ISOLAMENTO E CULTIVO DE MICRORGANISMOS

ALGUMAS REGRAS GERAIS PARA A APLICAO DE ABORDAGENS ECOLGICAS PARA O ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS Obs: Podem ser m!"ror'a#!smo( ap !"adas #o !so ame#$o de %&a %&er 'r&po de

)( Listar os grupos de microrganismos que sero isolados. 2. Descrever as caractersticas do ambiente ou habitat do qual as amostras sero coletadas. 3. Agrupar as amostrar em tipos, por exemplo, partes vegetais, solo (tipos e hori ontes!, "gua, insetos... #. Listar os par$metros ambientais a serem considerados e medidos, tais como% p&, salinidade e temperatura. *( Listar os substratos naturais disponveis no ecossistema ex% 'olhas (celulose, lignina!, insetos (quitina!... (. )scolher as t*cnicas de isolamento, isto *% diluentes, substratos, extratos naturais e condi+,es de incuba+o. -. Avaliar os .m*todos de isolamento/ ecol0gicos, usando m*todo padro como controle. +( 1odi2icar os procedimentos conhecidos com base nos par$metros ecol0gicos do material a ser analisado. 3. )mpregar procedimentos de enriquecimento espec2icos para grupos microbianos que possam ser de interesse na sele+o.

TIPOS DE CULTURA% )( C& $&ra M!s$a: mais de um microorganismo crescendo (nature a!. ,( C& $&ra P&ra: aquela que se origina do crescimento de uma 4nica c*lula (pure a gen*tica!. -( C& $&ra A./#!"a: constituda por uma 4nica esp*cie de microrganismo, independente do n4mero de indivduos, num ambiente livre de outros microrganismos (no implica em pure a gen*tica!

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:s microrganismos necessitam de uma 2onte de carbono (g"s carbCnico (5: 2! ou carbono org$nico! e de uma 2onte de energia (lu ou energia derivada da oxida+o de compostos org$nicos ou inorg$nicos!. :s microrganismos que usam a lu como 2onte de energia podem ser% 'otoautotr02icos ou 2otolitotr02icos% so organismos que usam a lu como 2onte de energia e o carbono inorg$nico (5: 2! como 2onte de carbono. 6o representados pelas bact*rias 2otossinteti antes (cianobact*rias!, bact*rias sul2urosas p4rpura (exemplo% Chromatium! e bact*rias sul2urosas verdes (exemplo% Chlorobium!, algas e plantas verdes. )xistem cerca de (D esp*cies de bact*rias 2otoautotr02icas. 'otoheterotr02icos ou 2otorganotr02icos% usam lu como 2onte de energia e compostos org$nicos ("lcool, carboidratos, "cidos org$nicos, etc.! como 2onte de carbono. 6o as bact*rias verdes no sul2urosas (exemplo% Chloroflexus! e as bact*rias p4rpuras no sul2urosas (exemplo% Rhodopseudomonas !. :s microrganismos que obtEm energia atrav*s da oxida+o de compostos org$nicos ou inorg$nicos podem ser classi2icados em% Fuimioautotr02icos ou quimiolitotr02icos% usam os compostos qumicos (g"s sul2drico (&26!, enxo2re elementar (6!, amCnia (=& 3!, g"s hidrogEnio (&2!, nitrato (=:3G!, nitrito (=:2G! e 2erro ('e2H! como 2onte de energia e usam o 5: 2 como 2onte de carbono. Fuimioheterotr02icos ou quimiorganotr02icos% so organismos que usam compostos org$nicos como 2onte de energia e de carbono. )ste grupo inclui a maioria das bact*rias, 2ungos e proto o"rios.

Pr!#"!pa!s $!pos #&$r!$!0os das ba"$1r!as

MEIOS DE CULTURA Me!os S!#$1$!"os: so meios de composi+o qumica de2inida (pouco uso!. 2'ar o& "a do #&$r!$!0os: meios com adi+o de extrato de carne, peptona, agar, extrato de levedura. Iromovem o desenvolvimento de uma ampla gama de microrganismos. Es"o 3a do me!o: E#0o 0e: tipoJgrupo microbiano (bact*rias, 2ungos, algas! )x.% Escherichia coli / tipo selvagem * prototr02ico (autosu2icientes!. 1utantes so auxotr02icos (nutricionais! 'ungos de maneira geral exigem pouco nitrogEnio para crescer.

T!pos de me!os: 5onsiderando que alguns microrganismos heter0tro2os apresentam exigEncias nutricionais espec2icas K heter0tro2os 2astidiosos G, as quais no so supridas pelo caldo nutritivoJou agar, existem meios especiais que permitem o estudo destes heter0tro2os. )( Me!os e#r!%&e"!dos: so adicionados% sangue, soro ou extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldoJou "gar nutritivos, o que proporciona nutrientes acess0rios. ,( Me!os se e$!0os: ('igura L! G certas subst$ncias adicionadas ao meio selecionam um grupo, impedindo o crescimento de outro. ,()( )x% : cristal violeta L%2DD.DDD a L%3DD.DDD K 7mpede o crescimento das bact*rias <ramGpositivas, enquanto a Escherichia coli (<ramGnegativa! * sensvel a uma concentra+o LD x maior. 2.2. )x% 6endo a maltose a 4nica 2onte de carbono no meio. A ausEncia de outras 2ontes de carbono ir" selecionar aqueles microrganismos que utili am a maltose como 2onte de energia. -( Me!os D!4ere#"!a!s: ('igura 2! G servem para di2erenciar tipos espec2icos de microrganismosM as subst$ncias incorporadas ao meio, resultam num tipo de crescimento ou modi2ica+o do meio. E.: 7noculandoGse uma mistura de bact*rias no meio de "garGsangue veri2icaGse% Nonas claras ao redor da colCnia K Aact*rias hemolticas (causam hem0lise!. IodeGse di2erenciar bact*rias hemolticas das noGhemolticas. :A6.% OgarGsangue serve como meio enriquecido e di2erencial. 5( Me!os de dosa'em: de composi+o de2inida, so empregados para dosagem de vitaminas, amino"cidos e antibi0ticos. Iodem ser utili ados para avaliar a e2iciEncia de desin2etantes. *( Me!os para "o#$a'em de ba"$1r!as % sua composi+o obedece a recomenda+,es prescritas. 6o meios espec2icos indicados para determinar o conte4do bacteriano da "gua e o leite. 6( Me!os para a !de#$!4!"a78o: existe uma grande variedade de meios para bact*rias e 2ungos, cuPa 2inalidade * auxiliar na identi2ica+o. 6eguindoGse as recomenda+,es e as condi+,es de cultivo, podeGse determinar o crescimento, caractersticas da colCnia e altera+,es no meio. 9( Me!os de es$o"a'em o& ma#&$e#78o: A manuten+o adequada da viabilidade e das caractersticas 2isiol0gicas de uma cultura pode exigir um meio di2erente daquele que * recomendado para o seu crescimento 0timo. Ior exemplo% L! o r"pido e luxuriante desenvolvimento pode estar associado Q morte de c*lulasM 2! glicose no meio 2avorece o crescimento, mas libera "cidos. )m meios de estocagem deveGse evitar o seu uso.

'igura L. 'otogra2ias das placas contendo os meios seletivos RLD, OgarGLisina, LRS1, (amostras sem dilui+o! e do meio de contagem geral RL= (dilui+o LDGLD!. =os 3 primeiros meios, so isoladas leveduras no Saccharomyces (Lisina! ou Saccharomyces no cerevisiae (LRS1 e RLD!, pela adi+o de subst$ncias como cristalGvioleta (LRS1! e actidione (RLD!, Qs quais S. cerevisiae * sensvel, e lisina como 4nica 2onte de carbono (meio de Lisina!, a qual linhagens de Saccharomyces no so capa es de utili ar. Desta 2orma, podeGse avaliar o nvel de contamina+o por outras leveduras que no a do processo 2ermentativo para produ+o de etanol (S. cerevisiae). As 2otos so pertencentes Q pro2a. 6andra ;.5.Antonini.

'igura 2. 'otogra2ia de placa com meio di2erencial S)IDGa ul de metileno, tamponado com tampo citrato, p& #,3G#,T e inoculado com uma linhagem sensvel para veri2ica+o de atividade killer de leveduras selecionadas. As colCnias de leveduras que apresentam halo de inibi+o e ona a ul ao redor do halo (primeira e segunda, primeira linha, da esquerda para a direitaM e a primeira, 4ltima 2ila, da esquerda para direita! so consideradas killer enquanto as outras no apresentam atividade killer . A toxina killer * uma protena de baixo peso molecular que * t0xica para algumas leveduras. A 2otogra2ia 2oi retirada da disserta+o de mestrado de 5hristiann D. @osta.

CONDI:ES ;<SICAS NECESS2RIAS AO CRESCIMENTO )( TEMPERATURA !( Isicr02ilos K crescem a DU5 ou menos G 0timo pode ser LT K 2DU5 !!( 1es02ilas K 2aixa% 2T K #DU5 !!!( @erm02ilos K 2aixa% #T K (DU5 )uriterm02ilos (2acultativas! K 2aixa ampla )stenoterm02ilos (term02ilos verdadeiras, obrigat0rias! K 2aixa estreita. A temperatura pode ser utili ada como 2ator seletivo. )x% 5alor VTU5 elimina as 2ormas vegetativas e no elimina esporos de bact*rias. @emperatura 0tima% permite r"pido desenvolvimento num curto espa+o de tempo. - a temperatura 0tima, como 2oi de2inida, pode no ser a ideal para outras atividades.

,( E=IG>NCIAS ATMOS;?RICAS: CO, e O, :s microrganismos podem crescer na presen+a ou ausEncia de oxigEnio e, neste aspecto, podem ser classi2icados em% Aer0bios% so os microrganismos que normalmente requerem oxigEnio para crescer. 'acultativos% so os microrganismos que crescem na presen+a de oxigEnio ou na ausEncia dele (anaerobiose!. Anaer0bios% so os microrganismos que ou crescem na presen+a de baixas concentra+,es de oxigEnio, os chamados de anaer0bios 2acultativos, ou morrem quando esto na presen+a deste g"sM estes so os chamados de anaer0bios estritos. 1icroaer02ilos% so organismos aer0bios, por*m somente crescem concentra+,es de oxigEnio menores que a do ar (entre LW e LTW!. em

-( p@ A ACIDEB E ALCALINIDADE Aact*rias% p& 0timo K (,T e -,T (neutro! 'ungos% p& 0timo ao redor de T,D ("cido! : uso de tamp,es aPuda a impedir varia+,es bruscas do p& durante o perodo de incuba+o. A combina+o X& 2I:# e X2&I:# * largamente empregada em meios de cultura bacteriol0gicos.

MANUTENO E CONSERVAO DE CULTURAS PURAS As cole+,es de culturas de estoque visam% Aulas pr"ticas de laborat0rio @rabalhos de pesquisa ;eagentes em determinados processos.

:bs.% As culturas puras devem ser mantidas em condi+,es adequadas, que mantenham as caractersticas culturais e identi2icadas, permitindo assim o seu uso 2acilmente.

M?TODOS DE CONSERVAO )( Tra#s4er/#"!a para #o0os me!os per!od!"ame#$e( C&!dados: i! veri2icar os meios adequados para cada esp*cie ii! temperatura de estocagem iii! perodo de trans2erEncia do repique iv! cuidar para que no haPa contamina+o da cultura ,( Co#ser0a78o de "& $&ras sob "amada de C eo m!#era . i! cobrir o meio com 0leo mineral est*ril (L cm! 5onsidera+,es% @empo K varia con2orme a esp*cie, algumas mantEmGse vi"veis por anos. >ma parte da cultura pode ser retirada para repique sem prePudicar o material conservado. -( L!o4! !Da78o: Irocesso que consiste na remo+o da "gua de uma suspenso de microrganismos congelados por sublima+o sob presso redu ida. 5onsidera+,es% Longa estabilidade (viabilidade! '"cil estocagem (pequeno volume! 5( Es$o"a'em a ba!.as $empera$&ras =itrogEnio lquido (GL3(U 5! K agente protetor (glicerol ou dimetil sul20xido! 5onsidera+,es% * um processo e2ica e pode substituir a lio2ili a+o, quando as amostras no podem ser lio2ili adas. COLE:ES DE CULTURAS 1arYland G )>A 7nglaterra American @Ype 5ulture 5ollection (A@55! K ;ocZville G 7nstituto Iasteur K Iaris =ational 5ollection o2 @Ype 5ultures K Londres [apanese @Ype 5ulture 5ollection K @0Zio. =acional 5ollection o2 Seast 5ultures (=5S5! K =or\ich,