CURS NR.10 11.06.

2013 METODE MODERNE DE AMELIORARE

SELECIA ASISTAT DE MARKERI MOLECULARI

DISCIPLINA AMELIORAREA PLANTELOR I PRODUCERE DE SMN AN III, SEM. II

PLANUL CURSULUI
METODE MODERNE DE AMELIORARE

Selecia asistat de markeri moleculari (marker-assisted selection MAS)

Plante modificate genetic (PMG)

CLASIFICAREA METODELOR DE AMELIORARE

I. METODE CLASICE (CONVENIONALE) DE AMELIORARE

1. Metode de inducere a variabilitii genetice;

a) Hibridarea (inducerea variabilitii prin recombinaii) b) Mutageneza (inducerea variabilitii prin mutaii)

2. Metode de izolare a genotipurilor valoroase

a) Selecia n condiii de autofecundare; b) Selecia n condiii de fecundare strin

3. Alte metode de ameliorare

a) Consangvinizarea i Heterozisul; b) Androsterilitatea c) Poliploidia

II. METODE MODERNE (NECONVENIONALE) DE AMELIORARE 1. Selecia asistat de markeri moleculari; Analiza QTL (quantitative trait loci); 2. Tehnici de cultur in vitro: tehnologia microsporilor, embriogeneza somatic, variabilitatea somaclonal; 3. Metode i tehnici de inginerie genetic: transformarea genetic prin utilizarea tehnologiei ADN recombinant i obinerea de PMG.

DEFINIIE
M AS - este u n pr oces de selec ie in dir ect u n de car acter u l de in ter es est e select at n u pe baza aspectu lu i exter ior al car acter u lu i n sin e ( pe ba za fen otpipu lu i) , ci cu aju tor u l u n u i m ar k er gen etic din apr opier ea car acter u lu i ( gen ei) d e pe AD N .

ncruciri n ser

Backross-uri n cmp

Ameliorarea convenional P1
Recurent

x
F1 F2

P2
Donor

Populaii largi alctuite din mii de plante

SELECTIA FENOTIPIC

Experiene n ser

Experiene n cmp

Ameliorarea asistat de markeri P1 x P2

Sensibil

Rezistent

F1
F2 Populaii largi alctuite din mii de plante

Selecia asistat de markeri (MAS)

Metoda n care selecia se bazeaz pe markeri ADN

Avan tajele M AS 1. P ot fi iden tificate gen otipu r i cu per for m a n e su per ioa r e n gen er a ii tim pu r ii; 2 . P r ezin t ca pacitatea d e selec ie pen tr u alele r ecesive sau tr s tu r i m a sca te; 3 . P ot fi n locu ite m etodele costisitoa r e de scr een in g; 4 . E st e r apid .

M etoda in dir ect de selec ie cu aju tor u l m ar ker ilor m olecu lar i este pr efer abil selec iei dir ecte n u n ele situ a ii, cu m ar fi: iden tificar ea in divizilor n stadii tim pu r ii de cr eter e i dezvoltar e, pen tr u backcr oss sau pen tr u pr ogr am ele de am elior ar e a u n or popu la ii; n cazu l u n or car acter e er editar e car e im plic m ai m u l i loci (Q T L ); selec ia pen tr u m ai m u lte car acter e

Etapele

analizelor
moleculare

(1) Prelevare de probe frunze de la plante tinere

(2) Extracia de ADN

(3) PCR

(4) Gel de electroforez

(5) Analiza markerilor

CE E ST E M AR K E R UL G E N E T I C? Un m ar ker genetic poate fi or ice r egiune din genom n car e exist o var ia ie detectat car e poate face difer en a ntr e indivizii unei popula ii. D ifer en a car e apar e r ar este num it m uta ie, iar o difer en car e apar e fr ecvent este num it polim or fism . Sistem ele de m ar ker i sunt analizate pe baza a dou cr iter ii: a) con inutul de infor m a ii; b) pr opor ia de m ultiplex.

I nfor m ativitatea unei clase de m ar ker i este r epr ezentat de uur ina m ar ker ilor de a detecta polimor fism ul ntr e doi indivizi. H eter ozigo ia este un bun indicator al nc r c tur ii de infor m a ii. E a este definit ca pr obabilitatea ca cele dou alele luate la ntm plar e dintr -o popula ie s poata fi distinse, utiliznd un mar ker m olecular . P r opor ia de m ultiplex este definit ca fiind num r ul de loci (benzi) analiza i sim ultan per exper im ent (pe gel). P r opor ia de multiplex i heter ozigoia r epr ezint indicele de m ar ker (M I ) Utilizar ea m ar ker ilor se bazeaz pe polim or fism ul existent n popula iile natur ale, car e poate fi clasificat n tr ei categor ii: - de secven

analiza i sim ultan per exper im ent (pe gel). P r opor ia de m ultiplex i heter ozigoia r epr ezint indicele de m ar ker (M I ) Utilizar ea m ar ker ilor se bazeaz pe polim or fism ul existent n popula iile natur ale, car e poate fi clasificat n tr ei categor ii: - de secven - de inser ie / dele ie - de num r al unit ilor car e se r epet n r egiunile cu AD N r epetitiv.

D in punct de veder e genetic, se poate consider a c exist mar keri cu specificitate de locus i codominan i i mar ker i fr specificitate de locus i dominani. Un locus r epr ezint pozi ia ocupat de o gen sau un segment de AD N la nivelul unui cr omozom, iar o alel r epr ezint una dintr e var iantele unei gene car e se g sesc la acelai locus, afecteaz acelai car acter fenotipic i car e se deosebesc ntr e ele pr in polimo r fismul secven ei de nucleotide.

Markerii dominan i pot fi utiliza i pentru studiul diversit ii speciilor, pentru clonarea pozi ional i pentru alctuirea rapid a h r ilor genetice, mai ales la speciile mai pu in studiate. Markerii codominan i se folosesc pentru realizarea h r ilor genetice, pentru cartografierea comparat , pentru cartografierea genelor cu efecte cantitative (QTL ). n func ie de tehnica utilizat , markerii AD N pot fi clasifica i n dou categorii: - markeri pe baz de hibridizare - markeri pe baz de P CR .

Un m ar k er m olecu la r ( AD N ) id eal a r tr ebu i s n deplin ea sc u r m toar ele pr opr iet i: - polim or fism n a tiv r idicat ; - codom in an t pen tr u a pu tea d eter m in a st atu tu l de h om ozigot sa u h eter ozigot al or gan ism elor diploide; - apar i ia fr ecven t n gen om ; - com por ta r ea selectiv n eu tr la con di iile de m ediu i la cele im pu se de a n alizele gen etice; - dispon ibil; - testa r ea u oa r i r a pid ; - posibilit atea m ar e de r epr odu cer e a d eter m in r ilor . Un m ar k er AD N ca r e s n deplin esc toat e aceste con di ii est e dificil d e g sit, da r n fu n c ie d e tipu l de stu diu car e u r m eaz s se fac , se alege u n m ar k er adecva t .

Markerii trebuie s fie la o distan foarte mic de locii int! Markerii ideali ar trebui s fie la o distan de sub 5 cM fa de gena sau genele (QTL) int
Marker A

5 cM
Marker A

QTL

95%
Marker B

5 cM

QTL

~99.5%
5 cM

Utiliznd o pereche de markeri ce flancheaz gena de interes poate crete eficiena seleciei, dar cresc i costurile i timpul

Markerii trebuie s fie polimorfici

RM84
1 2 3 4 5 6 7 8

RM296
1 2 3 4 5 6 7 8
P1 P2

P1 P2

Not polymorphic

Polymorphic!

ADN - extracie

Mojar cu pistil

Plci de porelan

Prelevare probe - frunze

Markeri ADN bazai pe PCR

Tehnic simpl i costuri reduse
PCR Buffer +
MgCl2 + dNTPS + EnzimaTaq +

PCR

Primeri +
Matria de ADN

Termocycler

GEL de electroforez
(agaroz ori poliacrilamid)

Agaroz - gel electroforetic

UV transilluminator Lamp UV

Acrilamid gel electroforetic 1

UV transilluminator

UV light

Acrilamid gel electroforetic 2

I. MARKERI PE BAZ DE PCR

I n 19 8 3 , cer cet tor u l K a r y M u llis descoper o in gen ioa s teh n ic de a m plifica r e a AD N in vitr o n u m it r ea c ia de polim er iza r e n lan ( P olym er ase Ch ain R ea ction P CR ) .

CE ESTE REACIA PCR? Este un procedeu rapid de amplificare enzimatic in vitro a unui segment specific de ADN. CARE SUNT COMPONENTELE REACIEI PCR? 1. Matria de ADN un segment dublu catenar de ADN ce urmeaz a fi amplificat 2. Primeri secvene scurte monocatenare de ARN 3. Enzima ADN polimeraza (component proteic) 4. 4 dezoxinucleotide trifosforice dTTP, dGTP, dATP, dCTP 5. Un tampon de reacie cu sruri (MgCl2,KCl, Tris HCL pH8,4 6. Ulei mineral steril

CARE SUNT ETAPELE REACIEI PCR? ntr-o reacie PCR exist o alternan de 3 temperaturi controlate, care sunt repetate n 25 50 cicluri:

1. DENATURAREA

60 secunde - 94 grade C

1. Renaturarea (prinderea primerilor)

Primer sens (forward primer) ce se prinde de secvena complementar, n sensul regiunii ce va fi amplificat. Primer antisens (reverse primer), ce se leag n josul regiunii.

60 secunde - 60 grade C

3. Extensia

2 minute - 72 grade C
Aceast temperatur este optim pentru activitatea ADN polimerazei (copiaza catena- matrita de ADN, adauga dNTP)

Amplificarea exponenial a ADN-lui

R AP D (R andom am plified polym or ph ic D N A = polim or fism u l AD N am plificat cu pr im er i r andom ici) Aceast teh n ic pr esu pu n e u tilizar ea u n or pr im er i ar bitr ar i (cu lu n gim ea de 10 n u cleotide) pen tr u am plificar ea u n or fr agm en te de AD N fa de car e m an ifest com plem en tar itate. P r oduii de am plificar e su n t an aliza i pr in separ ar ea electr ofor etica n sistem or izon tal n gel de agar oz i se color eaz cu br om u r de etidiu m . M ar ker ii R AP D pot fi u tilizati i n deter m inar ea distan ei gen etice din tr e in divizii n r u di i. M etoda R AP D con stitu ie u n instr u m en t valor os n an alizele biologiei m olecu lar e, m ai ales pen tr u car tar ea i am pr en tar ea gen etic.

AVAN T AJ E - detec ia ner adioactiv; - nu necesit infor m a ii n pr ealabil despr e secven a de AD N din genom ; - sunt utiliza i ca m ar ker i univer sali pentr u or ice genom ; - utilizeaz o cantitate m ic de AD N genom ic; - detectar ea m ultipl a polim or fism ului; - sim plitate exper im ental ; - nu necesit echipam ente scum pe.

D AF (D N A am plification finger pr inting = am pr ente genetice ale pr oduilor am plificr ii) Utilizeaz pr imer i ar bitr ar i foar te scur i cu lungim ea de 5 -8 nucleotide pentr u am plificar ea AN D . P r oduii de am plificar e sunt separ a i pe gel de poliacr ilam id i vizualiza i pr in color ar e cu ar gint. T ehnica D AF necesit o optim izar e cu gr ij a par am etr ilor , dar cu toate acestea este foar te potr ivit pentr u autom atizar e i pentr u m ar car ea cu fluor escen a pr im er ilor . Aceast tehnic este foar te folosit n car tar ea genetic .

II. MARKERI PE BAZ DE HIBRIDIZARE

M ar ker ii R F L P (R estr iction fr agm en ts len gh th polym or phism = P olim or fism u l lu n gim ii fr agm en telor de r estr ic ie)
im p lic a : ** t a ier ea AN D u lu i gen om ic cu en z im e d e r est r ict ie ; ** sep a r a r ea elect r ofo r et ic a a fr a gm en t elor r ez u lt a t e; ** t r a n sfer u l p e o m em b r a n a sp ecia la lib er a d e AD N ( p r oc ed eu l S ou t h er n b lot t in g) ; ** d et ect a r ea p olim or fism elor m od elelor d e b en z i p r in h ib r id a r e cu o sec ven t a com p lem en t a r a d e AD N m a r c a t a , d en u m it a son d a m olecu la r a . ***Acea st a t eh n ica n ec esit a o p r ea la b ila cu n oa st er e a sec ven t ei d e AD N ( son d e clon a le ca r a ct er iz a t e) .

M ar ker ii R F L P se tr ansmit codominant cu r apor tul de segr egare n F 2 de 1:2 :1. L a un individ heter ozigot sunt vizibile ambele benzi alele, ceea ce face posibil diferen ier ea lui de ambii p r in i homozigo i. T ehnica R F L P fur nizeaz mar ker i codominan i i cu specificitate de locus, eviden iind polimor fismul la nivelul anumitor secven e.

PLANTE MODIFICATE GENETIC (PLANTE TRANSGENICE)

Ce este Organismul Modificat Genetic (OMG) ?

Orice organism (cu excepia celui uman) al crui materialul genetic a fost schimbat altfel dect prin ncruciare i / sau recombinare natural.

Plant MG

Bumbac netratat

Bumbac MG - cu toleran la erbicide

Plante transgenice cu toleran la erbicide

Plante modificate genetic, rezistente la atacul unor insecte

Specia Denumirea O.M.G.-lui Caracterul modificat Rezisten la Ostrinia nubilalis Rezisten la Ostrinia nubilalis Rezisten la Ostrinia nubilalis Rezisten la Ostrinia nubilalis Rezisten la Ostrinia nubilalis Rezisten la Leptinotarsa decemlineata Trans gena Originea transgenei Firma care a brevetat O.M.G Mycogen Seeds

Porumb

Pyrausta

Cry 1 A

Porumb

YieldGard

Cry 1 A

Porumb

Furio CB

Cry 1 A

Porumb

MaisGard

Cry 1 A

Porumb

StarLink

Cry 1 A

Cartof

NewleafPotato

Cry 3 A

Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. kurstaki Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. kurstaki Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. kurstaki Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. kurstaki Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. kurstaki Bacillus thuringiensis (Bt) ssp. tenebrionis

Monsanto

Novartis

Pioneer

AgrEvo (Aventis)

Monsanto

Porumb Bt
Bacteria insecticid (Bacillus thuringiensis - Bt) Plante de porumb Bt

Izolarea genei toxinei Bt & introducerea n planta de porumb

Cristale de toxina Bt

Plante de porumb (PMG) Frunzele conin toxina Bt Omizile au fost omorate S-au redus tratamentele chimice