar su respuesta? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

2. Cul es el efecto del herbicida (DCMU) y cmo lo correlaciona con la curva obtenida experimentalmente? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

3. Si se demoraran unos treinta segundos en medir la absorbancia del tubo 1 antes de colocarlo en oscuridad, esperara obtener una diferencia notoria entre la absorbancia de este tubo y la del tubo 3? Justifique brevemente _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________

II) Observando las micrografas electrnicas, mida el espesor de los grana: El espesor de los grana en la foto es: __________________________

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