CROMATOGRAFÍA

PRINCIPIOS Y APLICACIONES
ANÁLISIS QUÍMICO
Prof. Manuel Chicharro

1º Ciencia y Tecnología de los Alimentos

Ana Isabel Bautista

Alicia Benayas
Yolanda
Alicia Ortiz
ÍNDICE

1. Conceptos básicos sobre cromatografía..................................... 3

1.1 Introducción................................................................. 3
1.2 Base científica.............................................................. 4
1.3 Terminología en cromatografía.................................... 4

2. Cromatografía plana y en columna……………………………. 7

2.1 Cromatografía en papel……………………………….. 7
2.2 Cromatografía en capa fina…………………………… 7
2.3 Cromatografía en columna……………………………. 11

3. Cromatografía Líquida de Alta Resolución. HPLC…………… 13

3.1 Fundamentos y principios básicos…………………… 13
3.2 Instrumentación………………………………………. 16
3.3 Aplicaciones al análisis de los alimentos…………….. 18

4. Cromatografía de gases………………………………………… 19
4.1 Fundamentos y principios básicos……………………. 19
4.2 Instrumentación………………………………………. 19
4.3 Aplicaciones al análisis de los alimentos……………... 21

Bibliografía………………………………………………………...22

2
1. CONCEPTOS BÁSICOS SOBRE CROMATOGRAFÍA

1.1 INTRODUCCIÓN

La cromatografía es una técnica que se emplea para separar entre si los

componentes de una sustancia.

Esta técnica fue creada por el botánico ruso Michael Tswett en 1906, el cual
llamó a su método cromatografía, palabra griega que significa escritura a color, porque
lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llevó a cabo una extracción de
una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando éter de petróleo, un disolvente no
polar, y descubrió que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a
través de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza).Tswett
utilizó como detector del experimento la simple observación, ya que los compuestos que
separó tenían color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su
color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos
que se encuentran en las hojas de las plantas.

A pesar de que el método cromatográfico prometía simplificar la separación de

sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la década de los 30 y
principio de los 40 cuando se empezó a desarrollar la técnica teniendo este método
diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografía se emplea principalmente para
separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier
técnica que se base en los mismos principios.

La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte

superior, rellena de un sólido común donde el eluyente se mueve conducido por su
propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos (fig1).

Fig. 1. Cromatógrafo de gases con espectrómetro de masas

Fig. 2. Equipos para HPLC (C. de alta resolución para líquidos)

3
1.2 BASE CIENTÍFICA

En la cromatografía se separan los componentes de las mezclas a medida que

son transportadas por un fase fluida móvil a través de una fase estacionaria sólida o
líquida, la separación de las moléculas se logra porque la movilidad de cada soluto
depende de un equilibrio en la distribución entre la fase móvil y la estacionaria, y esta
separación se puede realizar en función de sus cargas, masas, tamaños moleculares, la
polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox…

Como resultado hay una gran variedad de técnicas para llevar a cabo la
separación de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos según el
mecanismo de separación:
• C. de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad.
• C. de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción.
• C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular.
• C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica.

También se pueden clasificar según el estado de la fase móvil en :

• C. de gases: la fase móvil es un gas y pueden ser dos sistemas:
o C. gas-liquido
o C. gas-sólido
• C. líquida: la fase móvil es un liquido y puede ser:
o C. liquido-liquido
o C. liquido-sólido
o C. de exclusión
o C. de intercambio ionico

Las únicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografía son las
insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria.

Dentro de las técnicas cromatográficas no se incluyen los métodos que utilizan

campos eléctricos para separar moléculas cargadas, métodos que se denominan
electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis.

El proceso cromatográfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja

unión de fenómenos tales como hidrodinámica, cinética, termodinámica, química de
superficie y difusión. Hasta la fecha se han propuesto muchas teorías, que incluyen
complejos matemáticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las
columnas cromatográficas, por citar alguna de estas teorias las más estudiadas son:
! Teoría de los Platos Teóricos (Martin & Synge).
! Teoría Cinética (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer).
! Teoría Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

1.3 TERMINOLOGÍA EN CROMATOGRAFÍA

" Absorción: es la retención de una especie química por parte de una masa y
depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o a reaccionar
químicamente con la misma.

4
 " Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorción y de reparto.
" Adsorción: Es la retención de una especie química en los sitios activos de la
superficie de un sólido, quedando limitado el fenómeno a la superficie que separa
las fases o superficie interfacial, esta retención superficial puede ser física o
química.
" C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.
" C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.
" Disolvente o revelador: Cualquier fase móvil.
" Elución: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
" Eluyente: La fase móvil una vez que se extrae de la columna.
" Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatográfica
durante la cromatografía y que retiene algún componente de la muestra, posee una
gran área superficial y puede ser un sólido o un líquido dispuesto sobre un sólido
que actúa como soporte.
" Fase móvil: Es un fluido que puede ser líquido, gas o fluido supercrítico que se
usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a través de la columna
cromatográfica y la fase estacionaria.
" Origen: Lugar físico donde se coloca la muestra al principio.
" Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografía.
" Soporte: El material sólido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la
fase estacionaria líquida en su sitio.
" Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

Cromatograma

Además de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las

medidas continuamente para obtener una información global del proceso pasando la
muestra a través de un detector instrumental, normalmente los transductores del detector
se sitúan al final de la columna.

El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del

eluyente que pasa por él, estos cambios son reproducidos y registrados en forma de
gráfica, ésta gráfica que recoge la respuesta del detector en función del tiempo se
denomina cromatograma.

En las graficas se observa la aparición de una serie de picos a lo largo del

tiempo, generalmente la respuesta del detector es linealmente proporcional a la
concentración de analitos en la fase móvil, la forma de cada pico muestra la distribución
de concentración del componente asociado a dicho pico.

En el cromatograma el eje horizontal corresponde al volumen, o al tiempo

equivalente. En la cromatografía moderna es frecuente mantener constante la velocidad
de flujo (volumen/tiempo), así mediante esta relación se puede reflejar el tiempo en el
eje horizontal: velocidad de flujo x tiempo = volumen

5
Cromatograma obtenido de la secuenciación de un fragmento de ADN

6
2. CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN
COLUMNA

La cromatografía líquida puede llevarse a cabo por cuatro técnicas analíticas:

• C. En papel
• C. En capa fina
• C. en columna
• C. Líquida de alta resolución – HPLC –

2.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Es una forma combinada de cromatografías de partición y adsorción en la que la

fase estacionaria es el agua absorbida presente en el papel, y el soporte es el papel
mismo. La fase móvil es una solución que consiste de un solvente o de una mezcla de
varios líquidos, incluyendo el agua. Se deja secar sobre el papel unas gotas del extracto
de la muestra y se forma una mancha.
Para impedir la evaporación, el papel se cuelga dentro de una cámara de tal
forma que la mancha pueda ser irrigada con la fase móvil ya sea hacia abajo por efecto
de la gravedad, hacia arriba u horizontalmente por efecto de la capilaridad. Cuando la
fase móvil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada en la que se logre la
separación cromatográfica, se saca el papel de la cámara y se desarrolla el
cromatograma rociando agente reveladores.
En el caso de sustancias coloreadas tales como los colorantes de alimentos, la
separación resulta evidente aun sin la ayuda de tales agentes. Las sustancias no polares
también pueden separarse recubriendo el papel con un compuesto no polar y usando
solventes polares como fase móvil. Es una técnica barata pero relativamente lenta, con
limitaciones en el uso de agentes reveladores, algunos de los cuales pueden atacar y
destruir el papel. Las manchas tienden a ser difusas.

2.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)

Es un procedimiento rápido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para

identificar/caracterizar o para determinar semicuantitativamente componentes
individuales.

La separación se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo

diferencial entre una fase estacionaria y otra móvil: en la TLC el eluyente (fase móvil)
se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando así los
componentes individuales de la mezcla de sustancias más o menos lejos dependiendo de
su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorción. Al contrario, que en la
cromatografía en columna, el proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la

7
placa separativa plana. El recorrido particular de cada sustancia se emplea así para su
identificación.

Las separaciones se realizan generalmente por el “procedimiento ascendiente”,

introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el solvente, que será
succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la
placa.

Aparatos y materiales. Generalidades

- Cubeta cromatográfica (con tapa hermética); la mayoría de las veces se trata

de la cubeta “Normal” (profundidad del espacio para el gas: 3mm)
- Placas de cromatografía: preparadas por uno mismo o ya fabricadas.
- Pipetas de microlitro
- Recipiente de vidrio con pulverizador
- Probeta o matraz Erlenmeyer con tapón (para preparar y mezclar la fase
móvil)
- Secador
- Plantilla para TLC o regla
- En caso necesario: lámpara UV para comprobar la fluorescencia o la
disminución de la misma.

Placas cromatográficas y sorbentes

Las placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, láminas de

aluminio o de fibra) sobre las que se dispone el sorbente formando un espesor lo más
homogéneo posible (por lo general 0,25 mm); dependiendo de la separación a realizar,
se tratará de silicagel, óxido de aluminio, poliamida, celulosa, etc o mezclas.
En tanto que en el HPLC se utilizan principalmente materiales de fase inversa,
en la cromatografía en capa fina predominan los materiales para fase normal, como por
ejemplo el silicagel.
Hay placas de TLC que tienen la denominada zona de concentración (=zona de
carga). Se trata de una zona de unos 2 cm de anchura de barro de diatomeas o de un gel
de sílice de tamaño de poro muy grande, de manera que durante el desarrollo de la placa
de TLC en esa zona prácticamente no hay separación cromatográfica. La ventaja
específica es que los componentes cargados se concentran en una estrecha banda en la
línea de partida (línea divisoria entre la zona de concentración y sorción). Así resulta
posible cargar grandes volúmenes y obtener una buena separación.

Carga de las disoluciones

Las disoluciones de la muestra y de los patrones se cargan con pipetas de

microlitro (o similares) sobre la placa de TLC, de manera que el punto medio de la
mancha esté a 1.5 cm aproximadamente del borde inferior y de los bordes de los
laterales y que haya una separación entre 1-2 cm de una mancha a otra (Fig: A).

8
 F
5
2
3
l
7 L
6
p¹ p² 1
1 2 3 4 5 6 7 4 l
S S
1,5 cm

2cm

FIG A FIG B

A. Placa de TLC antes de su desarrollo : carga S=línea de partida, P=muestra (V >V ; V es el volumen
p¹ p²
cargado. 1-7 patrones

B. Placa de TLC después de su desarrollo: cálculos. F(frente del disolvente); l recorrido del disolvente(unos
L
13 cm, l S recorrido del componente l.

CARACTERÍSTICAS DE LOS SORBENTES ELEGIDOS PARA TLC

TAMAÑO SILICAGEL OXIDO DE ALUMINIO

ANCHURA DE PORO MEDIA 6 nm 6 nm

-PARA CASOS ESPECIALES

TAMBIÉN 4, 10,15 nm 9, 15 nm

SUPERFICIE ESPECÍFICA 500 m²/g 200 m²/ g

VOLUMEN DE PORO 0,75 ml / g 0,2 ml / g

ESPECÍFICO

TAMAÑO DE GRANO 12 µm aprox. 12 µm aprox.

- PARA HPTLC 5 µm aprox.

9
 Los volúmenes recomendables dependen de la concentración de las
disoluciones. Por lo general, se cargan 1-10 microgramos de sustancia por mancha. Si la
concentración de la sustancia a analizar fuera de un orden de magnitud desconocido, la
muestra debería cargarse varias veces en volúmenes crecientes y claramente diferentes.
Los volúmenes mayores se cargan en varias veces, secando entre una y otra (con aire
frío o caliente, aire a presión o con nitrógeno), para evitar que las manchas se
extiendan.
Para realizar determinaciones cuantitativas con placas convencionales, se cargan
volúmenes aproximados de 0.5-1.0 microlitros por mancha. Los volúmenes mayores de
5.0 microlitros deben evitarse salvo en casos excepcionales, donde se cargaran en varias
veces.

Desarrollo

El eluyente, cuya composición depende de cada problema concreto, se pone en

la cubeta cromatográfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separación
hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrará con su tapa para que se sature con los
vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para que la saturación sea
mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se indicará en el protocolo en el caso que
sea necesario).
Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se
vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas cargadas
deberán estar completamente por encima del nivel de eluyente.
El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a través del
recubrimiento. El recorrido será, dependiendo de la separación, de 5 a 15 cm máximo, y
el tiempo necesario dependerá del sorbente, del espesor del mismo y de la composición
del eluyente. El recorrido óptimo es por lo general de 10 cm.

Cálculos

Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (después de

marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posición de las
manchas se determina:

-por su color propio

-por su fluorescencia
-por la disminución o amortiguación de la fluorescencia
-por reacción química: la placa una vez seca se rocía parcial o totalmente con un
determinado reactivo, de manera que aparecerán coloraciones características o una
fluorescencia particular.

La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color

y del denominado valor rf (factor de retención , llamado también factor Rf o hRf (=Rf x
100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente (lL).

10
 ls [cm]
rf = 
lL[cm]

Para conseguir la identificación, los colores propios o consecuencia del revelado

y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas
condiciones de desarrollo y tinción (si es posible en el mismo cromatograma). Como
control se realizan adicionalmente los denominados cromatrogramas mixtos (la
disolución problema y la de la sustancia de referencia se cargan en una misma mancha).

Cromatografía bidimensional en capa fina

Para mejorar una separación incompleta, se combinan dos pasos de

cromatografía monodimensional de la manera siguiente:

1º paso: cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en sentido

ascendente como se describía más arriba.

2º paso: girar 90º la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya

separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuación se desarrolla en
sentido ascendente con un segundo eluyente.

La investigación y la determinación se realizan como ya han sido descritas

anteriormente.

Aplicaciones

En la mayoría de los casos la TLC se realiza cuando se quieren hacer

evaluaciones cualitativas rápidas (screening). Las determinaciones cuantitativas son
posibles por acoplamiento del equipamiento necesario (unidades de carga, scanner); en
estos casos, es mejor recurrir a las placas de HPTLC, porque son más efectivas.

2.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Fue la forma original de cromatografía líquida realizada por primera vez en 1906
por Tswett. La fase estacionaria normalmente se encuentra dentro de una columna de
vidrio de 5 a 30 mm de diámetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque
que van desde la alúmina, gel de sílice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintéticas y
derivados polisacáridos.
Se usan todos los tipos de cromatografía líquida. Lo habitual es que la fase móvil
se deje percolar a través de la columna por gravedad. No se usa mucho en el análisis de
alimentos ya que es una técnica para la separación cromatográfica de mezclas de
sustancias. Sin embargo, hoy en día existe un sistema cromatográfico completo y

11
automático diseñado para el análisis bioquímico que se conoce como “cromatografía
líquida rápida para proteínas”. Estos instrumentos emplean un rango de fases en
columnas de plástico de 5 o 10 cm que operan bajo presión moderada.

Se revolucionó el uso de la cromatografía en columna para la purificación de

soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones, debido a
la introducción de cartuchos cortos de plástico y desechables de minicolumnas,
preempacados con una variedad de fases de separación con partículas de tamaño
relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut y Sep-Pak.
Las soluciones de prueba, de lavado o extracción pasan rápidamente a través de
los cartuchos con un poco de vacío generado a través de una bomba de agua. La
mayoría de los métodos de purificación tales como la extracción líquido-líquido, la TLC
y la cromatografía en columna de vidrio que se usan antes de la espectofotometría, la
GLC, la HPLC etc…, pueden ahora realizarse en forma más eficiente usando estos
cartuchos.

12
3. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
HPLC

3.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BÁSICOS

En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados

través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una
fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de
migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la
naturaleza de los analitos y su interacción con las fases.

Se lleva a cabo una cromatografía líquida en fase normal cuando la fase

estacionaria es relativamente polar y la fase móvil es relativamente apolar. Se realiza
una cromatografía en fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y
la fase móvil es relativamente polar.

Hay cuatro tipos básicos de cromatografía en los que la fase móvil es un líquido:
-Cromatografía de reparto, para especies poco polares pero no iónicas de
masa molecular < 104 g/mol.
-Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido, para
especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular
< 104 g/mol.
-Cromatografía de intercambio iónico, para especies iónicas de masa
molecular < 104 g/mol.
-Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en geles, para
solutos con masa molecular >104 g/mol.

La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una

parte de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase
estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porción de muestra se introduce por
la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por sí
mismos entre las dos fases según la naturaleza química de éstos con respecto a las fases
móvil y estacionaria. Adicciones posteriores del disolvente llevan a las moléculas de
soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado (tx)

13
 Columna cromatográfica:

La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción de tiempo que ha

necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta
velocidad será pequeña para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y
será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase móvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma
en una gráfica en función del tiempo, un cromatograma, que consta de una serie de
picos simétricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto
cualitativa (posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los
componentes de la muestra.
La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del
área del pico de un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros varían
linealmente con la concentración. La cromatografía cualitativa se basa en la
comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de retención) con
cromatogramas estándares.
Ejemplo de cromatograma con un detector de Absorbancia:

14
 La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos
depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia
máxima para la cromatografía líquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede
incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamaño de la partícula del
empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la
temperatura.

En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en

columnas de vidrio con diámetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas
partículas de la fase estacionaria no superaban las150-200 µm de diámetro a fin de
asegurar unos caudales razonables. Incluso así, los tiempos de separación eran largos,
podían llevar varias horas.

La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid

Chromatografy) es el método más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida,
que utiliza partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con diámetros
muy pequeños para aumentar la eficiencia, entorno a 3-10 µm. Así, se ha conseguido
reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de diámetro en la
HPLC, y el tiempo necesario para la separación, de minutos a 1h.

Fotografía de los intrumentos básicos de laboratorio para la HPLC:

15
3.2 INSTRUMENTACIÓN

Para la cromatografía líquida se necesitan varios aparatos. Este es un esquema

del conjunto de aparatos necesarios:

Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un diámetro

interno de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del diámetro de
las micropartículas que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 3-
10µm. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen
escapar las micropartículas de la columna. En muchos casos se utiliza una precolumna
para eliminar contaminantes y partículas de polvo.
Distintos tamaños de columnas:

La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos están equipados con

calentadores de columna, que controlan la temperatura desde la cercana al ambiente
hasta 150 ºC. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores
cromatogramas.

Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas según las
distintas separaciones. Básicamente, las micropartículas utilizadas están compuestas de
sílice, aluminio o resina. Pueden ser de dos tipos:

16
 -Partículas enteramente porosas, de forma irregular y diámetro 3-10µm.
-Partículas esféricas de superficie porosa, con diámetros de 30-60µm y
un núcleo imposible de atravesar.

Son necesarias bombas de presión de varios centenares de atmósferas para

conseguir velocidades de flujo razonables con micropartículas de 3-10µm debido a la
resistencia que ofrecen. Como consecuencia, el equipo de HPLC es más costoso y
elaborado que el de otros tipos de cromatografía. Las elevadas presiones que generan las
bombas no constituyen un peligro de explosión, puesto que los líquidos no son muy
compresibles.

Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno

más de 500 ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompañados de
desgasificadores para eliminar los gases del disolvente, pues producen burbujas en la
columna interfiriendo en los resultados.

Para una buena elección de la fase móvil o disolvente, hay que tener en cuenta
que la interacción con la fase estacionaria (micropartículas) debe ser óptima y la
separación debe ser lo más rápida posible. Los parámetros que determinan el tipo de
disolvente a utilizar son: viscosidad, transparencia al UV, punto de ebullición, índice de
refracción, inercia frente a la muestra, resistencia a la corrosión, toxicidad, precio y
mantenimiento.

El sistema de inyección de muestra que más se emplea se basa en "asas de

muestreo", que son bucles o válvulas dosificadoras que permiten una aplicación
cuantitativa y reproducible a presión elevada. Proporcionan una selección del tamaño de
la muestra que va desde 5 a 500µl. La muestra se pasa primero al bucle sin presión, para
luego pasar a la columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vías
o válvulas de membrana.

La muestra no debe contener sólidos para que no se atasque la columna, si es

necesario deberá filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver
la muestra en el eluyente que se vaya a emplear en la separación. El volumen inyectado
de muestra debe ser lo más pequeño posible, para que los resultados aparezcan más
nítidos.

Para HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la

muestra.
-Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en
disolución. Son los detectores ultravioleta/visible (UV/Vis), detector de fluorescencia y
detector electroquímico.
El más utilizado es el UV/Vis, sobre todo el espectrofotómetro, que
registra sustancias que absorben la radiación ultravioleta o visible. Los hay muy
sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se
pueden utilizar en la elución en gradiente.

-Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase

móvil es cambiada por la presencia de un soluto. Son el detector del índice de refracción
(RI) y el detector de conductividad.

17
 El más utilizado es el detector RI, que registran todas aquellas sustancias
que presenten un RI distinto al de la fase móvil pura. La señal será tanto mayor cuanto
mayor sea la diferencia en el RI. Es necesario un control estricto de la temperatura y no
se pueden utilizar para separaciones por elución en gradiente.

3.3 APLICACIONES AL ANÁLISIS DE LOS ALIMENTOS

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o

grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente.
Como condición, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la
fase móvil un líquido.
Es la técnica analítica de separacón más ampliamente utilizada debido a sus
cualidades de sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su
gran adaptabilidad a sustancias que son de gran interés para la industria, la ciencia y la
sociedad.
El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho.
Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminoácidos, proteínas,
ácidos nucléicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos, plagucidas,
antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran variedad de sustancias
inorgánicas.

Ejemplos de utilización de HPLC:

-Detección y cuantificación de sacarina, benzoatos, cafeína y aspartame
en refrescos.
-Detección de ciclomato en jugos de fruta.
-Separación de ésteres de ácidos grasos por fase inversa y con
argentización de columnas (Silicato de Al con Ag).
-Separación de Triglicéridos por la longitud de la cadena y el grado de
insaturación por fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el estudio de
aceites y grasas adulteradas.
-Determinación del contenido de Vit A y sus precursores (α y β caroteno)
en margarina y aceites de hígado por fase inversa.
-Determinación del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por
fase normal.

18
4. CROMATOGRAFÍA DE GASES. GC

4.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BÁSICOS

La cromatografía en fase gaseosa es un procedimiento para la separación de

compuestos volátiles, que fluyen en una corriente gaseosa a través de una fase
estacionaria fijada a un tubo largo y fino. El gas portador (inerte, por ej., nitrógeno,
helio, hidrógeno y argón) transporta una muestra representativa de la sustancia
inyectada.
En una separación se parte de la base, de que cada componente será disuelto o
adsorbido por la fase estacionaria. Los distintos componentes serán retenidos por esta
fase con mayor o menor fuerza y alcanzarán correspondientemente el final de la
columna, donde se encuentra el detector, después de un tiempo de flujo de gas portador
más o menos largo.

La cromatografía de gases permite obtener resultados tanto cualitativos como

cuantitativos. Se utilizan fundamentalmente estas alternativas de separación:

1. A mayor disolución, la separación de compuestos con estructura química

similar se consigue utilizando tiempos relativamente largos.

2. A menor disolución se realiza la separación rápida de mezclas de

compuestos sencillos
conocidos.

4.2 INSTRUMENTACIÓN

Actualmente más de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen unos 130 modelos

distintos de equipos para cromatografía de gases. En las últimas décadas, los
instrumentos que han aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras.
En los años setenta, se hicieron habituales los integradores electrónicos y los
equipos de procesado de datos basados en un ordenador. Los años ochenta introdujeron
la utilización de los ordenadores para el control automático de la mayoría de los
parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, caudales y la
inyección de la muestra, el desarrollo de instrumentos de muy alto rendimiento a un
coste moderado, y tal vez lo más importante, el desarrollo de las columnas abiertas que
son capaces de separar multitud de analitos en un tiempo relativamente corto.

Componentes básicos

# GAS PORTADOR-
El gas portador cumple básicamente dos propósitos: transportar los componentes
de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir
ciertas condiciones:

19
 1. Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la
fase estacionaria).
2. Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa.
3. Fácilmente disponible y puro.
4. Económico y adecuado al detector a utilizar.

# COLUMNAS DE SEPARACIÓN Y FASES ESTACIONARIAS

Si la fase estacionaria es una sustancia sólida, esta modalidad de la GC se

denomina gas-solid-chromatography.
Si la fase estacionaria es un líquido no volátil (viscoso) aplicado formando una
película dentro de una fina columna, se denomina gas-liquid-chromatography. Dado el
elevado número de fases líquidas que existen para temperaturas superiores a 400ºC, la
GLC es la más versátil y seleccionada de las GC. Permite la investigación de
compuestos gaseosos (es decir, de peso molecular relativamente bajo). La cromatografía
de gas-líquido se abrevia normalmente como cromatografía de gases debido a su gran
aplicación en todos los campos de la ciencia.

La GC se divide en: a) GC con columnas empaquetadas y b) GC con columnas

capilares.

a) El primer caso se trata de columnas convencionales con un diámetro

interno(ID) superior a 1mm y longitudes de 2-3m (de vidrio, metal), rellenas
de granulados sólidos en los que están embebidas las distintas fases.

b) Las columnas capilares son capilares largos de vidrio o sílice (ID:0.2-0.3mm,

longitud: como norma 50m), existen diferentes tipos de capilares.

Debido a la alta resolución que se consigue al trabajar con columnas capilares, la

GC capilar se suele denominar también cromatografía gaseosa de alta resolución
(HRGC).

# SISTEMA DE INYECCIÓN MUESTRA-

La muestra debe introducirse rápidamente en la columna. Normalmente, los

líquidos se introducen en la columna por medio de jeringuillas de inyección (jeringuillas
de microlitro con un volumen total de 0.5 a 10µl) a través de una membrana de goma
(septo) del inyector termostatizado y los componentes se vaporizan; la cantidad
inyectada se lee directamente en la escala de la jeringuilla graduada.
La cantidad de la muestra a utilizar depende del tipo de columna, de la cantidad
de fase estacionaria contenida en la columna o del espesor de la película en el caso de
los capilares de película fina, de la solubilidad de los componentes importantes en la
fase estacionaria (es decir, de la polaridad de soluto y disolvente) y de la temperatura.
Controlando los cambios de temperatura de la columna (horno) durante el
análisis se puede, alcanzar el intervalo de temperatura óptimo para cada componente o
fracción individual, de manera que para cada componente de la mezcla se obtengan
picos claros, en el caso ideal completamente separados.

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 # DETECTORES

El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible

directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y la
magnitud de la propiedad física.
En cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre el
gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que
previamente se han separado en la columna, esta acción se traduce en una señal tipo
eléctrica, que posteriormente se amplificará mediante un registrador gráfico o integrador
permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes.
Un detector muy utilizado en la analítica general de los alimentos es el detector
de ionización de llama (FID). En él se mide, registra y amplifica el flujo iónico
resultante de la ionización de las moléculas en una llama de hidrógeno (gases de
combustión necesarios: hidrógeno y aire comprimido). El FID es un detector de los
denominados universales o inespecíficos, especialmente adecuados para medidas
cuantitativas. Es un detector dependiente del flujo de masa, es decir, la señal es tanto
mayor, cuánta más sustancia se ioniza en la llama en la unidad de tiempo.
En el análisis de las cantidades traza se utilizan por lo general detectores que
presentan una elevada sensibilidad para determinadas sustancias, son los denominados
detectores específicos. Tiene especial importancia en el análisis de residuos y de
contaminantes, el detector de captura electrónica (ECD).
El ECD posee la característica de detectar aquellas sustancias que poseen una
elevada afinidad electrónica (por ej., los halógenos, aunque también otros grupos
funcionales de la mólecula con afinidad por los electrones). Al contrario que el FID, el
ECD mide una reducción de la señal en lugar de una amplificación.

4.3 APLICACIONES AL ANÁLISIS DE ALIMENTOS

♦ Separación e identificación de azúcares de forma cualitativa y cuantitativa después

de una conversión a derivados volátiles termoestables.
♦ Determinación rápida y precisa de la composicón los Ácidos grasos en los aceites y
las grasas tras efectuar la conversión de los ésteres de triglicéridos en ésteres
metílicos, que son más volátiles. Así se conoce con más detalle la composición
isomérica, geométrica y posicional de los triglicéridos en la Ácidos grasos.
♦ Identificación y determinación de ésteres metílicos de Ácidos grasos poliinsaturados
individuales.
♦ Determinación del contenido de isómeros trans en aceites, grasas y alimentos
grasos.
♦ Separación entre α y β tocoferol (UPLE).
♦ Separación y determinación de alcoholes de azúcar de sus derivados del trimetilsilil
éter (TMS).
♦ Determinación del sorbitol, el manitol y el xilitol en las frutas en capilares de vidrio.

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BIBLIOGRAFÍA

LIBROS

Principios de Análisis Instrumental. 5ª ed (2001). Douglas A. Skoog, F.J. Holler,

T.A. Nieman. Mc Graw-Hill Interamericana.
Análisis Instrumental. (2001). K.A. Rubinson, J.F. Rubinson. Prentice Hall.
Análisis de los Alimentos. (1992). Matissek, Schnepel, Steiner. Ed. Acribia, S.A.
Composición y Análisis de los Alimentos de Pearson. 2ª ed (1996). R.S. Kirk, R.
Sawyer, H. Egan.
Química Analítica. 6ª ed. (1997). Skoog, West, Holler. Mc Graw-Hill.

PÁGINAS WEB

www.dq.fct.unl.pt/qof/hplcts.html
www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografía/hplc.html
www.merck.com.pe/MPSA%5csite%5cwmsp.nsg/contents/cromatografía
www.hplc.co.uk/homeframe.htm
www.shu.ac.uk/virtual_campus/courses/241/hplc.htm
www.dicdoc.ucv.cl/lab_sibyl
www.lafaw.com
www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm
www.richardscientific.com
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/
http://biología.med.ub.es:8080/curso/curso.html
http://latina.chem.cinvestad.mx/RLQ/tutoriales/cromatografía/Gas.htm

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Índice……………………………………………………………… 22

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