UNIVERSITATEA DIN BUCURETI FACULTATEA DE FIZIC

CONTRIBUII N DOMENIUL FILMELOR NANOSTRUCTURATE OBINUTE PRIN TEHNOLOGII LASER PULSATE PENTRU BIOSENZORI I ADMINISTRAREA CONTROLAT DE MEDICAMENTE
Rezumat

Tez susinut de:

Elena Camelia COJANU (POPESCU)

Pentru a obine titlul de:

Doctor n Fizic

Coordonator tiinific:

Prof. Dr. Ion N. MIHAILESCU

2011 1

INVITAIE
................................................................................................................................................................ Suntei invitat() n data de 29 noiembrie 2011, ora 11, n Amfiteatrul A1 al Facultii de Fizic, s participai la susinerea public a tezei de doctorat cu titlul: CONTRIBUII N DOMENIUL FILMELOR NANOSTRUCTURATE OBINUTE PRIN TEHNOLOGII LASER PULSATE PENTRU BIOSENZORI I ADMINISTRAREA CONTROLAT DE MEDICAMENTE

Elena Camelia COJANU (POPESCU)

Comisia este format din: Preedinte: Prof. Univ. Dr. tefan ANTOHE Director coala Doctoral de Fizic Conducator stiintific: Prof. Dr. Ion N. MIHAILESCU INCDFLPR Facultatea de Fizic, Universitatea din Bucureti, Membri: Prof. Univ. Dr. Aurel POPESCU Facultatea de Fizic, Universitatea din Bucureti, Dr. Eniko GYORGY, CS I Prof. Dr. Michail KOMPITSAS INCDFLPR Theoretical and Physical

Chemistry Institute The National Hellenic Research Foundation, Greece

CUPRINS

I. II.

INTRODUCERE

ASPECTE FUNDAMENTALE PRIVIND TEHNICA DE FABRICARE A FILMELOR 7 10 24 41 43 48

DIN COMPUI ORGANICI III. IV. V. BIOSENZORI, DE LA CONCEPT LA FABRICARE SISTEME DE ADMINISTRARE CONTROLAT DE MEDICAMENTE CONCLUZII REFERINE LIST LUCRRILOR AUTOAREI

Capitolul I. INTRODUCERE____________________________________________
Cercetrile din fizic i chimie se concentreaz, n prezent, din ce n ce mai mult, asupra materialelor nanostructurate cu proprieti funcionale unice. Aceste nanomateriale, sub form de nanoparticule sau straturi subiri, sunt folosite de inginerii biomedicali, biologii i medicii cercettori pentru dezvoltarea de noi biosenzori i pentru administrarea dirijat de medicamente1. Interesul major din jurul acestor domenii este atestat de numrul de publicaii i de produsele scoase pe pia, care cresc semnificativ, de la an la an. Fizica, una dintre cele mai importante tiine ale naturii, poate facilita nelegerea anumitor fenomene ntlnite n domenii ca biologia i biochimia. n plus, poate furniza noi metode de analiz sau de sintez a produilor, care pot aduce progresul n aceste domenii. n aceast lucrare de doctorat, au fost procesate i studiate, prin metode fizice, materiale de interes pentru biochimie, biologie i medicin. n ultimii ani, s-a acordat o atenie deosebit biosenzorilor bazai pe metode electrochimice24

, optice5-7, piezoeletrice8-10 i termometrice11,

12

datorit unor factori precum: prepararea simpl,

costuri sczute de fabricare, rspuns rapid, dimensiuni mici i suprafa sensibil mare. n prezent, se fac cercetri pentru dezvoltarea de senzori care folosesc componente biologice pentru a detecta specii de interes13. Un sistem biologic (enzim, anticorp, acid nucleic, microorganism, esut), combinat cu un traductor fizico-chimic (optic, electrochimic, termic, piezoelectric) formeaz un biosenzor. n tara noastr, se deruleaz cercetri pentru dezvoltarea de biosenzori ce detecteaz substane neurotoxice din alimente14 sau biosenzori cu rol n monitorizarea pesticidelor organoclorurate n instalaiile de epurare biologic a apelor uzate15. L.G Zamfir et al.16, de la Universitatea din Bucureti, au obinut, prin sintez chimic, substane utilizabile ca biosenzori cu aplicaii n controlul calitii produselor alimentare, farmaceutice i biochimie analitic. Utilizarea radiaiilor laser pentru procesarea compuilor organici ofer multiple avantaje, n comparaie cu metodele convenionale. Dintre acestea, cele mai importante sunt riscul foarte sczut de contaminare a materialelor procesate cu ajutorul radiatiilor laser i natura precis, orientat a procesului. n cazul transferului de compui organici, dintr-o int iradiat cu laserul, spre un colector alturat, se asigur stoechiometria materialului depus constnd din molecule complexe cu multicomponente. n plus, cantitatea de material evaporat i imobilizat/depus pe suprafaa colectorului este perfect controlabil de numarul i/sau intensitatea pulsurilor laser folosite pentru iradiere. Aceasta metod de sintez ofer posibilitatea de a utiliza colectori formai din orice tip de material, de la polimeri, la materiale ceramice, semiconductori, metale, circuite electronice i suprafee biologice. Tehnicile de imobilizare a biomoleculelor, care folosesc radiaia laser, asigur n 4

principiu, o mai bun reproductibilitate, n comparaie cu metodele tradiionale. Procesarea rapid i costurile de producie sczute se regsesc printre avantajele scontate n favoarea potenialilor utilizatori. Referitor la sinteza prin tehnici laser de filme subiri de substane biologice cu capacitate de detecie, Laboratorul Interaciuni Laser-Suprafa-Plasm (LSPI), din cadrul Institutului National pentru Fizica Laserilor, Plasmei i Radiaiei a raportat, n jurnale cotate ISI, obinerea de filme cu grosimi nanometrice de creatinin17, ureaz18, papain19, fibroin20 prin metoda evaporrii laser pulsat asistat de o matrice (English: Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation: MAPLE). n capitolul II al tezei, sunt descrise metodele convenionale de depunere laser pulsat, folosite pentru procesarea diferitelor tipuri de materiale. Am artat c aceste metode, dei cu aplicaii numeroase n diferite domenii, pot provoca distrugerea legturilor organice i degradarea compoziional a filmului depus. De aceea, am prezentat o nou tehnic de depunere laser, introdus n Romnia, n anul 2004. Aceast tehnic, numit MAPLE, permite transferul protejat al substanelor organice i polimerice, de la int la substrat21. Dei fiecare metod de procesare a polimerilor i biomaterialelor are beneficii i limitri, MAPLE pare s se impun n literatura de specialitate pentru dezvoltarea generaiei urmtoare de biosenzori i biocipuri microfluidice sub form de filme subiri. n aceasta tez, am studiat sinteza filmelor subtiri cu proprieti de biosenzor cu ribonucleaz A pancreatic (ARN-aza A) de bovine, enzim cunoscut pentru efectele sale citotoxice i citostatice aspura celulelor canceroase22-24. n capitolul III, am descris rolul pe care aceast enzim l are n degradarea ARN-ului din soluii de ADN i importana imobilizrii ARN-azei A pe suporturi solide, asigurnd controlul reaciei enzimatice i o stabilitate, mult mai bun, comparativ cu enzima liber25,26. Rezultatele, obinute dup imobilizarea acestei enzime, au artat c exist un domeniu redus de parametri experimentali care permit sinteza de straturi de biomaterial uniforme, ce asigur meninerea activitii enzimatice. Tot n acest capitol, am descris perspectiva utilizrii tehnicii MAPLE pentru acoperirea electrozilor serigrafiai cu filme nanostructurate din materiale hibride (3 tipuri de metaloporfirine) pentru detecia dopaminei, un neurotransmitor produs de hipotalamus. Rezultatele obinute cu ajutorul voltametriei ciclice atest faptul c electrozii serigrafiai, acoperii n condiii selectate, cu film subire de metaloporfirine pot fi utilizai ca mediatori pentru detecia dopaminei. O alt aplicaie a metodei MAPLE, pe care am studiat-o in extenso, este sinteza filmelor subiri de polimeri biodegradabili pentru administrarea controlat de medicamente. n medicin, se folosesc n prezent, microparticule cu substana activ nglobat ntr-o matrice polimeric, pentru administrarea dirijat de medicamente. Principalul inconvenient al acestor structuri este legat de transportul n sistemul circulator, deoarece exist vase capilare cu diametre ale 5

seciunilor mai mici dect diametrul microparticulelor. Studiile au evoluat de aceea ctre vectori cu dimensiuni nanometrice. Circulaia unor astfel de particule ar fi, n acest caz, liber n sistemul sangvin. Transportul vectorilor ctre zona afectat din organism se poate face prin interacii magnetice, nclzire localizat sau asociere cu un agent de recunoatere pentru esuturile afectate. n funcie de modul de stocare al substanei active, n prezent, se cerceteaz dou mari tipuri de vectori: nanoparticule, care conin substana activ n interiorul unei carcase polimerice biodegradabile i nanosfere, reprezentate de particule care conin adsorbit pe suprafata lor medicamentul. n domeniul administrarii dirijate intravasculare de medicamente, nanoparticulele polimerice biodegradabile au fost studiate n numeroase aplicaii27-30. ncapsularea ageniilor terapeutici, n interiorul nanoparticulelor polimerice, ofer o protecie enzimatic i o posibil eliberare continu, ntr-o perioad de timp prelungit31,32. Nanoparticulele pot servi ca ageni de contrast pentru imagistica sngelui i a esuturilor32. Aplicaiile nanoparticulelor, folosite ca purttori de substan activ, sunt limitate de timpul scurt de circulaie in vivo. Rezultatele obinute de mine, cu aplicaii n acest domeniu, sunt prezentate n capitolul IV. Am abordat, n acest sens, patru tipuri diferite de materiale: - alcoolul polivinilic ce conine grupri carboxil legate de un nucleu aromatic; - triacetat pululan; Aceti polimeri au fost obinui la Institutul de Chimie Macromolecular Petru Poni din Iai. Pentru aceti biopolimeri, am demonstrat mbuntirea profilului de cedare, in vitro i in vivo, a substanelor active: ibuprofen i diclofenac sodium (DFS) pentru reducerea inflamaiilor; - poli(1,3-bis-(p-carboxilfenoxil propan)-co-anhidrida sebacic)) 20:80 asociat cu medicamentul gentamicin, a permis obinerea unor filme hibride nanostructurate cu proprieti antibacteriene mpotriva Escherichia coli i Staphyloccocus aureus. Att polimerul, ct i medicamentul, au fost trimise de la North Carolina State University, Raleigh, SUA; - nanoparticule magnetice funcionalizate cu antibiotice (Fe3O4/acid oleic/ceftriaxone i Fe3O4/acid oleic/cefepime) care formeaz filme cu activitatea antimicrobian. Aceti compui au fost obinui la Universitatea Politehnica Bucureti, Facultatea de Chimie Aplicat i tiina Materialelor. Materialele menionate au fost selectate, n urma testelor de biocompatibilitate efectuate la Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutic Bucureti i North Carolina State University, Raleigh, SUA. Am demonstrat funcionalitatea acestor materiale sub form de filme subiri prin teste in vitro. Teza se ncheie cu un capitol de concluzii n care sunt prezentate cele mai semnificative rezultate din lucrare. Sunt subliniate avantajele metodelor laser de sintez a nanostructurilor dorite i proprietile unice ale structurilor sintetizate. 6

Capitolul

II.

ASPECTE

FUNDAMENTALE

PRIVIND

TEHNICA

DE

FABRICARE A FILMELOR DIN COMPUI ORGANICI___________________

n ultimii ani, se observ o tendin general de a diminua delimitarea dintre biotehnologie, farmacologie i medicin. Astfel au aparut tehnici inovatoare, bazate pe nanotiinte i nanotehnologii, de procesare a biomaterialelor funcionale ca mono- i/sau multistraturi. Acestea necesit implementarea de instalaii i procese de producie care se pot adapta, ct mai bine, schimbrilor din, cercetarea tiintific, pe termen lung, dezvoltrii de noi tehnologii33,34. Una din tendinele actuale n aceste direcii de cercetare este funcionalizarea compuilor organici prin metode chimice, biologice, mecanice sau fizice, pentru obinerea de structuri i filme subiri nanostructurate. Aceste filme trebuie s reproduc, cu minim fragmentare, rearanjare sau degradare, proprietile biomaterialului iniial35-37. Procesarea materialelor cu ajutorul laserului este intens studiat, laserii pulsai fiind folosii ntr-o serie de aplicaii, de la micro- i nano- structurare a suprafeei35, 38, la depunerea laser pulsat (PLD) de filme subiri i acoperiri ale diverselor suprafee39, operaie cu laserul40,41 i restaurare a obiectelor de art42. La scurt timp dup apariia laserilor, au fost efectuate primele experimente PLD pentru creterea filmelor subiri43, 44. Dintre aplicaiile tehnicii PLD amintim: filme subiri din diferii oxizi pentru senzori de gaz45, 46, filme subiri metalice pentru supraconductori47,48, filme subiri de magneziu pentru fotocatozi49, filme active i pasive pentru componente optice50, acoperiri protectoare i bariere de difuzie51, acoperiri biocompatibile pentru implanturi medicale52-54 i acoperiri ceramice pentru aplicaii n electronic55. PLD este un proces de depunere fizic, n faz de vapori sau atmosfer de gaz controlat56. O descriere foarte simpl a unui experiment PLD ar putea fi urmtoarea: pulsul laser direcionat prin camera de reacie, spre suprafaa intei, va disloca o cantitate de material formnd o plasm laser. Explozia de material ce are loc, n timpul iradierii cu pulsuri laser de intensitate ridicat, este denumit ablaie laser. Materialul ablat se extinde ntr-un flux perpendicular pe suprafaa intei i este depus pe un colector. Acumularea de material pe suprafaa colectorului, datorat numrului de pulsuri laser, duce la obinerea de filme cu grosimi controlate, de la civa nanometri, pn la civa microni. La civa ani dup efectuarea primelor experimente PLD, s-a ncercat depunerea de filme subiri polimerice57-61. Aceast tehnic poate fi utlizat doar n anumite cazuri: atunci cnd materialele polimerice pot fi evaporate sub aciunea radiaiei laser (i) ca uniti polimerice, dac au mas molecular mic, sau (ii) ca uniti monomerice, n cazul polimerilor cu mas molecular mare, care se re-polimerizeaz pe colectorul nclzit la temperatura adecvat. Cei mai multi polimeri 7

ns, atunci cnd sunt nclzii la temperatura de evaporare, disociaz i fragmentele gazoase condenseaz pe colector, fr a crea o reea polimeric. Pentru a putea depi aceste limitri i obine structuri i filme subiri, de nalt calitate, din compui organici prin transfer laser nedistructiv, a aprut la sfaritul anilor 90, o nou tehnic de depunere laser, numit evaporare laser pulsat asistat de o matrice (MAPLE)62,63. Diferenele dintre PLD i MAPLE (figura II.1) constau, n esen, n metoda de preparare a intei i n mecanismul de interaciune laser-material.

Figura II.1 Reprezentarea schematic a proceselor PLD i MAPLE care evideniaz diferenele ce stau la baza lor Experimentul MAPLE poate fi descris astfel: compusul organic este dizolvat ntr-un solvent, soluia obinut fiind ngheat i apoi iradiat, evitnd n felul acesta, expunerea direct a moleculelor organice la radiaia laser. Cantitatea de material evaporat i depus pe suprafaa colectorului, aezat paralel cu inta, la o distana optimizat, poate fi controlat prin numrul i/sau intensitatea pulsurilor laser folosite pentru iradiere. Aceast metod de sintez ofer, de asemenea, posibilitatea de a utiliza, drept colector, orice tip de material, de la polimeri la materiale ceramice, semiconductoare, metale, circuite electronice i suprafee biologice. n consecin, tehnicile de procesare a compuilor organici, care folosesc radiaia laser asigur, n principiu, o mai bun reproductibilitate, n comparatie cu metodele tradiionale. Procesarea rapid i costurile de producie sczute se regsesc prin avantajele scontate, n favoarea potenialilor utilizatori64. Experimentele MAPLE, pe care le-am realizat n cadrul acestei teze, au fost efectuate n laboratorul LSPI. Dispozitivul experimental utilizat este prezentat n figura II.2. Descrierea unui experiment MAPLE este urmtoarea: un puls laser UV (KrF*, = 248 nm, FWHM 25 ns) trece printr-o lentil (MgF2, f = 30 cm) ntr-o camer de reacie vidat i este focalizat pe suprafaa intei 8

criogenice, la un unghi de inciden de 45. Camera de reacie este realizat din oel inoxidabil, avnd pe lng deschiderile spre instalaia de vid, spre sursa laser i spre aparatele de msur, ferestre de transmisie n UV (cuar) i ferestre de acces pentru tijele de fixare ale intei. Pentru iradierea uniform a intei, este necesar focalizarea radiaiei laser n diferite puncte de pe suprafaa acesteia. De aceea, fereastra de acces a fasciculului laser, n camera de reacie, a fost aleas astfel nct s permit concentrarea radiaiei, pe o arie larg a suprafeei intei criogenice, care este rotit n timpul depunerii. Meninerea n camera de reacie a unui mediu curat, fr urme de praf i ulei, este esenial pentru obinerea unui film de bun calitate. Aceasta se asigur cu ajutorul unei pompe rotative (ALCATEL tip SD2033). Pentru a menine o presiune dinamic constant, n interiorul camerei de depunere, se folosete un debitmetru calibrat (MKS P4000).

Figura II.2 Dispozitiv experimental MAPLE folosit n experimentele prezentate n aceast tez Pentru a testa performanele instalaiei MAPLE, am efectuat depuneri din compui organici de tipul medicament-polimer (polietilenglicol-metronidazol PEG 1.5) *65, preparai la Institutul de Chimie Macromolecular Petru Poni din Iai, de ctre Dr. Tinca Buruian. Aceste studii au demonstrat c materialul hibrid PEG-metronidazol a fost transferat fr a fi degradat chimic. Transferul adecvat de material i obinerea de filme de nalt calitate depind de parametrii de depunere, caracteristici procesului MAPLE.
*

R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, D. Mihaiescu, S.D. Gittard, R.J. Narayan, T. Buruiana, I.

Stamatin and D.B. Chrisey, Functional Polyethylene Glycol Derivatives Nanostructured Thin Films Synthesized by Matrix Assisted Pulsed Laser Evaporation Appl. Surf. Sci. 255(24), 9873 (2009)

Capitolul III. BIOSENZORI, DE LA CONCEPT LA FABRICARE___________

Integrarea nanomaterialelor n dispozitive electronice miniaturizate ofer avantaje inedite pentru detecia speciilor biologice. De asemenea, mbinarea nanomaterialelor cu sistemele biologice impulsioneaz cercetri intense n domeniul biosenzorilor. Cercetarile i dezvoltarile din acest domeniu sunt vaste i multidisciplinare cuprinznd chimia, electrochimia, biochimia, tiina bioreactoarelor, fizica, electronica i ingineria de programare (software). Biosenzorii, au fost definii pentru prima oar n anul 1977 de Cammann, ca fiind senzorii chimici n care sistemul de recunoatere utilizeaz un mecanism biochimic66,
67

. Termenul de

biosenzor este adesea utilizat pentru defini dispozitivele utilizate n scopul determinrii concentraiilor unor substane sau a altor parametri de interes biologic, chiar dac acestea nu utilizeaz un sistem biologic, n mod direct. Aceasta definiie este utilizat n mod uzual de unele reviste tiinifice (de exemplu Biosensors and Bioelectronics, Sensors and Actuators). Biosenzorul asigur una sau mai multe din urmtoarele cerine (Figura III.1): - detecia, conversia, prelucrarea i transmiterea informaiei privind o modificare fiziologic; - monitorizarea prezenei diferitelor elemente chimice ntr-o substan dat, utiliznd materiale biologice; - combin o interfa electric cu un captor biologic sensibil i selectiv.

Figura III.1 Reprezentarea schematic a unui biosenzor n funcie de elementul de recunoatere i tipul de substan monitorizat, biosenzorii studiai n cadrul acestei teze fac parte din dou clase: 1. Biosenzori enzimatici Acest tip de biosenzori folosete ca biocatalizatori, enzimele. Acestea reacioneaz cu analitul sau cu substratul, producnd un semnal ce este detectat prin procesul de biorecunoatere68. 10

Enzimele (din limba greac - zymosis ferment) sunt catalizatori de natur proteic care faciliteaz transformarea chimic a diferitelor substane. Substana asupra creia acioneaz enzima poart numele de substrat (Figura III.2).. Compuii chimici care rezult n urma aciunii enzimei poart numele de produi de reacie69.

Figura III.2 Formarea complexului enzim - substrat Datorit amplificrii lor nalte i a selectivitii, biosenzorii enzimatici reprezint prima alegere pentru dezvoltarea de noi detectori pentru investigaii medicale70. Enzimele sunt de 108-1012 ori mai sensibile dect catalizatorii ne-biologici, cu o capacitate de biodetecie de civa ppm71. 2. Biosenzori electrochimici Aceast clas este reprezentat de dispozitive integrate, autonome, capabile s furnizeze informaii analitice cantitative specifice folosind ca element de recunoatere molecular un receptor biochimic (element de identificare biologic), care se afl n contact direct cu un traductor electrochimic ce furnizeaz un semnal msurabil72. Tehnologia care st la baza acestor biosenzori nu este extrem de complicat, combinnd recunoaterea biochimic selectiv, cu nalta sensibilitate a deteciei electrochimice. Datorit progresului pe care l nregistreaz tehnicile curente, aceti biosenzori pot fi miniaturizai, facilitnd astfel transportul lor, msurtorile rapide i utilizarea unor cantiti mici de substane. Numeroase aplicaii comerciale confirm avantajele pe care le au aceti biosenzori73.

REZULTATE ORIGINALE 1. Biosenzori enzimatici74 Materiale folosite pentru imobilizare Pentru aceste studii am ales ribonucleaza A pancreatic de bovine (ARN-aza A; engl. RNase A) (E.C. 3.1.27.5), o molecul cu mas molecular de 13,7 0,3 kDa care catalizeaz hidroliza acidului ribonucleic. Strcutura 3D a ARN-azei A este prezentat n capitolul III al tezei, n figura III.7 de la pagina 46.

C. Popescu, J. Roqueta, A. Prez del Pino, M. Moussaoui and M. V. Nogus, E. Gyrgy, Processing and immobilization of enzyme Ribonuclease A through laser irradiation, J. Mater. Res. 26, (6), 815 (2011)

11

Obiectivul principal al investigaiilor a fost determinarea condiiilor experimentale optime care s asigure, att controlul morfologiei structurilor sintetizate, ct i meninerea structurii i compoziiei chimice a enzimei imobilizate cu ajutorul laserului. Pentru a demonstra funcionalitatea straturilor depuse, am efectuat teste ale proprietilor de activitate enzimatic ale structurilor biomoleculare imobilizate, cu ajutorul radiaiei laser74. Un rol important al ARN-azei A este ndeprtarea ARN din soluii de ADN sau din alte soluii de protein75-77. Una dintre dificultile majore ale acestor proceduri clasice o constituie necesitatea de a ndeprta ARN-aza A din soluii, dupa degradarea ARN-ului. O alternativ pentru aceast dificultate ar fi imobilizarea ARN-azei A pe suporturi solide. Aceast abordare ofer avantaje suplimentare, precum refolosirea, controlul reaciei enzimatice sau o stabilitate mult mai bun, comparativ cu enzima liber25,26. Imobilizarea ARN-azei A cu ajutorul radiaiei laser Experimentele de imobilizare ale acestei enzime, cu ajutorul laserului, au fost efectuate n cadrul a dou stagii de lucru, pe care le-am realizat la Centrul de Investigaii n Nanotiin i Nanotehnologie, din Barcelona Spania. Aceste experimente au fost realizate cu acelai tip de surs laser UV excimer KrF* ( = 248 nm, FWHM 25 ns, = 10 Hz), model COMPexPro 2005 Lambda Physik, folosit i n Laboratorul LSPI. Pentru creterea nano-structurilor i straturilor de ARN-az A, am folosit colectori de sticl i cuar, SiO2 (100), de dimensiuni (1,3 1,3) cm2, care au fost supui unui protocol riguros de curare. intele compozite, folosite pentru experimentele de depunere laser pulsat asistat de o matrice, au fost preparate prin dizolvarea enzimei ARN-az A n ap distilat sau soluie tampon Hepes (4-(2-hidroxietil)-1-acid piperazinetansulfonic) KOH 10 mM pH = 7,5. Concentraia de biomaterial aleas a fost de 1 %. Parametri experimentali, folosii pentru obinerea nanostructurilor de biomaterial, sunt prezentai n tez la paginile 47-48 i n Tabelul III.1. Caracterizari morfologice ale structurilor de ARN-az A obinute Morfologia suprafaei i modul de cretere al nanostructurilor de ARN-az A au fost investigate prin microscopie de for atomic (AFM), utiliznd un aparat PicoSPM Molecular Imaging, n modul acustic (dinamic). n Figura III.3 este prezentat o imagine AFM la 90 a unui film de ARN-az A obinut prin depunerea MAPLE, la o fluen de 400 mJ/cm2, a unei inte compozite de 1 % ARN-aza A, n soluie tampon Hepes.

12

Figura III.3 Imagine AFM a unui film subire de ARN-az A, obinut prin iradierea intelor compozite de concentraie 1 % n soluie tampon Hepes. F = 400 mJ/cm2 Filmele depuse n aceste condiii experimentale sunt caracterizate de o morfologie superficial uniform, formnd un strat continuu. Peste acest start uniform, alctuit din nanoparticule de cteva zeci de nanometri, s-au depus particule de biomaterial, de diametre medii, de aproximativ, 500 nm i nalime medie, de aproximativ, 200 nm. Formarea nanoparticulelor de cteva zeci de nanometri se poate atribui mecanismului de cluster-izare a biomaterialului evaporat, n timpul tranzitului, de la int spre colector. Particulele de dimensiuni de sute de nanometri (clusteri), prezente, n mod frecvent, pe suprafaa filmelor depuse prin tehnici laser, provin direct de pe suprafaa intelor iradiate i sunt expulzate sub aciunea presiunii de recul a materialului evaporat. Un alt mecanism de apariie a acestora se datorez ciocnirilor dintre molecule, ce au loc pe durata tranzitului de la int ctre colector78. Morfologia suprafeei s-a schimbat gradual, odat cu creterea valorii fluenei laser incidente (Figura III.4). Att diametrul, ct i nalimea medie a particulelor, au crescut odat cu creterea fluenei. La fluena laser de 700 mJ/cm2, suprafaa filmului a fost, practic, acoperit cu particule de dimensiuni micronice.

Figura III.4 Imagini AFM ale filmelor subiri de ARN-az A obinute prin iradierea intelor compozite de concentraie1 %, n soluie tampon Hepes la diferite fluene laser 13

n condiii experimentale similare (Figura III.5): acelai domeniu de fluene laser i acelai numr de pulsuri laser consecutive, morfologia structurilor obinute, din inte compozite de concentraie 1 % de ARN-az A n ap bidistilat, a fost asemntoare cu structurile obinute din inte compozite n soluie tampon Hepes, att n ceea ce privete dimensiunea particulelor, ct i numrul i distribuia lor pe suprafaa colectorilor.

Figura III.5 Imagini de AFM ale filmelor subiri de ARN-az A obinute prin iradierea intelor compozite de concentratie 1 % de biomaterial n ap distilat, la diferite fluene laser Caracterizari ale compoziiei chimice a materialului de baz i ale filmelor de ARN-az A obinute Compoziia chimic a structurilor i legturile chimice dintre elemeni au fost studiate prin spectroscopie Fourier (FTIR) n domeniul spectral 4.000-500 cm-1, cu ajutorul unui aparat Perkin Elmer Inc., Spectrum one, Wellesley, MA, USA de rezoluie 4 cm-1. Spectrele filmelor au fost comparate cu spectrele biomaterialului de baz folosit la prepararea intelor. Spectrul FTIR al pulberii de ARN-az A, utilizate pentru prepararea intelor criogenice, este prezentat n Figura III.6, iar spectrele filmelor obinute din inte compozite de concentraie 1 % de ARN-az A n soluie tampon Hepes, utiliznd fluene ale radiaiei laser, n domeniul 400-700 mJ/cm2, se dau n Figura III.7. Din cele dou figuri, se poate observa c spectrele filmelor sunt identice cu spectrul biomaterialului de baz.

Figura III.6 Spectul FTIR al pulberii de ARN-az A 14

Dup cum se poate observa din Figura III.7, spectrele filmelor constau din aceleai benzi caracteristice ca i spectrul biomaterialului de baz. Spectrele FTIR ale filmelor sunt asemntoare, n condiii experimentale optimizate. Totui, intensitatea benzilor scade odat cu creterea fluenei laser incidente peste valoarea de prag de 500 mJ/cm2 (a se compara spectrele (b) i (c)). Acest comportament se poate explica prin accelerarea procesului de descompunere, sub aciunea pulsurilor laser, odat cu creterea intensitii fluenei laser incidente.

Figura III.7 Spectrele FTIR ale filmelor subtiri de ARN-az A, obtinue prin depunere MAPLE, din inte compozite de concentraie 1 % de biomaterial n soluie tampon Hepes i fluene laser de (a) 400, (b) 500 i (c) 700 mJ/cm2 Spectrele FTIR ale structurilor obinute din inte compozite preparate, folosind ca solvent apa distilat, reproduc acelai comportament (Figura III.8).

Figura III.8 Spectrele FTIR ale filmelor subtiri de ARN-az A, obtinue prin iradierea intelor compozite de concentraie 1%, de biomaterial n apa distilat, la fluene laser de (a) 400, (b) 500 i (c) 700 mJ/cm2 Evaluarea activitii enzimatice Pentru determinarea activitii enzimatice a ARN-azei A, am folosit metoda cromatografic HPLC. Aceast analiz a fost efectuat la Universitatea Autonom din Barcelona, Facultatea de Biotiine. Toate experimentele HPLC au fost efectuate cu un sistem modular Waters ce const din 15

dou pompe (model 510), un injector de lichid (U6K) i un detector al absorbanei (model 490E). Sistemul a fost controlat de programul Maxima 820. O centrifuga Eppendorf a fost utilizat, n mod constant, pentru a ndeparta orice impuritate, nainte de injectarea soluiei n sistemul HPLC. Activitatea ARN-azei A a fost analizat prin combinarea acesteia cu substratul policitidilic (poli (C)) i separarea produilor de reacie, cu ajutorul cromatografiei cu faz inver. Substratul poli (C) este considerat un analog sintetic al unei catene de ARN i este, n mod frecvent, utilizat n laboratoarele de cercetare pentru determinarea activitii enzimatice a ARN-azei A79. Rezultatele obinute arat c exist un domeniu redus de parametri experimentali care permit sinteza de straturi de biomaterial uniforme, care s asigure meninerea activitii enzimatice, atunci cnd se folosete, ca solvent, soluia tampon Hepes. Fluena laser incident optim, care asigur formarea unui strat continuu i uniform de biomaterial pe suprafaa substratului colector, a fost de 400 mJ/cm2. Pe de alta parte, stucturile de ARN-az A imobilizate la fluene laser peste o valoare de prag de 500 mJ/cm2, nu i menin activitatea enzimatic, din cauza denaturrii enzimei, n timpul iradierii laser. n Figura III.10, am reprezentat cromatogramele straturilor de ARN-az, A obinute cu o fluen laser incident de 500 mJ/cm2. Profilul cromatografic, ce corespunde produilor de separare prin cromatografia HPLC, a fost caracterizat79 anterior. Ultimul maxim, ce apare la 38 minute, corespunde substratului poli (C) neconsumat n reacia de cataliz. Produii de reacie, oligonucleotide cu mas molecular mic, elueaz crescnd masa molecular, de la mononucleotide la polinucleotide, ntr-un interval de 1 pn la 34 de minute. Profilul corespunztor soluiei cu poli (C) incubat cu enzima imobilizat (Figura III.10A) prezint o cantitate mare de produi de reacie cu mase moleculare mici i o cantitate redus de substrat poli (C) neconsumat. Acest rezultat demonstreaz activitatea enzimatic a enzimei ARN-az A imobilizate. n plus, se poate observa c liniile cromatogramei corespunztoare structurii de ARNaz A, imobilizat prin MAPLE (Figura III.10A) reproduc, n mare parte, cromatograma probei de referin79, care conine ARN-aza A neiradiat. Proba de control, ce const n soluie cu substrat poli (C) incubat cu colectori de SiO2, fr ARN-az A (Figura III.10B) prezint o cantitate mare de substrat neconsumat. n Figura III.10B componentele cu mas molecular mic, sunt datorate unei descompuneri n timp a substratului poli (C). n acelai interval al timpului de eluie, maximul corespunztor substratului poli (C) neconsumat nu se poate discrimina n profilul probei de control pozitiv.

16

Figura III.10 Separarea produilor, prin cromatografie HPLC, obinui prin combinarea substratului poli (C) cu ARN-aza A. Profilul timpului de eluie: (A) soluie de poli (C) cu ARN-az A, imobilizat la o fluen laser de 500 mJ/cm2 i (B) soluie de poli (C) incubat cu colectori de SiO2 fr enzim

2. Biosenzori electrochimici Scopul acestui studiu a fost dezvoltarea unor noi senzori electrochimici, bazai pe electrozi serigrafiai, modificai cu filme nanostructurate din materiale hibride anorganice-organice, pentru detecia dopaminei, un neurotransmitor, produs n mod natural n corpul uman80. Am demonstrat c prin tehnica MAPLE, este posibil creterea unor filme nalt calitative hibride, de metaloporfirine. Materiale folosite pentru imobilizare Metaloporfirinele, pe care le-am utilizat n cadrul acestei teze, au fost: Zn(II)-5,10,15,20tetracis(4-piridil)porfirin (ZnTPyP)81 cu structura schematizat n Figura III.17, pagina 58; Co(II)1. R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, A. Andronie, S. Iordache, I. Stamatin, E. Fgdar-Cosma, D.B. Chrisey, Functional porphyrin thin films deposited by matrix assisted pulsed laser evaporation, Materials Science and Engineering B 169 106 (2010) 2. R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, S. Iordache, A. Andronie, I. Stamatin, E. Fgdar-Cosma, D.B. Chrisey, MAPLE deposition of Mn(III) metalloporphyrin thin films: Structural, topographical and electrochemical investigations, Applied Surface Science 257 5293 (2011)

17

5,10,15,20-tetracis(4-metoxiphenil)-porfirin (CoTMeOPP)81 avnd ca schem structural Figura III.18, de la pagina 58; clorur de (5,10,15,20-Tetrafenil) porfinato mangan (III) ((MnTPP)Cl))82 prezentat schematic n Figura III.19, pagina 59. Aceste materiale au fost obinute la Institutul de Chimie din Timioara al Academiei Romne, conform unui protocol bine stabilit83, 84. Imobilizarea metaloporfirinelor cu ajutorul radiaiei laser Pentru a putea obine o int corespunztoare tehnicii MAPLE, metaloporfirinele au fost dizolvate separat n cloroform. Concentraia soluiei de metaloporfirin, n solvent, a fost de 1,%. Pentru voltametrie ciclic, dopamina (98,5,% Fluka) a fost dizolvat n soluie tampon apoas (HPLC water buffer solution). Concentraia i pH-ul au fost stabilite la 10-3 M i, respectiv 7. n timpul experimentului, soluiile de dopamin au fost protejate mpotriva luminii intense, pentru a evita descompunerea lor. Electrozi planari serigrafiai (screen-printed electrodes, SPE) pe substrat ceramic, utilizai pentru a caracteriza rspunsul dopaminei, atunci cnd sunt acoperii cu derivai ai porfirinelor, au fost achiziionai de la DropSens. Pentru a putea efectua teste fizico-chimice, nainte de depunerea pe electrozii serigrafiai, am acoperit cu metaloporfirine colectorii de Si (100) i cuar. Acetia, au fost curai, conform unei proceduri standard, n baia de ultrasunete Elma Transsonic, T310, cu etanol i mentinui, n timpul depunerii, la temperatura camerei. Distana, int-colector, de 4 cm, a fost meninut constant, pe toat durata experimentelor. n Tabelul III.2, de la paginile 60-61, am colectat condiiile de depunere pentru cele trei tipuri de metaloporfirine. Caracterizari ale compoziiei chimice a materialului de baz i ale filmelor de metaloporfirine obinute Pentru a verifica pstrarea integritii moleculelor derivailor de porfirin, dup transferul MAPLE, am utilizat spectroscopia Raman, comparnd materialul de baz i filmul rezultat dup iradierea laser. Spectrele Raman au fost nregistrate cu ajutorul aparatului Jasco NRS 3100. n Figura III.11, sunt prezentate spectrele Raman ale ZnTPyP: material de baz (a), filme subiri obinute prin MAPLE, la o fluen de 200 (b), 300 (c) i 500 mJ/cm2 (d). Gruprile caracteristice (amprentele) structurii hibride metal-porfirin au putut fi identificate i n cazul filmelor subiri. La fluena de 200 mJ/cm2 (Figura III.11a) am observat c se pstreaz structura de baz a materialului ZnTPyP. Atunci cnd fluena crete la 300 mJ/cm2, am constat c nu apar modificri majore n structura filmului obinut. Dac fluena laser crete, la o valoare de 500 mJ/cm2, benzile din regiunea, 1.500-1.400 cm1

, se lrgesc i ncep s dispar din cauz schimbrilor ce au loc n lanul de conformaie i a

rearanjamentelor. n conexiune cu spectrul Raman al ZnTPyP, linia de la 1.004 cm-1, observat dup depunerea MAPLE, este datorat separrii legturilor N-N fa de modul normal (C-Cm)85. 18

Figura III.11 Spectre Raman nregistrate pentru materialulul de baz ZnTPyP (a) i pentru filmele subiri din acest material, depuse la fluene laser de 200 (b), 300 (c) i 500 mJ/cm2 (d) Spectrul Raman pentru metaloporfirina CoTMeOPP este prezentat n Figura III.12: material de baz (a), filme subiri depuse la o fluen de 300 (b) i 500 J/cm2 (c). i n cazul acestei metaloporfirine, se pot observa gruprile caracteristice (amprentele) materialului de baz, CoTMeOPP. Spectrul filmului, depus la o fluena de 300 mJ/cm2 (Figura III.12b) este asemntor cu cel al materialul de baz, pstrnd gruprile caracteristice. Pe msur ce fluena crete (Figura III.12c) are loc o descompunere n regiunea (1.014-997) cm-1, devenind mai larg, apoi mai ngust i, n final, dispare. De asemenea, benzile de la 547 cm-1 i 780 cm-1 dispar.

Figura III.12 Spectre Raman nregistrate pentru materialul de baz CoTMeOPP (a) i pentru filmele subiri ale acestui material, depuse la fluene de 300 (b) i 500 J/cm2 (c) Banda, localizat la 387 cm-1, descrete n intensitate dup depunerea prin MAPLE. Aceast descretere n intensitate este nsoit de apariia unei noi benzi la 433 cm-1, sub forma unui umr al benzii principale. Acest comportament este, cel mai probabil, datorat unei legturi formate ntre ionul de Co i ligand, ce depinde de structura electronic a ionului metalic central. Dimensiunea ionului de metal poate afecta modurile de vibraie n metaloporfirin din cauza modificrii distanei 19

dintre metal i ligand. Exist diferene importante ntre dimensiunea ionului Zn2+ (d() = 2.036) i a Co (d() = 1.949)86. n Figura III.13 sunt prezentate spectrele Raman nregistrate pentru materialul de baz (MnTPP)Cl (a) i pentru filmele subiri ale acestui material, obinute prin MAPLE pe colectori de Si, la fluenele de 200 (b), 300 (c) i 500 mJ/cm2 (d) i pe electrozii serigrafiai, la fluena de 300 mJ/cm2 (e).

Figura III.13 Spectrele Raman nregistrate pentru materialul de baz (MnTPP)Cl (a) i pentru filmele subiri, ale acestui material depuse la fluenele de 200 (b), 300 (c) i 500 mJ/cm2 (d) i pe electrozii serigrafiai la fluena de 300 mJ/cm2 (e) Rezultatele obinute, n cazul filmelor de (MnTPP)Cl, evideniaz c nu are loc o descompunere major sau un rearanjament semnificativ. n cazul filmelor subiri, obinute prin MAPLE, la fluena de 200 mJ/cm2, investigaiile Raman subliniaz c spectrele filmelor sunt asemntoare cu cele ale materialului de baz. Grosimea tipic pentru aceste filme este n jur de 2 m. Atunci cnd fluena laser crete (peste 300 mJ/cm2) ncep s apar modificrile de structur. Filmele depuse la 300 mJ/cm2 i 500 mJ/cm2 au o grosime de 7 i, respectiv, 8 m. Caracterizarea rspunsului electrozilor serigrafiai cu metaloporfirine prin voltametrie ciclic n Figura III.14, am prezentat voltamograme ciclice tipice, nregistrate pentru materialul de baz ZnTPyP i filmele acestui material, depuse prin MAPLE, la 300 i 500 mJ/cm2, pe electrozi serigrafiai. Curbele, nregistrate pentru filmele depuse, au un potenial de oxidare de 180 mV. n inseria din Figura III.14 am prezentat evoluia curentului de oxidare, citit la valoarea potenialului de oxidare, de 180 mV. Densitile curentului de oxidare corespunztoare sunt: 12 A/cm2, pentru filmele obinute la fluena de 500 mJ/cm2; 34 A/cm2, pentru electrozii serigrafiai i 44 A/cm2, pentru filmele depuse cu fluena de 300 mJ/cm2. n aceste condiii, este foarte clar c, la o tensiune 20

de polarizare dat, sensibilitatea la 300 mJ/cm2 este mult superioar celei de la 500 mJ/cm2. Deoarece oxidarea Zn este constant, nu ne putem atepta la niciun efect al potenialului de oxidare. Dac potenialul de oxidare rmne apropiat de cel al electrozilor serigrafiai, atunci curentul de amplificare nu este datorat metaloporfirinei ZnTPyP. Acest lucru indic faptul c, performanele electrozilor serigrafiai nu sunt mbuntite atunci cnd mediatorul este ZnTPyP. De aceea, putem trage concluzia c aceast metaloporfirin nu prezint suficiente caliti pentru a putea fi folosit ca mediator.

Figura III.14 Voltamograme ciclice tipice, nregistrate pentru materialul de baz ZnTPyP i filmele acestui material depuse prin MAPLE, la 300 i 500 mJ/cm2, pe electrozi serigrafiai Voltamogramele ciclice tipice, nregistrate pentru materialul de baz CoTMeOPP i filmele acestui material depuse prin MAPLE, la 300 mJ/cm2 i 500 mJ/cm2, pe electrozi serigrafiai, sunt prezentate n Figura III.15. Potenialul de oxidare, pentru filmele depuse la 300 mJ/cm2, este de 100 mV. Densitile de curent, pentru acest material sunt: 5 A/cm2, pentru filmele depuse la fluena de 500 mJ/cm2, 22 A/cm2, pentru electrozii serigrafiai i 27 A/cm2, pentru structurile depuse prin MAPLE cu fluena de 300 mJ/cm2. n aceste experimente, scopul principal a fost acela de a gsi mediatori sensibili, cu un semnal ce poate fi detectat, atunci cnd potenialul de oxidare este aproape de 0, cu electrozi serigrafiai CNT.

Figura III.15 Voltamograme ciclice tipice, nregistrate pentru materialul de baz CoTMeOPP i filmele acestui material depuse prin MAPLE, la 300 i 500 mJ/cm2, pe electrozi serigrafiai 21

Studiile anterioare de voltametrie ciclic87 au evideniat trei procese atribuite schimbrilor electrochimice n trepte a CoIII-porfirinei la CoII-porfirin la CoI-porfirin i, respectiv, la Co0porfirin88. Pe de alt parte, abilitatea Zn a fost redus doar la strile +2 i 0. ntruct Co i schimb starea de oxidare de la Co2+ la Co3+, el se poate comporta ca un mediator eficient ntre dopamin i suprafaa electrodului, ducnd la un potenial de oxidare mai sczut, de 100 mV. Curentul de oxidare este mai mic dect cel al electrodului neacoperit. De aceea, o scal de gradare ar fi extrem de util pentru a putea avea informaiile necesare despre metaloporfirine.

Comportamentul voltametric al dopaminei pentru electrozii serigrafiai neacoperii i cei acoperii prin MAPLE cu (MnTPP)Cl este prezentat n Figura III.16. Rspunsul dopaminei la electrozii serigrafiai definete un maxim de oxidare de 104 mV i unul de reducere, centrat la 50 mV (Figura III.16, curba desenat din linii). Diferena dintre potenialele maximelor anodice i catodice este (Epa-Epc) = 54 mV, indicnd un proces cvasi-reversibil. Electrodul de Au, acoperit prin MAPLE cu (MnTPP)Cl, prezint un maxim de oxidare puternic, la 980 mV i un maxim de reducere, la 142 mV (Figura III.16, curba format din puncte). Diferena de potenial este (Epa-Epc) = 838 mV. Primele dou maxime de oxidare, centrate la 300 i 500 mV, sunt minore i pot fi atribuite interferenei cu gruprile OH, strilor de oxidare metastabile i reaciei de oxidare a inelului porfirinic89. Valoarea de potenial a dopaminei, estimat ca medie a potenialelor maximelor anodice i catodice (Epa+Epc)/2, a fost de 77 mV i 561 mV, n raport cu electrodul referin de Ag, fa de electrozii neacoperii i, respectiv, electrozii cu film subire de (MnTPP)Cl.

Figura III.16 Voltamograme ciclice tipice pentru electrozi serigrafiai neacoperii i pentru cei acoperii cu filmele de (MnTPP)Cl depuse la 300 mJ/cm2 La potenialul de oxidare de 980 mV, densitatea de curent are o valoare de ~ 108 A/cm2. Detecia dopaminei devine, n felul acesta, posibil la concentraii foarte mici (< 10-2 M). Potenialul 22

de oxidare de 980 mV este asociat cu formarea cationului porfirin (radical cation ) ntr-o stare de oxidare ridicat.

Comparnd rspunsul la dopamin al electrozilor neacoperii, cu al celor acoperii cu cele trei tipuri de metaloporfirine, la diferite fluene, putem spune c valoarea maxim a curentului de oxidare descrete, atunci cnd fluena laser este ridicat, sugernd o posibil degradare. Deoarece n cazul metaloporfirinei, pe baz de Zn, nu exist nicio diferen ntre maximele curbelor corespunztoare fiecrei fluene, performanele electrozilor serigrafiai nu sunt mbuntite. Totui, metaloporfirina CoTMeOPP, se poate comporta ca un mediator eficient ntre dopamin i suprafaa electrodului, ducnd la un potenial de oxidare mai sczut, deoarece Co i modific starea de oxidare. Atunci cnd potenialul de oxidare are o valoare cuprins n domeniul (100-500) mV, se produc interferene semnificative provenite de la ali analii prezeni n fluidele corpului uman (acid uric i acid ascorbic), ngreunnd, n felul acesta, detecia dopaminei. Deoarece la poteniale de oxidare ridicate, de 980 mV, rspunsul (densitatea de curent) atinge o valoare de ~ 108 A/cm2, detecia dopaminei devine posibil la concentraii foarte mici (< 10-2 M). Acest lucru demonstreaz c electrozii serigrafiai de Au, acoperii cu film subire de (MnTPP)Cl, pot fi considerai ca posibili candidai pentru dezvoltarea biosenzorilor.

23

Capitolul IV. SISTEME DE ADMINISTRARE CONTROLAT DE MEDICAMENTE_____________________________________________________

Studiile actuale n domeniul administrrii controlate de medicamente au, ca prim direcie de cercetare, descoperirea i introducerea n terapie, de noi molecule bioactive i obinerea unui control precis asupra vitezei i locului de eliberare a substanelor medicamentoase. Aceast direcie de cercetare presupune utilizarea diferitelor tehnologii farmaceutice, n vederea modulrii vitezei de cedare a substanei medicamentoase (controlled drug release) sau livrrii substanei la locul de aciune (drug targeting)90. Cedarea controlat de medicament are loc atunci cnd o substan, biodegradabil i biocompatibil, este combinat judicios cu un medicament sau un agent activ, astfel nct acesta din urm s fie eliberat din sistem ntr-o maniera prestabilit90. Cedarea agentului activ poate fi continu i constant (pe o perioad ndelungat) sau ciclic i n trane, la intervale mari de timp91. Atunci cnd un medicament este administrat, n mod convenional, doar o mic parte din substana activ ajunge la locul de aciune, restul fiind pierdut ntr-un alt esut, ndeprtat nainte de a aciona asupra esutului int sau distrus, nainte de la ajunge destinaie. De-a lungul timpului, cercettorii n domeniu au ncercat s amplifice activitatea medicamentului i s minimizeze efectele adverse prin crearea de sisteme de administrare a medicamentelor (Engl. DDS-Drug Delivery Systems)92. Polimerii biocompatibili au devenit componente eseniale n producerea sistemelor de administrare a medicamentelor. Utilizarea acestora, n scopuri biologice, s-a extins foarte mult n ultimii ani, cu aplicaii n ingineria esuturilor, obinerea de implanturi pentru organe artificiale sau proteze, membrane pentru dializa sngelui, elemente pentru condiionarea i administrarea medicamentelor, n oftalmologie, stomatologie, reconstrucii osoase i multe altele93, 94. Riscul de producere a unor reacii alergice de respingere a grefelor i protezelor a impus selecia unor polimeri cu suprafee anticoagulante i care, n urma biodegradrii, nu formeaz compui toxici, alergenici sau cancerigeni95. O direcie de dezvoltare a produselor biocompatibile, biodegradabile i bioresorbabile a urmrit obinerea de forme farmaceutice retard i preparate transdermice, cu eliberare controlat a substanei active, numite sisteme de administrare controlat de medicamente (Engl.: CDDS Controlled Drug Delivery Systems)90. Aceste sisteme sunt bazate pe concepii interdisciplinare ce combin tiina polimerilor, farmacologia, chimia bioconjugatelor i biologia molecular. Ele sunt n continu dezvoltare, deoarece se dorete minimizarea degradrii sau pierderii medicamentului, prevenind astfel efectele toxice i crescnd disponibilitatea i cantitatea de medicament acumulat n zona specific. 24

n cadrul acestei teze, am ales s lucrez cu vectori de biopolimeri, deoarece sistemele rivale de transport a substanei active, precum lipozomii i anticorpii, prezint dezavantaje greu de ignorat i de rezolvat. Astfel, lipozomii (vezicule sferice de fosfolipide) gsindu-se sub forma de particule, sunt vzui de macrofage ca antigeni. S-au gsit n ficat i splin cantiti mari din aceste substane, chiar i n condiiile n care lipozomii au fost camuflai prin acoperiri cu polietilenglicol (PEG). n plus, lipozomii prezint i tendina de a iei din vasele sangvine n esuturi, unde elibereaz substana activ, n mod nedorit. n schimb, anticorpii, sunt dezavantajai de faptul c receptorii celulelor tumorale sunt prezeni n majoritate i la celulele sntoase. Sarcina de a gsi anticorpi specifici, aparinnd numai celulelor canceroase, devine astfel extrem de dificil. Polimerii solubili n ap rezolv aceste probleme prin alegerea judicioasa a materialului, astfel nct, s nu genereze reacii imune i s permit transportul de ageni anticanceroi, prin legturi ce se rup sub cataliza unor substane sintetizate numai de celulele tumorale. Dezavantajul sistemelor polimerice const n capacitatea redus de stocare a substanei active. Scopul meu, n cadrul acestei teze, a fost sinteza de straturi subiri din noi biopolimeri cu grupri funcionale ce permit legarea unui numr mult mai mare de molecule de medicament (pn la 15, pentru fiecare molecul de polimer), n vederea creterii eficienei vectorilor, n transportul de substana activ.

REZULTATE ORIGINALE 1. Filme de derivai ai alcoolului polivinilic: caracterizri fizico-chimice i teste in vitro Alcoolul polivinilic este unul dintre cei mai promitori polimeri datorit proprietilor sale fizico-chimice i biologice (solubilitate n soluii apoase, stabilitate chimic ridicat, i proprieti adezive). Gruprile hidroxil funcionale, permit modificarea alcoolului polivinilic prin legturi covalente, obinnd n felul acesta, raportul hidrofobic/hidrofilic dorit pentru CDDS. Structura acoolului polivinilic coninnd grupri carboxil legate de un nucleu aromatic (APVCOOH) este prezentat n figura IV.5 de la pagina 86. Pentru a obine rezultate ct mai bune de acoperire a substanei active, am realizat pentru nceput, filme de APVCOOH 96 pe colectori de Si (100) curate dup un protocol riguros. Matricea utilizat pentru depunerile MAPLE, n cazul acestui polimer, a fost dimetil-sulf-oxid (DMSO). Dup o serie de teste, s-a stabilit c, cea mai bun concentraie, pentru obinera viitoarelor inte MAPLE, este de 5 %. Distana int substrat a fost meninut la 4 cm. Rata de repetiie a laserului a fost 5 Hz, iar durata pulsului laser a fost de 25 ns. Energia laser pe puls a fost meninut la 46 mJ. Aria
R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, G. Caraene, A. Ionescu, D. Mihaiescu, R. Albulescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, I.N. Mihailescu, D.B. Chrisey, Functionalized Polyvinyl Alcohol Derivatives Thin Films for Controlled Drug Release and Targeting Systems: MAPLE Deposition and Morphological, Chemical and In Vitro Characterization, Applied Surface Science 255, 5600 (2009)

25

spotului de iradiere a fost aleas corespunztor n domeniul (6,5 - 20) mm2. Numarul de pulsuri laser, aplicate consecutiv pentru o singura depunere, a fost 20.000. Condiiile optime depunerilor MAPLE de APVCOOH sunt date n Tabelul IV.1, pagina 86. Caracterizri morfologice ale structurilor de APVCOOH obinute Imaginile de microscopie au fost nregistrate cu un aparat AFM, model Integrated Platform SPM-NTegra. n figura IV.1, sunt vizibile micrografiile AFM ale filmelor subiri de APVCOOH obinute prin MAPLE, la fluenele de (i) 300 mJ/cm2, (ii) 500 mJ/cm2 i (iii) 700 mJ/cm2. Pentru valori ale fluenei relativ mici (300 mJ/cm2) suprafaa prezint o morfologie globular nlnuit care prezint o structur nanoporoas, cu distribuie larg de pori de dimensiuni n domeniul (1 - 10) nm. Odat cu creterea fluenei laser, la 500 mJ/cm2, structura poroas, observat anterior, devine mai compact (1 - 20) nm i este suplimentat de prezena multor structuri globulare nlnuite reticulate independente, distribuite neomogen. Pentru valori de 700 mJ/cm2 se observ extinderea domeniilor de biopolimeri cu tendina de compactizare mai accentuat, dect n cazul fluenei de 500 mJ/cm2.

Figura IV.1 Micrografiile AFM ale filmelor subiri de APVCOOH obinute prin MAPLE, la fluenele de 300 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 i 700 mJ/cm2 Caracterizri ale compoziiei chimice a materialului de baz i ale filmelor de APVCOOH obinute Spectrele FTIR au fost nregistrate cu un aparat Thermo Nicolet Nexus cuplat cu microscop IR Centaurus prevzut cu un dispozitiv ATR cu cristal de ZnSe, la 45 grade de tip Smart ARK. 26

Aceste spectre au fost achiziionate la rezoluie 4 cm-1, cu mediere pe 32 de spectre, la viteza oglinzii de 0,6 cm/s pe domeniul spectral, 4.000-650 cm-1. n figura IV.2 sunt prezentate spectrele FTIR ale polimerului APVCOOH, material de baz si filme subiri obinute prin MAPLE la diferite fluene. Filmele de APVCOOH prezint benzile de absorbie specifice materialului de baz, corespunztoare gruprilor hidroxil din alcoolul polivinilic (3.384 cm-1), vibraiilor C-H (2.855-2.943 cm-1), fraciunii carbonil (1.731 cm-1), C-O din funciunea esteric (1.265 cm-1) i gruprii C-O-C esterice (1.120 cm-1). Se constat pstrarea caracteristicilor spectrului FTIR din materialul de baz, fapt ce demonstreaz transferul materialului organic, fr degradare chimic.

Figura IV.2 Spectrele FTIR pentru APVCOOH de referin (dropcast) i structurile obinute prin MAPLE, la fluenele cuprinse n intervalul, 200 700 mJ/cm2 Teste in vitro: ibuprofen acoperit cu APVCOOH Pe baza datelor obinute n urma investigaiilor fizico-chimice, am selectat pentru testele in vitro, urmtoarele condiii pentru acoperirea ibuprofenului cu APVCOOH: energia laser de 46 mJ, aria spotului de 11,5 mm2 i un numr de 40.000 pulsuri, pentru acoperirea uniform a substanei active. Ibuprofen este numele moleculei organice acidului 2-(4-Izobutil-fenil)-p-ropionic97. Ibuprofenul, folosit pentru aceste studii, este un derivat al acidului fenilacetic i, ca atare, acioneaz ca antiinflamator, analgezic i antipiretic cu eficacitate asemntoare acidului acetilsalicilic. Evaluarea toxicitatii: model experimental in vitro cultura primar de hepatocite de obolan nainte de acoperirea substanei active de ibuprofen cu APVCOOH, a fost evaluat toxicitatea acestui polimer pe culturi de hepatocite de obolan. Datele experimentale i rezultatele de viabiliate celular n culturi primare de hepatocite expuse la APVCOOH sunt descrise n paginile 9091 ale tezei mele. 27

Cu ajutorul acestor experimente am demonstrat c APVCOOH nu prezint efecte citotoxice, pe intervalul de concentraie aplicat. Concentraia maxim administrat depete, cu circa 3 ordine de mrime, valoarea concentraiei de expunere estimate. In consecin, acest polimer poate fi considerat sigur, n cazul utilizri cat agent de acoperire pentru comprimatele de ibuprofen. Evaluarea modificrilor de biodisponibilitate: model experimental Ca model experimental s-a utilizat un sistem de disoluie n lichide ce mimeaz fluidele biologice din tubul digestiv (suc gastric i suc intestinal). i. Model de solubilizare gastric:Soluie de NaCl 0,9 % acidulat (pH 2,5) cu 0,1 % HCl. ii. Model de solubilizare digestiv: Tampon de Na2Co3 50 mM, pH 8,2 n 0,9 % NaCl. Comprimatele de ibuprofen au fost introduse n 50 mL soluie digestiv i au fost incubate la temperatura de 20 C, prin agitare lent, constant (40 rpm). ntr-un prim experiment, s-a estimat perioada de solubilizare complet i s-a stabilit intervalul de recoltare a probelor, astfel nct s se asigure o densitate optim (zece minute) a punctelor pentru realizarea curbei de disoluie, trasnd spectrele UV-VIS cu spectrofotometrul Anthelie-Secomam. Spectrele de absorbie a substanei active de ibuprofen sunt redate n figurile IV.11 i IV.12, paginile 92 93. Pe baza datelor obinute, s-au efectuat determinrile de compus, la lungimile de und de 210 nm (mediu de dizolvare acid) i 224 nm (mediu de dizolvare alcalin). Curbele de disoluie, nregistrate pentru comprimatele de ibuprofen acoperite i neacoperite cu APVCOOH, sunt redate n figurile IV.3 i IV.4. Din examinarea datelor prezentate, se constat c, n mediu acid, acoperirea cu APVCOOH este stabil, timp de 14 minute, conferind o bun gastro-rezisten comprimatelor. Dincolo de pragul de stabilitate al nveliului, disoluia decurge rapid. n mediu alcalin, APVCOOH rezist circa 9 minute, dupa care disoluia comprimatului este accelerat semnificativ.

Figura IV.3 Graficul de disoluie al ibuprofenului n mediu acid; detaliu: (0-20) minute

28

Figura IV.4 Graficul de disoluie al ibuprofenului n mediu alcalin; detaliu: (0-20) minute

2. Filme de polizaharide pentru CDDS: teste in vitro i in vivo** Triacetat pullulan-ul se obine, n mod uzual, prin acetilarea pullulan-ului cu acid acetic, n prezena acidului sulfuric, dup o reet brevetat de Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutic Bucureti98. Reacia de obinere a triacetat pullulan-ului este prezentat n figura IV.15 din tez. Teste in vitro: eliberarea diclofenacului sodium acoperit cu triacetat pululan Studiile noastre au fost focalizate pe controlul temporal i spaial al eliberrii substanei active de diclofenac de sodiu (DFS) din comprimatele acoperite cu triacetat pullulan. DFS este un compus nesteroidian, cu pronunate efecte: antireumatice, antiinflamatoare, analgezice i antipiretice, determinate de inhibiia biosintezei de prostaglandine, care au un rol major n producerea inflamaiei, durerii i febrei99. n bolile reumatice, proprietile antiinflamatore i analgezice ale DFS determin ameliorarea n cazul durerilor n repaus sau la mobilizare, edem articular i disfunctionaliti articulare100. Pentru experimentele MAPLE de acoperire a substanei active de diclofenac, am folosit 2,% triacetat pullulan n soluie de cloroform98. Pe baza rezultatelor caracterizrilor fizico-chimice, efectuate anterior n laboratorul nostru101, am selectat cele mai bune condiii de depunere a triacetatului pullulan: energia laser de 46 mJ, cu rata de repetiie de 2 Hz i dimensiunea spotului de 11,5 mm2. Numrul de pulsuri necesar acoperirii unui singur comprimat de diclofenac a fost de 15.000.
**

R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, G. Caraene, R. Albulescu, T. Buruiana, D.B. Chrisey, Pulsed Laser Processing of Functionalized Polysaccharides For Controlled Release Drug Delivery Systems, NATO ASI book chapter 2011

29

Testele in vitro efectuate au urmrit viteza de dizolvare a comprimatelor de DFS acoperite cu triacetat pullulan, comparativ cu cele normale. Testarea a cuprins 3 etape: 1. Stabilirea condiiilor optime de dispersare/dizolvare a comprimatelor de DFS Pentru a se stabili condiiile de dispersare/solubilizare, s-au fcut cteva teste. Astfel, s-a ncercat dizolvarea comprimatelor n: 1. ser fiziologic; 2. ser fiziologic alcalinizat cu NaOH, pH = 8,5; 3. ser fiziologic acidulat cu HCl, pH = 3. Raportul a fost de un comprimat la 10 mL soluie, iar testrile au fost efectuate la 37 C. Datele experimentului de solubilizare i rezultatele obinute sunt sintetizate n Tabelul IV.2. Pentru experiementele in vitro ulterioare s-a ales, ca mediu de solubilizare, serul fiziologic alcalinizat cu NaOH, pH = 8,5, valoare apropiat de cea din intestinul subire. 2. Caracterizarea spectrofotometric a soluiei de DFS n vederea monitorizrii cineticii de eliberare in vitro a substanei active din comprimatele acoperite i neacoperite cu triacetat pullulan, s-a trasat spectrul unei soluii obinute n condiiile de la punctul 1. Concentraia soluiei a fost de 0,05 mg/mL. Spectrul soluiei de DFS (figura IV.17, din teza) a fost nregistrat cu ajutorul unui spectrofotometru UV/VIS SECOMAM Dathelie, iar citirea sa fcut folosind ca referin, soluia de solubilizare. Se observ c spectrul prezint dou maxime de absorbie, la 214 i respectiv, 277 nm. Pentru experiementul urmtor, de urmrire a cineticii de cedare in vitro a substanei active din comprimatele de DFS, probele au fost citite la ambele lungimi de und caracteristice, pentru c nu se putea stabili corespondena maximelor cu gruparea funcional activ a medicamentului. 3. Cinetica de cedare in vitro a substanei active din comprimatele de DFS simple sau acoperite cu triacetat pullulan Comprimatele au fost plasate n cte un balon Erlenmayer i s-au adugat cte 50 mL ser fiziologic alcalinizat. Pe toat durata experimentului, baloanele au fost meninute la 37 C. Din 30 n 30 de minute, probele au fost agitate uor pentru omogenizare i a fost citit absorbana la 214 nm, i respectiv, 277 nm, lungimi de und corespunzatoare maximelor spectrului de absorbie caracteristic pentru soluia de DFS n ser fiziologic. Datele sunt prezentate n Tabelul IV.3. Probele au fost efectuate n triplicat. Pe baza datelor din acest tabel, au fost trasate graficele din figurile IV.5 i IV.6, care reprezint absorbanele celor dou tipuri de probe la = 214 nm, i respectiv, = 277 nm.

30

Figura IV.5 Cinetica de cedare in vitro la = 214 nm

Figura IV.6 Cinetica de cedare in vitro la = 277 nm

Din graficele ce urmresc cinetica de cedare in vitro a substanei active din comprimatele de DFS, putem face urmtoarele remarci: i. n condiiile experimentale stabilite (dizolvare n ser fiziologic alcalinizat, pH = 8,5, temperatura 37 C) ambele tipuri de comprimate de DFS au avut o ntrziere de pn la o or; ii. Filmul de triacetat pullulan nu a mpiedicat eliberarea substanei active din comprimatele acoperite; iii. n urmtoarea or, s-au nregistrat concentraii uor crescute ale DFS eliberat din comprimatele neacoperite, dovedind efectul retard determinat de filmul de triacetat pullulan; iv. Triacetat pullulan-ul este solubil n ser fiziologic i, de aceea, dup 2 ore, concentraiile eliberate din cele dou tipuri de comprimate s-au egalizat. 31

Teste in vivo: testarea comprimatelor de DFS pe iepuri Acoperirea medicamentelor cu produi derivai nu afecteaz proprietile farmacodinamice intrinseci ale substantei active, dar poate modifica eficacitatea acesteia, datorit modificrii biodisponibilitatii, vitezei de solubilizare n medii biologice. De aici, rezult c se impune evaluarea produsului, din punctul de vedere al modificrii vitezei de solubilizare i a condiiilor de solubilizare n tractul gastrointestinal, n urma acoperirii comprimatului. Testarea comportamentului in vivo a comprimatelor de DFS, acoperite cu triacetat pullulan, a avut ca scop comparaia cu comprimatele neacoperite, din punct de vedere al activitii biologice. Pentru testare, a fost ales ca produs de referin DFS sub form de comprimate de 25 mg. Ca efect biologic de monitorizat a fost aleas aciunea antiinflamatoare, pentru c permitea o abordare experimental fezabil pe animale mai mari (iepuri), crora s li se poat administra per os comprimatele ntregi. n paginile 102-104 am descris n detaliu modul de lucru pentru realizarea experimentelor in vivo. Evoluia n timp a edemului la nivelul urechii la iepurii tratai cu cele dou tipuri de comprimate de DFS este prezentat i sub form grafic n Figura IV.7.

Figura IV.7 Variaia edemului auricular la animalele tratate cu cele dou tipuri de DFS

Experimentul in vivo efectuat pe iepuri a pus n eviden urmtoarele aspecte caracteristice pentru comprimatele de DFS acoperite cu triacetat pullulan, comparativ cu comprimatele de DFS simple: i. Filmarea comprimatelor de DFS cu triacetat pullulan nu a mpiedicat dispersarea enteral i absorbia substanei active, astfel nct evoluia n timp a edemului auricular, la animalele tratate, apreciat pe baza grosimii urechii la nivelul inducerii inflamaiei, este destul de asemntoare; 32

ii. Se remarc o uoar ntrziere n instalarea efectului antiinflamator, la lotul tratat cu comprimatele de DFS filmate cu triacetat pullulan, n sensul c edemul la lotul tratat cu DFS (comprimate neacoperite ) intr n faza de platou, la jumtate de or de la inducerea inflamaiei, n vreme ce, la lotul tratat cu DFS filmate cu triactetat pullulan, edemul maxim se nregistreaz la o or de la inducerea inflamaiei. Se poate spune ca filmul de triacetat pullulan a determinat un efect de ntrziere a dispersiei/absorbiei substanei active, la nivel enteral.

3. Filme subiri hibride de P(CPP:SA)20:80 gentamicin: teste antibacteriene n aceste studii, s-a urmrit investigarea proprietilor antibacteriene a filmelor hibride polimer-medicament mpotriva bacteriilor Escherichia coli i a Staphyloccocus aureus102. Aceste bacterii au fost asociate cu formarea unui biofilm, proces n care bacteria ader la o suprafa 103-105. Infeciile din biofilm sunt periculoase pentru dispozitivele medicale implantate (catetere, stimulatoare cardiace i endoscoape) 106-108. Sub form de biofilm, bacteriile sunt mult mai rezistente la antibiotice datorit unor factori precum: quorum sensing microbian i celule latente persister bacteriene105. Funcionalizarea antimicrobian a dispozitivelor medicale este o metod mult mai eficient de prevenire a infeciilor nozocomiale (infecii dobndite n cursul spitalizarii) dect administrarea sistemic de antibiotice, deoarece previne formarea biofilmului de ctre bacterii. Pentru aceste investigaii, am selectat polimerul poli(1,3-bis-(p-carboxilfenoxil propan)-co-anhidrida sebacic)) 20:80 (P(CPP:SA)20:80) datorit hidrofobicitii i eroziunii controlate a suprafeei, care sunt caliti indispensabile pentru CDDS102, 109. P(CPP:SA) 20:80 (figura IV.22 din teza) cu o mas molecular de 55 kDa. Ca medicament, am ales soulia de gentamicin de concentraie 10 mg/mL, produs de MP Biomedical, LLC (Solon, Ohio, USA). Acest medicament este unul dintre cele mai stabile antibiotice aminoglicozidice, care rmne activ la temperaturi ridicate, chiar i dup autoclavare110. Pentru prepararea intelor MAPLE, am utilizat o soluie ce coninea polimerul P(CPP:SA) 20:80, medicamentul gentamicin i matricea acetat de etil. Raportul dintre gentamicin i acetatul de etil a fost de 1:20 (CPPSA2-GA5) i 1:10 (CPPSA2-GA10). n ambele soluii, concentraia P(CPP:SA) 20:80 a fost de 2 %. intele au fost obinute prin turnarea soluiei ntr-un suport de cupru i apoi ngheate, prin imersarea n azot lichid, timp de 30 minute. n Tabelul IV.5, de la pagina 107, am prezentat condiiile experimentale pentru obinerea filmelor hibride polimermedicament, depuse pe substraturi de cuar i Si (100).
R. Cristescu, C. Popescu, G. Socol, A. Visan, I.N. Mihailescu, S.D. Gittard, P.R. Miller, T.N. Martin, R.J. Narayan, A. Andronie, I. Stamatin, D.B. Chrisey, Deposition of antibacterial of poly(1,3-bis-(p-carboxyphenoxy propane)-co-(sebacic anhydride)) 20:80/gentamicin sulfate composite coatings by MAPLE, Applied Surface Science 257 5287 (2011)

33

Caracterizri morfologice ale filmelor hibride polimer-medicament Microscopia electronic de baleiaj (SEM) i spectroscopia de raze X cu dispersie de energie (EDS) au fost realizate cu ajutorului aparatului Hitachi S-3200 (Hitachi, Tokyo, Japan) cu detector Robinson, ce a operat n modul de presiune variabil. Rugozitatea suprafeelor a fost determinat prin profilometrie, cu ajutorul Tencor Alpha-Step 200 (KLA-Tencor, Milpitas, CA, SUA). n Figura IV.8, sunt prezentate imaginile SEM ale filmelor pentru cele dou concentraii de gentamicin.

Figura IV.8 Imagini SEM ale filmelor de CPPSA2-GA5 (A-C) i CPPSA2-GA10 (D-F)

Microscopia electronic de baleiaj demonstreaz c filmele hibride prezint o suprafa rugoas, ce acoper uniform substratul. Spectrele EDS ale materialelor de baz (Figura IV.24), obinute la o mrire de 100x, indic prezena carbonului i a oxigenului. Acoperirile CPPSA2-GA5 sunt compuse din carbon, oxigen i prezint urme uoare (< 2 % atomic) de Cu, Na, Mg, Al, Si, P, S, K i Ca (figura IV.25), iar CPPSA2-GA10 conine Cu, Si, S i Ca (figura IV.26). Si este atribuit substratului de cuar, iar Cu a fost, probabil, ablat din suportul intei. Totui, cuprul este un metal biocompatibil, utilizat n multe dispozitive medicale (dispozitive intrauterine) i este cunoscut ca agent antibacterian111, 112. Profilul a fost realizat la o scanare a suprafeei de 2000 m2. Valorile rugozitii suprafeei au fost de 0,9 m i 0,8 m, pentru filmele de CPPSA2-GA5 i respectiv, CPPSA2-GA10. Aceast rugozitate este legat, n primul rnd, de morfologia filmului, deoarece substraturile de cuar, folosite pentru depunere, au fost polisate optic. Chiar dac filmele de CPPSA2-GA5 au prezentat valori medii crescute ale rugozitii, acestea scad ns, n domeniul deviaiei standard a acoperirilor CPPSA-GA10, fcnd imposibil corelarea diferenei de comportament, ntre cele dou straturi, cu rugozitatea. Filmele celor dou materiale nu prezint diferene semnificative ale rugozitii suprafeei.

34

Caracterizri ale compoziiei chimice a filmelor hibride polimer-medicament Spectrele FTIR au fost nregistrate cu ajutorul aparatului FTIR-8400S (Shimadzu Corp, Kyoto, Japan), ce opereaz n domeniul numerelor de und de 7.800350 cm1. n Figura IV.9, sunt prezentate spectrele FTIR pentru CPPSA2-GA5: material de baz-dropcast (a) i film subire obinut prin MAPLE (b). Toate maximele de absorbie, caracteristice filmelor de CPPSA2-GA5, depuse prin MAPLE i utiliznd acetat de etil, ca matrice, sunt asemntoare cu cele ale materialului de baz109. n figura IV.10 am prezentat spectrele FTIR caracteristice CPPSA2-GA10: material de baz dropcast (a) i film subire obinut prin MAPLE (b). Filmele de CPPSA2-GA10 confirm prezena gruprilor funcionale caracteristice polimerului P(CPP:SA)20:80 i lipsa impuritilor109. Maximul de la 1.750 cm-1 poate fi atributit componentei anhidride a polimerului, iar maximul din jurul valorii de 1.600 cm-1 corespunde inelului aromatic din CPP113.

Figura IV.9 Spectrele FTIR pentru CPPSA2-GA5: material de baz (a) i filme subiri obinute prin MAPLE (b)

Figura IV.10 Spectrele FTIR pentru CPPSA2-GA10: material de baz (a) i filme subiri obinute prin MAPLE (b) 35

Teste in vitro: investigarea proprietilor antibacteriene ale filmelor hibride polimermedicament Din analiza eantioanelor de difuzie, pentru probele tratate, observm zone clare de inhibare, suprafee ce nconjoar proba unde este absent creterea bacteriilor (Figurile IV.11a, b). Microscopia optic a demonstrat c nu exist creteri semnificative n interiorul zonei de inhibare sau pe suprafaa probelor. Acest rezultat indic faptul c acoperirile antibacteriene au fost eficiente mpotriva bacteriei E. coli. Probele cu coninut de 10 % gentamicin au avut o zon medie mai extins dect cele cu 5 %. Totui, diferena n dimensiunea zonei de inhibare nu a fost semnificativ. Controlul negativ de cuar nu a fost tratat i de aceea, nu a prezentat zone de inhibare, creterea celulelor fiind observat n jurul probei-control i pe suprafaa acesteia (figura IV.11c).

Figura IV.11 Imagini de microscopie optic a eantioanelor de difuzie dup 24 ore pentru bacteria E. coli pe plci de agar Mueller Hinton II acoperite cu (a) filme subiri de CPPSA2-GA5, (b) filme subiri de CPPSA2-GA10, i (c) controlul pe cuar Eantioanele de difuzie au confirmat c agentul microbian din film a fost eliberat n mediul njurtor. Creterea bacteriilor pe aceste probe a fost examinat pe o perioada de 24 ore,rezultatele indicnd activitate antibacterian a materialului, n acest timp. Deoarece concentraia agentului antibacterian descrete odat cu creterea distanei de la prob, informaia despre gradientul de concentraie al gentamicinei eliberate n mediul nconjurtor, poate fi dedus. Concentraia minim de inhibare a gentamicinei pentru E. coli tip ATCC 25922 este de 0,5g/mL114. Concentraia de gentamicin n agar a fost de 0,5g/mL, la distana de ~5,4 mm de film. Testul antibacterian, prin picurare, a indicat faptul c filmele hibride de polimer-medicament sunt active mpotriva bacteriei S. aureus. Efectul filmelor antibacteriene a fost calculat prin compararea acestora cu proba de control, la intervalul de timp ales. Trebuie s notm c toate probele, chiar i controlul, au urmat un profil descendent n timp, din cauza lipsei de nutrieni la deshidratarea probelor i a microorganismelor. Aa cum se vede din Figura IV.12, filmele cu 5 % i 10 % gentamicin au o rat superioar de distrugere, fa de probele netratate, la toate intervale de timp alese. Testul antibacterian, prin picurare, s-a dovedit a fi mai precis dect testul eantioanelor de difuziune, oferindu-ne informaii despre activitatea antibacterian, pe o perioad scurt de timp.

36

La 1-2 ore de la expunere, au fost observate bacterii viabile. Dup 4 ore de expunere, nu au mai fost observate bacterii viabile. Rata de distrugere a bacteriilor, datorat filmelor de CPPSA2GA5 i CPPSA2-GA10, este asemntoare, indicnd faptul c ea nu poate fi corelat cu concentraia de gentamicin. Utiliznd pentru aceste teste, dou microorganisme diferite, bacteria Gram pozitiv i bacteria Gram negativ, am reuit s obinem o activitate antibacterian specific, datorat materialelor folosite.

Figura IV.12 Procentul de supravieuire al coloniilor S. aureus n funcie de timp pe (a) filme subiri de CPPSA2-GA5, (b) filme subiri de CPPSA2-GA10 i (c) controlul pe cuar, n timpul testului antibacterian prin picurare Testele au indicat c depunerile MAPLE, cu coninut diferit de gentamicin, sunt mijloace eficiente de producere a acoperirilor ce vor mpiedica formarea biofilmelor pe dispozitivele medicale implantabile.

4. Filme din nanoparticule magnetice core/shell funcionalizate cu substan activ: caracterizri fizico-chimice i teste antibacteriene Nanoparticulele magnetice, pe baz de oxizi de fier, prezint proprieti fizice specifice care le fac accesibile utilizrii n medicin. Proprietatea fizic, care st la baza acestor aplicaii medicale, const n capacitatea de interaciune a acestor particule, la aplicarea unui cmp magnetic exterior, cu diferitele esuturi "int". Fero-fluidele sunt considerate, astzi, ca mijloace terapeutice medicale de viitor. Datorit impactului terapeutic i diagnostic, n aplicaiile in vivo, proprietile microscopice ale nanoparticulelor magnetice sunt factori determinani. Cteva dintre aceste proprieti sunt

R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, D.E. Mihaiescu, A.M. Grumezescu, A. Andronie, I. Stamatin,

V. Lazar, C. Chifiriuc, C. Saviuc, M. Popa, and D.B. Chrisey, Magnetic core/shell nanoparticle thin films deposited by maple: chemical, morphological and in vitro biological assays investigations, in proof to Applied Surface Science 2011

37

determinate de particularitile fizice ale nanoparticulelor magnetice de mici dimensiuni. Dimensiunile miezului nanoparticulelor sunt de ordinul ctorva nanometri, pn la zeci de nanometri115, 116. Primele fluide magnetice au fost preparate prin mcinarea particulelor de oxizi de fier care au fost amestecate cu heptan sau alte hidrocarburi cu lan lung, dar i cu un agent de tip surfactant (acid oleic)115. Mai trziu, obinerea lor s-a realizat prin precipitarea Fe3+ i a Fe2+ n soluii apoase bazice. Nanoparticulele obinute au fost acoperite cu acid oleic i mai apoi, dispersate ntr-un lichid purttor116. Pentru stabilizarea suspensiilor apoase a nanoparticulelor magnetice, aceste particule sunt mpiedicate s se agrege, prin nconjurarea lor cu un strat de compui anorganici. Se reduce astfel, interacia bipolar dintre miezurile nanoparticulelor metalice117. Acest lucru poate duce la creterea dimensiunilor particulelor la cteva sute de nanometri, dimensiuni semnificativ mai mici, fa de cele ale celulelor, dar mult mai mari, dect marea majoritate a moleculelor organice, ca genele, proteinele i viruii. Particulele cu aceste dimensiuni pot fi numite generic entitii biologice i iau parte la procesele metabolice care au loc la nivelul acestei scale nano. Cu scopul de a asigura biocompatibilitatea mbuntit, nanoparticulele magnetice pot fi acoperite cu materiale organice, ca de exemplu, dextran 118. Pentru a examina eficiena nanoparticulelor magnetice acoperite cu acid oleic pentru testele antimicrobiene, cercetrile realizate de noi au fost focalizate pe transferul acestor nanoparticule funcionalizate cu antibiotice, pe substraturi de sticl de microscop pentru investigaii morfologice, structurale i antibacteriene. Antibioticele vizate pentru acest studiu au fost ceftriaxon (Hoffman-La Roche)119 i cefepim120 (Bristol-Myers Squibb), dou cefalosporine (derivai ai antibioticelor betalactamice) folosite pentru tratamentul numeroaselor infecii bacteriene prevenind creterea i meninerea pereilor celulari ai bacteriilor121. Pentru experimentele MAPLE, am folosit soluii ce conineau 1 % Fe3O4/acid oleic/cefalosporine n cloroform122. Soluiile au fost picurate ntr-un suport de cupru i imersate n azot lichid, timp 30 de minute. Depunerile acestor materiale, prin MAPLE, au fost realizate n camera de reacie, la o presiune de 30 Pa. Fluena laser a fost selectat n domeniul (65 300) mJ/cm2 la o rat de repetiie de 10 Hz. Numrul de pulsuri aplicate a variat ntre 7.200 i 20.000. Distana int substrat a fost meninut la 4 cm. Caracterizri morfologice ale sistemelor hibride nanoparticule magnetice-antibiotic Imaginile de microscopie au fost nregistrate cu un aparat AFM model Integrated Platform SPM-NTegra. Imaginile AFM ale materialului de baz n soluie (dropcast) i ale filmelor subiri depuse n cazul filmelor de Fe3O4/acid oleic, Fe3O4/acid oleic/cefepim, i Fe3O4/acid oleic /ceftriaxon sunt prezentate n figura IV.33 de la pagina 117. Din aceast figur am putut observ c 38

substana activ a cefalosporinelor induce un efect cumulativ asupra dimensiunii granulelor i, uneori, poate da o modificare a formei acestora, cum este cazul antibioticului cefepim. Caracterizri ale compoziiei chimice a sistemelor hibride nanoparticule magneticeantibiotic n Figura IV.13, sunt prezentate spectrele FTIR ale: Fe3O4/acid oleic material de baz (dropcast) (a) i film subire(b); Fe3O4/ acid oleic/ceftriaxon dropcast (c) i film subire (d); Fe3O4/acid oleic/cefepim dropcast (e) i film subire (f). Maximul specific antibioticului ceftriaxon este atribuit benzilor intense de ntindere C=O (~1.781 cm-1), n timp ce pentru antibioticul cefepim avem C=O (~1.740 cm-1) i NH2 (3.150 i 3.051) cm-1. Toate spectrele filmelor, depuse prin MAPLE, sunt asemntoare cu spectrele materialelor de baz.

Figura IV.13 Spectre FTIR (de jos n sus) Fe3O4/acid oleic material de baz (dropcast) (a) i film subire(b); Fe3O4/ acid oleic/ceftriaxon dropcast (c) i film subire (d); Fe3O4/acid oleic/cefepim dropcast (e) i film subire (f) Teste in vitro: activitatea antimicrobian a sistemelor hibride nanoparticule magneticeantibiotic Activitatea antimicrobian a compuilor investigai a fost testat mpotriva bacteriilor Grampozitive (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis) i Gram-negative (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli). Lanurilde de Enterobacteriaceae au fost identificate prin teste biochimice API 20E, n timp ce P. aeruginosa, B. subtilis i S. aureus au fost identificate cu sistemul automat VITEK I. Cardurile VITEK pentru testele de identificare i susceptibilitate (GNS522) au fost introduse i incubate, conform recomandrilor productorului123,124. Suspensiile bacteriene de densitate 0,5 McFarland IU, folosite n experimente, au fost obinute din culturile bacteriene dezvoltate n medii solide, timp de 18 ore125. Procedura de lucru este descris pe larg in pagina 120. Rezultatele noastre arat c, n ciuda cantitii reduse de antibiotice, nanoparticulele acoperite cu antibiotice inhib creterea microbian i aderena la colectorii ineri (Figurile IV.14 i IV.15). 39

Ambele antibiotice inhib puternic abilitatea bacteriilor Gram-pozitive (S. aureus i B. subtilis) de a produce silme i de a adera la pereii de sticl (figura IV.15), n timp de ceftriaxon s-a dovedit foarte activ mpotriva bacteriilor Gram-negative (E. coli i P. aeruginosa).

Figura IV.27 Influena filmelor depuse prin MAPLE asupra proliferrii microbiene, prin msurarea absorbanei la 600 nm (valori reprezentate pe axa Y) a culturii lichide

Figura IV.28 Influena filmelor depuse prin MAPLE asupra abilitii lanurilor bacteriene de a adera la colectorul inert reprezentat de pereii de sticl de microscop, msurat prin producia de slime (valori reprezentate pe axa Y)

Rezultatele noastre au artat c nanoparticulele nu au influenat semnificativ aderena celulelor HeLa pe film care a dezvoltat un monostrat, dup 24 de ore de incubare. Prin examinarea monostratului celular, nu se observ modificri morfologice n celulele HeLa, comparativ cu controlul, demonstrnd faptul c nanofilmul nu are efecte citotoxice asupra celulelor eucariote. Indicele de aderena nu a fost afectat de filmul de nanoparticule. 40

Capitolul V. CONCLUZII____________________________________________
Principalele rezultate originale prezentate n aceasta tez pot fi sumarizate astfel: 1. Am studiat efectul parametrilor experimentali, fluena laser incident i modul de preparare a intelor compozite pentru experimentele MAPLE, asupra modului de cretere, morfologiei suprafeei, compoziiei chimice, structurii moleculare i activitaii enzimatice a structurilor de ARN-az A. Obiectivul principal a fost gsirea condiiilor experimentale care s permit imobilizarea structurilor de ARN-aza A, n mod controlat i evitarea descompunerii biomaterialului, n urma iradierii laser, asigurnd n acelai timp, meninerea activitii enzimatice. n condiiile experimentale optime, compoziia chimic, starea cristalin i activitatea enzimatic a structurilor este asemntoare cu cele ale biomaterialul de baz utilizat pentru prepararea intelor. 2. Am demonstrat c tehnica evaporrii laser asistate de o matrice este adecvat pentru imobilizarea metaloporfirinelor de ZnTPyP i CoTMeOPP. Gruprile caracteristice (amprentele) celor dou materiale de baz, ZnTPyP i CoTMeOPP, au fost identificate i n cazul filmelor subiri depuse prin MAPLE, la o fluen de 300 mJ/cm2. Am investigat, prin voltametrie ciclic, filmele subiri de metaloporfirin depuse prin MAPLE pe electrozi serigrafiai CNT, folosind dopamina ca analit. Cele mai bune proprieti de detecie au fost obinute n cazul CoTMeOPP. 3. Am demonstrat c tehnica MAPLE este adecvat pentru obinerea filmelor subiri de (MnTPP)Cl. Imaginile AFM au identificat prezena unor structuri globulare, cu un diametru mediu ce descrete cu fluena laser. Cu ajutorul investigaiilor Raman, am identificat, pentru filmele subiri obinute prin MAPLE cu fluena cuprins ntre 200 500 mJ/cm2, gruprile caracteristice materialului de baz, (MnTPP)Cl. Efectul Raman de suprafa a fost observat, n cazul filmelor obinute la 300 mJ/cm2. Atunci cnd fluena laser crete peste aceast valoare, au loc modificri de structur ale gruprilor vibraionale (grupri simetrice/asimetrice). Prin voltametria ciclic am observat c electrozii serigrafiai de Au cu film subire de (MnTPP)Cl, obinut la 300 mJ/cm2, au prezentat un maxim anodic ce tinde spre poteniale nalte, cnd se folosete, ca analit ,dopamina. n aceste condiii, se poate afirma c electrozii serigrafiai de Au cu filme subiri de (MnTPP)Cl pot fi utilizai ca mediatori pentru detecia dopaminei. 4. Compusul alcool polivinilic, APVCOOH, prezint o capacitate bun de acoperire a comprimatelor de ibuprofen. Acest polimer are o rezisten adecvat prin expunere la fluidul gastric, putnd fi utilizat la obinerea unor preparate gastrorezistente. n mediu slab alcalin (specific segmentului intestinal), APVCOOH prezint o rezistena superioar, fiind un posibil agent de ntarziere a dizolvrii (recomandabil pentru producerea unor comprimate cu eliberare ntrziat). Se are n vedere continuarea studiilor i realizarea unor acoperiri, cu grosime variabil, pentru a se putea controla mai bine timpul de disoluie. APVCOOH este necitotoxic, n domeniile utilizate de concentraie relativ ridicate, plasate peste limitele de expunere. 41

5. Testele farmacologice, efectuate pe cele dou variante de comprimate de diclofenac (cpr. 25 mg i cpr. 25 mg, acoperite cu triacetat pululan, prin metoda MAPLE) au pus n eviden urmtoarele aspecte relevante: - Filmul de triacetat pululan a permis dispersia/solubilizarea in vitro a substanei active din comprimatele testate i - Filmul de triacetat pululan induce un efect retard, la cedarea in vitro a substanei active, iar proprietile sale de retardare sunt influenate de natura mediului de dispersie/solubilizare. 6. Experiementele in vivo, privind evaluarea aciunii antiinflamatoare a celor dou tipuri de comprimate de diclofenac, au fost n bun corelare cu datele de cinetic de cedare, obinute din studiile in vitro. Datele, obinute din studiile farmacologice de pn acum, permit dezvoltarea de modele experimentale pentru alte tipuri de comprimate, cu alte tipuri de aciuni specifice i, eventual, cu alte niveluri de dispersie/absorbie. 7. Tot prin MAPLE, am obinut filme subiri de poli(1,3-bis-(p-carboxilfenoxil propan)-coanhidrida sebacica)) 20:80 ce conin gentamicin n concentraii diferite . Am investigat activitatea antimicrobian a filmelor hibride polimer-medicament mpotriva bacteriilor Escherichia coli i a stafilococului auriu i am demonstrat c straturile subiri, care conin un agent bactericid, pot inhiba n mod eficient creterea i proliferarea bacteriilor Gram- pozitive i Gram- negative. 8. Am demonstrat c, n cazul sistemelor hibride, de tipul: nanoparticule magneticeantibiotic, Fe3O4/acid oleic/ceftriaxon i Fe3O4/acid oleic/cefepim, tehnica MAPLE este foarte eficient pentru obinerea de filme cu structur similar cu materialul de baz. Imaginile AFM ale filmelor de Fe3O4/acid oleic/cefalosporine au artat c antibioticele influeneaz morfologia suprafeei, prin dimensiunea granulelor i modificarea formei acestora, n cazul medicamentului cefepim. Am artat c nanoparticulele acoperite cu medicamente prezint un efect inhibitor puternic asupra viabilitii, aderenei la celule i la colectorul inert a bacteriilor Gram-pozitive i Gram-negative. Acest lucru duce la incapacitatea dezvoltrii unui biofilm matur, cu rate egale sau superioare concentraiei minime inhibitorii a suspensiilor de antibiotice. Particulele magnetice pot fi folosite pentru dezvoltarea unui nou material cu proprieti antimicrobiene sau pentru strategii n combaterea patogenilor dezvoltai n biofilme, implicai frecvent n etiologia infeciilor cronice asociate biofilmelor, prezentnd avantajul citotoxicitii reduse pe celule de eucariote. Ca perspectiv a cercetrilor din tez, am propus folosirea tehnicii MAPLE pentru realizarea de dispozitive medicale implantabile, rezistente la dezvoltarea i proliferarea microorganismelor patogene.

42

Referinte bibliografice
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

J. L. West and N.J. Halas, Annu. Rev. Biomed. Eng. 5, 285 (2003) S. Cosnier, Biosensors and Bioelectronics 14, 443 (1999) K. Kojima, A. Hiratsuka, H. Suzuki, K. Yano, K. Ikebukuro and I. Karube, Anal Chem 75, 1116 (2003) A.F. Chetcuti, D.K.Y Wong and M.C. Stuart, Anal chem 71, 4088 (1999) A. Subramanian, J. Irudayaraj and T. Ryan, Biosensors and Bioelectronics 21, 998 (2006) B. Hong and K.A. Kang, Biosensors and Bioelectronics 21, 1333 (2006) S. Rodriguez-Mozaz, M.L. Alda and D. Barcelo, Water Research 39, 5071(2005) G.Y. Shen, H. Wang, T. Deng, G.L. Shen and R.Q. Yu, Talanta 67, 217 (2005) W.C. Tsai and I.C. Lin, Sensor Actuator B 106, 455 (2005) D.P. Skla, Z.Ji. Lkova, I. Svoboda, R.V. Kola, Biosensors and Bioelectronics 20, 2027 (2005) T.T. Sand, J.E. Zielinski, C. Arthur, D. Bradley and S. Wie, Biosensors and Bioelectronics 18, 797 (2003) b. B. Hopp, T. Smausz, Zs. Antal, N. Kresz, Zs. Bor and D. Chrisey, J. Appl. Phys. 96(6), 3478 (2004) M. Mutlu, Biosensors in food processing, safety and quality control, (CRC Press, 2011) S.C Litescu, S. Eremia and G.L. Radu, In Bio-Farms For Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control By Biosensors 698, pp. 241-249. 2010.

10. 11. 12. 13. 14.

15.

A.C Ion, I. Ion, A. Culetu, D. Gherase, C. A. Moldovan, R. Iosub and A. Dinescu, Materials Science and Engineering: C 30 (6), 817 (2010)

16. 17.

L.G. Zamfir, L. Rotariu and C. Bala, Biosensors and Bioelectronics 26, 3692 (2011) E. Gyorgy, E. Axente, I. N. Mihailescu, D. Predoi, S. Ciuca and J. Neamtu, Journal of Materials Science: Materials in Medicine 19, 1335 (2008)

18.

T. Smausz, G. Megyeri, R. Kkesi, C. Vass, E. Gyrgy, F. Sima, I.N. Mihailescu and B. Hopp, Thin Solid Films 517

(15), 4299 (2009)

19. 20.

E. Gyrgy, A. Prez del Pino, G. Sauthier, A. Figueras, Journal of Applied Physics 106, 114702(2009) F. Sima, P. Davidson, E. Pauthe, L.E. Sima, O. Gallet, I. Mihailescu and K. Anselme, Acta Biomaterialia 7 (10), 3780 (2011)

21.

T. S. Drakakis, G. Papadakis, K. Sambani, G. Filippidis, S. Georgiou, E. Gizeli, C. Fotakis and M. Farsari, Appl. Phys. Lett. 89, 144108 (2006)

22. 23. 24. 25. 26.

S.M. Rybak and D. L. Newton, Exp. Cell Res. 253, 325 (1999) U. Arnold, Current Pharm. Biotechnol. 9(3), 161 (2008) P. A. Leland, K. E. Staniszewski, B. M. Kim and R. T. Raines, J. Biol. Chem. 276, 43095 (2001) F. J. Xu, Q. Cai, Y. Li, E. T. Kang and K. Neoh, Biomacromolecules 6 , 1012 (2005) V. Grazu, O. Abian, C. Mateo, F. Batista-Viera, R. Fernandez-Lafuente and J. M. Guisan, Biotechnol. Bioeng. 90, 597 (2005)

27. 28.

I. Brigger, C. Dubernet and P. Couvreur, Adv Drug Deliv Rev 54, 631 (2002) M.F. Zambaux, B. Faivre-Fiorina, F. Bonneau, S. Marchal, J.L. Merlin, E. Dellacherie, P. Labrude and C. Vigneron, Biomaterials 21, 975 (2000)

29. 30.

M.E. Akerman, W.C. Chan, P. Laakkonen, S.N. Bhatia and E. Ruoslahti, Proc Natl Acad Sci USA 99, 12617 (2002) S.M. Moghimi, J. Szebeni, Prog Lipid Res 42, 463 (2003)

43

31. 32. 33. 34.

I. Bala, S. Hariharan and M.N. Kumar, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 21, 387 (2004) S.A. Agnihotri, N.N. Mallikarjuna and T.M. Aminabhavi, J. Control Release 100, 5 (2004) K. Cammann and Z. Fresenius, Anal. Chem. 287, 1 (1977) B.D. Malhotra and A.P.F. Turner, Advances in Biosensors: Perspectives in Biosensors, (Jai Press, Elsevier, Netherlands,

2003)
35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45.

D. Buerle, Laser Processing and Chemistry, (Springer, Berlin, 2000) M. Von Allmen and A. Blatter, Laser-Beam Interactions with Materials, (Springer, Berlin, 2nd ed., 1995) I. N. Mihailescu and E. Gyrgy, in Trends in Optics and Photonics, edited by T. Asakura, p.201 (Springer, Berlin, 1999) R.R. Gattass and E. Mazur, Nat. Photon. 2, 219 (2008) D.B. Chrisey, G.K. Hubler, Pulsed Laser Deposition of Thin Films (Wiley, New York, 1994) M.H. Niemz, Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications (Springer, Berlin, 1996) A. Vogel and V. Venugopalan, Chem. Rev. 103, 577 (2003) A. Nevin, P. Pouli, S. Georgiou and C. Fotakis, Nat. Mater. 6, 320 (2007) G. Hass and J.B. Ramsey, Appl. Optics 8, 1115 (1969) H.M Smith and A.F. Turner, Appl. Optics 4, 147 (1965) M. Filipescu, S. Orlando, V. Russo, A. Lamperti, A. Purice, A. Moldovan and M. Dinescu, Appl. Surf. Sci. 253(19), 8258 (2007)

46.

G. Socol, E. Axente, C. Ristoscu, F. Sima, A. Popescu, N. Stefan, L. Escoubas, J. Ferreira, S. Bakalova, A. Szekeres and I. N. Mihailescu, Journal of Applied Physics 102, 083103 (2007)

47.

X. Obradors, T. Puig, A. Palau, A. Pomar, F. Sandiumenge, P. Mele and K. Matsumoto, Comprehensive Nanoscience and Technology 3, 303 (2010)

48.

V. Galluzzi, A. Augieri, T. Petrisor, L. Ciontea, G. Celentano, A. Mancini, A. Vannozzi, A.A. Angrisani and A. Rufoloni, Physica C: Superconductivity 470, S142 (2010)

49. 50. 51. 52.

P. Miglietta, L. Cultrera, C. Cojanu, E.L. Papadopoulou and A. Perrone, Appl. Surf. Sci. 255, 5228 (2009) A. Zakery, Y. Ruan, A. V. Rode, M. Samoc and B. Luther-Davies, J. Opt. Soc. Am. B 20, 1844 (2003) P Mosaner, M Bonelli and A Miotello, Appl. Surf. Sci 208-209, 561 (2003) A.C. Popescu, F. Sima, L. Duta, C. Popescu, I.N. Mihailescu, , D. Capitanu, R. Mustata, L.E. Sima, S.M. Petrescu and D. Janackovic, Appl. Surf. Sci. 255, 5486 (2009)

53.

D. Tanaskovic, Dj. Veljkovi, R. Petrovi, Dj. Janakovi, M.Mitri, C. Cojanu, C. Ristoscu and I.N. Mihailescu, Key

Engin. Mater. 361-363, 277 (2008)

54. 55.

H. Pelletier, A. Carrad, J. Faerber and I. N. Mihailescu, Appl. Phys. A 102 (3), 629 (2011) N. Scarisoreanu, M. Filipescu, A. Ioachim, M.I. Toacsan, M.G. Banciu, L. Nedelcu, A. Dutu, M. Buda, H.V. Alexandru and M. Dinescu, Appl. Surf. Sci. 253 (19), 8254 (2007)

56.

R. Eason, Pulsed Laser Deposition of Thin Films: Applications-Led Growth of Functional Materials, (John Wiley & Sons Inc, 2007)

57. 58. 59. 60.

S.G. Hansen and T.E. Robitaille, Appl. Phys. Lett. 52, 81 (1988) R. Srinivasan and B. Braren, Chem. Rev. 89, 1303 (1989) S. Lazare, V. Granier, Laser Chem. 10, 25 (1989) T. Lippert, Plasma Process. Polym. 2, 525 (2005)

44

61. 62.

T. Lippert, in Polymers and Light, 168, 51 (Springer, Berlin, 2004) A. Pique, R.A. McGill, D.B. Chrisey, D. Leonhard, T. Maina, B. Spargo, J. Callahan, R. Vachet, R. Chung and M. Bucaro, Thin Solid Films 355-356, 536 (1999)

63.

R.A. McGill and D.B. Chrisey, Method of producing a film coating by matrix assisted pulsed laser deposition, Patent 6,025,036 (2000)

64.

R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, I.N. Mihailescu, A. Andronie, I. Stamatin, O.S.

Ionescu, D. Mihaiescu, T. Buruiana and D.B. Chrisey, Appl. Surf. Sci. 255(10), 5605 (2009)
65.

R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, D. Mihaiescu, S.D. Gittard, R.J. Narayan, T. Buruiana, I. Stamatin and D.B. Chrisey, Appl. Surf. Sci. 255(24), 9873 (2009)

66. 67.

K. Cammann and Z. Fresenius, Anal. Chem. 287, 1 (1977) B.D. Malhotra and A.P.F. Turner, Advances in Biosensors: Perspectives in Biosensors, (Jai Press, Elsevier, Netherlands,

2003)
68. 69. 70. 71. 72.

J. Newman and S. Setford. Mol Biotechnol..32(3), 249 (2006) C. Perovici and Gh. Huhulea, Curs de biochimie, (Editura de Stat Didactica si Pedagogica, 1961) D.R. Walt, Science 308, 217 (2005) M. Madou and M.J. Tierney, Appl. Biochem. Biotech. 41, 109 (1993) I. Stamatin, Nanomateriale aplicaii n biosenzori, surse de energie, medicin i biologie, Elemente de nanotehnologie, (Universitatea Bucureti 2008)

73. 74.

M. Pohanka and P. Skldal, J. Appl. Biomed. 6, 57 (2008) C. Popescu, J. Roqueta, A. Prez del Pino, M. Moussaoui and M. V. Nogus, E. Gyrgy, J. Mater. Res. 26, (6), 815 (2011)

75.

C. Frazo, C.E. McVey, M. Amblar, A. Barbas, C. Vonrhein, C.M. Arraiano and M.A. Carrondo, Nature 443, 110 (2006)

76.

A. Barbas, R.G. Matos, M. Amblar, E. Lpez-Vias, P. Gomez-Puertas and C.M. Arraiano, J. Biol. Chem. 283(19),

13070 (2008)
77. 78. 79. 80.

M. Bencina, J. Babic and A. Podgornik, J. Chromatography A 1144, 135 (2007) P. Schaff, Laser Processing of Materials, (Springer Series in Materials Science 139, Berlin 2010) M. Moussaoui, A. Guasch, E. Boix, C.M. Cuchillo and M.V. Nogues,. J. Biol. Chem. 271, 4687 (1996) J.J Clark, S.G Sandberg, M.J Wanat, J.O Gan, E.A Horne, A.S Hart, C.A Akers, J.G Parker, I. Willuhn, V. Martinez,

S.B. Evans, N. Stella and P.E.M Phillips, Nature Methods 7, 126 (2009)
81.

R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, A. Andronie, S. Iordache, I. Stamatin, E. Fgdar-

Cosma, D.B. Chrisey, Materials Science and Engineering B 169 106 (2010)
82.

R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, S. Iordache, A. Andronie, I.

Stamatin, E. Fgdar-Cosma, D.B. Chrisey, Applied Surface Science 257 5293 (2011)
83. 84.

D. Vlascici, E. Fgdar-Cosma and O. Bizerea Spiridon, Sensors 6, 892 (2006) E. Fgdar-Cosma, M.C. Mirica, I. Balcu, C. Bucovicean, C. Cretu, I. Armeanu and Gh. Fgdar-Cosma, Molecules 14,

1370 (2009)
85. 86.

S. Sato and T. Kitagawa, Appl. Phys. B 59, 415 (1994) W.R. Scheidt, The Porphyrins, edited by D. Dolphin, vol. III, 463, (Academic Press, 1978)

45

87. 88. 89.

H.E. Toma and K. Araki, Coord. Chem. Rev. 196 (1), 307 (2000) S. Cosnier, C. Gondran, R. Wessel, F.-P. Montforts and M. Wedel, Sensors 3, 213 (2003) K.M. Kadish, Z. Ou, J. Shao, C.P. Gros, J. M. Barbe, F. Jerome, F. Bolze, F. Burdet and R. Guilard, Inorg. Chem. 41, 3990 (2002)

90.

H. Wen and K. Park, Oral Controlled Release Formulation Design and Drug Delivery: Theory to Practice, (Wiley 2011-

09-28)
91.

M. Morishita and K. Park, Biodrug Delivery Systems: Fundamentals, Applications and Clinical Development (Drug and

the Pharmaceutical Sciences), (Informa Healthcare 2010)

92. 93. 94. 95. 96.

K.K. Jain, Drug Delivery Systems, (Humana Press 2008) L.G. Griffith Acta Mater. 48, 263 (2000) H.Q. Shi and B.D. Ratner, J. Biomed. Mater. Res. 49, 1 (2000) A.S. Hoffman, Adv. Drug Delivery Rev. 43, 3 (2002) R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, G. Caraene, A. Ionescu, D. Mihaiescu, R. Albulescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, I.N. Mihailescu andD.B. Chrisey, Applied Surface Science 255, 5600 (2009)

97. 98.

ro.wikipedia.org/wiki/Ibuprofen R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, G. Caraene, R. Albulescu, T. Buruiana and D.B. Chrisey, Technological Innovations in Sensing and Detection of Chemical, Biological, Radiological Nuclear Threats and Ecological Terrorism, NATO Science for Peace and Security Series A: Chemistry and Biology, edited by A. Vaseashta, E. Braman, P. Susmann, (Springer 2011/2012)

99.

ro.wikipedia.org/wiki/Diclofenac C. Popescu, R. Cristescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, M. Floarea-Spiroiu, A. Andronie, I. Stamatin, T. Buruiana and D.B. Chrisey, Submitted to Materials Science and Engineering C 2011

100.

101.

R. Cristescu, M. Jelinek, T. Kocourek, E. Axente, S. Grigorescu, A. Moldovan, D.E. Mihaiescu, M. Albulescu, T. Buruiana, J. Dybal, I. Stamatin, I.N. Mihailescu and D.B. Chrisey, Journal of Physics: Conference Series 59, 144 (2007)

102.

R. Cristescu, C. Popescu, G. Socol, A. Visan, I.N. Mihailescu, S.D. Gittard, P.R. Miller, T.N. Martin, R.J. Narayan, A.

Andronie, I. Stamatin and D.B. Chrisey, Applied Surface Science 257 5287 (2011)
103. 104. 105. 106. 107. 108. 109.

T.F.C. Mah and G.A. OToole, TRENDS Microbiol. 9, 34 (2001) J.M. Yarwood, D.J. Bartels, E.M. Volper and E.P. Greenberg, J. Bacteriol. 186, 1838 (2004) S.D. Gittard, J.R. Perfect, N.A. Monteiro-Riviere, W. Wei, C. Jin and R.J. Narayan, Appl. Surf. Sci. 255, 5806 (2009) R.M. Donlan and J.W. Costerton, Clin. Microbiol. Rev. 15, 167 (2002) G.S. Baillie and L.J. Douglas, Antimicrob. Agents Chemother. 42, 1900 (1998) V. Sihorkar and S.P. Vyas, Pharm. Res. 18, 1247 (2001) R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, S. Grigorescu, C. Nastase, F. Nastase, A Doraiswamy, R.J. Narayan, I. Stamatin,

I.N. Mihailescu and D.B. Chrisey, Applied Surface Science 254, 1169 (2007)
110. 111.

K.C. Popat, M. Eltgroth, T.J. LaTempa, C.A. Grimes and T.A. Desai, Biomaterials 28, 4880 (2007) L. Sun, X. B. Huang, J. P. Suo, B. L. Fan, Z. L. Chen, W. X. Yang and J. Li. Fertility and Sterility doi:10.1016/j.fertnstert.2010.04.041 (in press)

112. 113.

G. Fandez, M. Troncoso, P. Navarrete and G. Figueroa. BMC Microbiology 4, 19 (2004) K. J. Pekarek, M. J. Dyrud, K. Ferrer, Y. S. Jong and E. Mathiowitz, J. Control. Rel. 40, 169 (1996)

46

114. 115. 116. 117. 118.

R. J. Fass and J. Barnishan, Antimicrob. Agent Chemother. 16, 622 (1979) Q.A.Pankhurst, J. Connolly, S.K. Jones, and J. Dobson, J. Phys. D: Appl. Phys. 36, 337 (2003) S. Laurent, D. Forge, M. Port, A. Roch, C. Robic, L.V. Elst and R.N. Muller, Chem. Rev. 108, 2064 (2008) C.C. Berry and A.S.G. Curtis, J. Phys. D: Appl. Phys. 36, R198 (2003) D. Predoi, C. S. Ciobanu, M. Radu, M. Costache, A. Dinischiotu, C. Popescu, E. Axente, I. N. Mihailescu, E. Gyorgy,

Accepted for publication in Materials Science and Engineering C 2011

119. 120. 121. 122.

D.M. Richards, R.C. Heel, R.N. Brogden, T.M. Speight and G.S. Avery, Drugs 27, 469 (1984) L.B. Barradell and H.M. Bryson, Drugs 47, 471 (1994) M.A. Kohanski, D.J. Dwyer and J.J. Collins, Nature Reviews Microbiology 8, 423 (2010) R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, D.E. Mihaiescu, A.M. Grumezescu, A. Andronie, I.

Stamatin, V. Lazar, C. Chifiriuc, C. Saviuc, M. Popa, and D.B. Chrisey, In proof to Applied Surface Science 2011
123.

C. Saviuc, A. M. Grumezescu, A. Holban, C. Chifiriuc, D. Mihaiescu and V. Lazar, Biointerface Research in Applied Chemistry 1, 64 (2011)

124.

C. Saviuc, A. M. Grumezescu, E. Oprea, V. Radulescu, L. Dascalu, M. C. Chifiriuc, M. Bucur, O. Banu and V. Lazar, Biointerface Research in Applied Chemistry 1 15 (2011)

125.

E. Panus, C.M. Chifiriuc, O. Banu, M. Mitache, C. Bleotu, N. Rosoiu and V. Lazar, Biointerface Research in Applied Chemistry 1, 24 (2011)

47

Articole cotate ISI

1. Processing and immobilization of enzyme Ribonuclease A through laser irradiation C. Popescu, J. Roqueta, A. Perez del Pino, M. Moussaoui, M.V. Nogues, E. Gyorgy Journal of Materials Research 26 (6) (2011), 815-821, IF = 1.402 2. Deposition of antibacterial of poly(1,3-bis-(p-carboxyphenoxy propane)-co-(sebacic anhydride)) 20:80 / gentamicin sulfate composite coatings by MAPLE R. Cristescu, C. Popescu, G. Socol, A. Visan, I.N. Mihailescu, S.D. Gittard, P.R Miller, T.N. Martin, R.J. Narayan, A. Andronie, I. Stamatin, D.B. Chrisey Applied Surface Science 257 (2011) 52875292, IF = 1.795 3. MAPLE deposition of Mn(III) metalloporphyrin thin films: Structural, topographical and electrochemical investigations R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, S. Iordache, A. Andronie, I. Stamatin, E. Fagadar-Cosma, D.B. Chrisey, Applied Surface Science 257 (2011) 52935297, IF = 1.795 4. Hybrid dextran-iron oxide thin films deposited by laser techniques for biomedical applications D. Predoi, C. S. Ciobanu, M. Radu, M. Costache, A. Dinischiotu, C. Popescu, E. Axente, I. N. Mihailescu, E. Gyorgy Accepted for publication in Materials Science and Engineering C (20 octombrie 2011, reference number MSEC-D-1000669R2), IF=2.180 5. Functional porphyrin thin films deposited by matrix assisted pulsed laser evaporation R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, A. Andronie, S. Iordache, I. Stamatin, E. FagadarCosma, D.B. Chrisey, Materials Science and Engineering B 169 (2010), 106110, IF = 1.568 6. Mg-based photocathodes prepared by ns, ps and fs PLD for the production of high brightness electron beams P. Miglietta, L.Cultrera, C. Cojanu, E.L. Papadopoulou, and A. Perrone Applied Surface Science 255 (2009), 52285231, IF = 1.616 7. Biocompatible and bioactive nanostructured glass coatings synthesized by pulsed laser deposition: in vitro biological tests A.C. Popescu, F. Sima, L. Duta, C. Popescu, I.N. Mihailescu, D. Capitanu, R. Mustata, L.E. Sima, S.M. Petrescu and D. Janackovic Applied Surface Science 255 (2009), 54865490, IF = 1.616 8. Functionalized Polyvinyl Alcohol Derivatives Thin Films for Controlled Drug Release and Targeting Systems: MAPLE Deposition and Morphological, Chemical and In Vitro Characterization R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, G. Caraene, A. Ionescu, D. Mihaiescu, R. Albulescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, I. N. Mihailescu, D. B. Chrisey Applied Surface Science 255 (2009), 56005604, IF = 1.616 9. Laser Processing of Polyethylene Glycol Derivative and Block Copolymer Thin Films R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, O.-S. Ionescu, D. Mihaiescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, I. N. Mihailescu, D. B. Chrisey Applied Surface Science 255 (2009), 56055610, IF = 1.616

48

10. Functional polyethylene glycol derivatives nanostructured thin films synthesized by matrix-assisted pulsed laser evaporation R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, D. Mihaiescu, S.D. Gittard, R.J. Narayan, T. Buruiana, I. Stamatin, D.B. Chrisey Applied Surface Science 255 (2009), 9873-9876, IF = 1.616 11. Processing of Poly(1,3-bis-(p-Carboxyphenoxy Propane)- co-(Sebacic Anhydride)20 : 80 (P(CPP : SA)20 : 80) by Matrix-Assisted Pulsed Laser Evaporation for Drug Delivery Systems R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, S. Grigorescu, C. Nastase, F. Nastase, A Doraiswamy, R.J. Narayan, I. Stamatin, I.N. Mihailescu, D.B. Chrisey Applied Surface Science 254 (2007), 11691173P, IF = 1.406

Articole necotate ISI 1. Characterization of pulsed laser deposited AlN films as a gate dielectric in aln-si mis structures S. Simeonov, S. Bakalova, E. Kafedjiiska, A. Szekeres, S. Grigorescu, A. Popescu, C. Cojanu, F. Sima, G. Socol, I. N. Mihailescu 29th International Semiconductor Conference CAS 2006, Sinaia, Romania, Vol. 2, pp. 261-264 Capitole de carte 1. Double-layer bioactive glass coatings obtained by Pulsed Laser Deposition D. Tanaskovic, Dj. Veljkovi, R. Petrovi, Dj. Janakovi, M.Mitri, C. Cojanu, C. Ristoscu, I.N. Mihailescu Key Engin. Mater., 361-363 (2008), 277-280 2. Pulsed Laser Processing of Functionalized Polysaccharides for Controlled Release Drug Delivery Systems R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, G. Caraene, R. Albulescu, T. Buruiana and D.B. Chrisey Technological Innovations in Sensing and Detection of Chemical, Biological, Radiological Nuclear Threats and Ecological Terrorism, NATO Science for Peace and Security Series A: Chemistry and Biology, edited by A. Vaseashta, E. Braman, P. Susmann, (Springer 2011/2012) Articole in curs de publicare, cotatie ISI 1. Magnetic core/shell nanoparticle thin films deposited by MAPLE: chemical, morphological and in vitro biological assays investigations, R. Cristescu, C. Popescu, A.C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, D.E. Mihaiescu, A.M. Grumezescu, A. Andronie, I. Stamatin, V. Lazar, C. Chifiriuc, C. Saviuc, M. Popa, and D.B. Chrisey, In proof to Applied Surface Science 2011, IF = 1.795 2. Polyvinyl alcohol derivatives thin films for controlled drug delivery: MAPLE deposition and morphological, chemical and in vitro characterization, C. Popescu, R. Cristescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, M. Floarea-Spiroiu, A. Andronie, I. Stamatin, T. Buruiana and D.B. Chrisey, Submitted to Materials Science and Engineering C 2011, IF = 2.180

49

Participari la conferinte internationale 1. ADVANCED PULSED LASER TECHNOLOGIES FOR DEPOSITING NANOSTRUCTURED BIOMATERIAL LAYERS: APPLICATION TO THE DEVELOPMENT OF CaP-COATED BIOMIMETIC METAL IMPLANTS Ion N. Mihailescu, G. Socol, F. Sima, S. Grigorescu, E. Axente, C. Ristoscu, F. Miroiu, C. Cojanu, A. Popescu, A.Bigi, I.Mayer, J.Werckmann, S. P. Lyngstadaas, H. Pelletier, E.Palcevskis, D. Janackovic Oral Presentation, Advanced Laser Technologies, Brasov, Romania, 8-12 September 2006 2. OPTICAL WAVEGUIDES OF Er: YAG PREPARED BY PLD Andrei Popescu, Daniela Stanoi, Corneliu Ghica, Gabriel Socol, Camelia Cojanu, Emanuel Axente, Carmen Ristoscu, Ion N. Mihailescu, Andrea Stefan, Serban Georgescu Poster Presentation, 14-th International School on Quantum Electronics: Laser Physics and Applications, Sunny Beach, Bulgaria, 18-22 September, 2006 3. MATRIX ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION OF COMPOSITE MATERIALS FOR BIOCOMPATIBLE / BIOACTIVE IMPLANTS C. Cojanu, F. Sima, S. Grigorescu, A. Popescu, L. Zdrentu, G. Negroiu, S. Petrescu, R. Piticescu, M. Popescu, I. N. Mihailescu Poster Presentation, 14-th International School on Quantum Electronics: Laser Physics and Applications, Sunny Beach, Bulgaria, 18-22 September, 2006 4. IN VITRO AND IN VIVO RELEASE KINETICS COMPARATIVE STUDY OF BARE AND PULLULANTRIACETATE COATED VOLTAREN PELLETS COMPRESSED ACTIVE SUBSTANCE Georgeta Caraene, Mihaela Albulescu, Radu Albulescu, Andrei Albulescu, Rodica Cristescu, Camelia Cojanu Oral Presentation, International Symposium Drug Research between Information and Life Sciences Bucureti, Romania, 19 20 October 2006 5. ADVANCED LASER PROCESSING OF FUNCTIONALIZED POLYSACCHARIDES FOR CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS R. Cristescu, C. Cojanu, A. Popescu, D. Mihaiescu , G. Caraene, R. Albulescu, T. Buruiana, I. Stamatin, I.N. Mihailescu and D.B. Chrisey Oral presentation, NATO - Advanced Study Institute, Functionalized Nanoscale Materials, Devices, and Systems for chem.-bio Sensors, Photonics, and Energy Generation and Storage, Sinaia, Romania, June 4-15, 2007 6. PROCESSING OF POLY(1,3-BIS-(P-CARBOXYPHENOXY PROPANE)-CO-(SEBACIC ANHYDRIDE)20 : 80 (P(CPP : SA)20 : 80) BY MATRIX-ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION FOR DRUG DELIVERY SYSTEMS C. Cojanu, R Cristescu, A. Popescu, S. Grigorescu, C. Nastase, F. Nastase, A Doraiswamy, R.J Narayan, I Stamatin, I.N. Mihailescu, D.B Chrisey Poster presentation, EMRS 2007 Spring Meeting, Symposium P Laser Synthesis and Processing of Advanced Materials, Strasbourg, France, May 28 - June 1, 2007 7. FUNCTIONALIZED POLYETHYLENE GLYCOL DERIVATIVES THIN FILMS SYNTHESIZED BY MATRIX ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION C. Cojanu, R. Cristescu, A. Popescu, G. Socol, D. Mihaiescu, G. Caraene, R. Albulescu, T. Buruiana, I Stamatin, I.N. Mihailescu, D.B. Chrisey Poster presentation, EMRS 2007 Spring Meeting, Symposium P: Laser Synthesis and Processing of Advanced Materials, Strasbourg, France, May 28 - June 1, 2007 8. BIOCOMPATIBLE AND BIOACTIVE NANOSTRUCTURED GLASS COATINGS SYNTHESIZED BY PULSED LASER DEPOSITION A. Popescu, F. Sima, L. Duta, C. Cojanu, R. Mustata, S. Petrescu, D. Tanaskovic, D. Janackovic, I. N. Mihailescu Oral presentation E-MRS 2008 Spring Meeting, held at the Congress Center in Strasbourg (France) from May 26 to 30, 2008 9. GROWTH OF PT DOPED WO3 THIN FILMS FOR PHOTOCATALYTIC APPLICATIONS C. Cojanu, E. Gyrgy, A. Popescu, G. Sauthier, P. Miglietta, A. Perrone, L. Cultrera Poster presentation, E-MRS 2008 Spring Meeting, held at the Congress Center in Strasbourg (France) from May 26 to 30, 2008 10. UREASE IMMOBILIZATION BY LASER TECHNIQUES FOR BIO-SENSOR APPLICATIONS C. Cojanu, E. Gyrgy, F. Sima, A. Popescu, I. N. Mihailescu, D. Predoi, S. Ciuca, L. Zdrentu, S. M. Petrescu,E. Gyrgy, C. Cojanu, F. Sima, A. Popescu, I. N. Mihailescu, D. Predoi, S. Ciuca, L. Zdrentu, S. M. Petrescu Poster presentation, E-MRS 2008 Spring Meeting, held at the Congress Center in Strasbourg (France) from May 26 to 30, 2008 11. FUNCTIONALIZED POLYVINYL ALCOHOL DERIVATIVES THIN FILMS FOR CONTROLLED DRUG RELEASE AND TARGETING SYSTEMS: LASER DEPOSITION AND MORPHOLOGICAL, CHEMICAL AND IN VITRO CHARACTERIZATION C. Cojanu, R. Cristescu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, G. Caraene, A. Ionescu, D. Mihaiescu, R. Albulescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, I. N. Mihailescu, D. B. Chrisey

50

Poster presentation at E-MRS 2008 Spring Meeting, held at the Congress Center in Strasbourg (France) from May 26 to 30, 2008 12. LASER PROCESSING OF POLYETHYLENE GLYCOL BLOCK COPOLYMERS THIN FILMS C. Cojanu, R. Cristescu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, O.-S. Ionescu, D. Mihaiescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, I. N. Mihailescu, D. B. Chrisey Poster presentation at E-MRS 2008 Spring Meeting, held at the Congress Center in Strasbourg (France) from May 26 to 30, 2008 13. COMPARISON AMONG MG-BASED PHOTOCATHODES PREPARED BY NS, PS AND FS PLD FOR THE PRODUCTION OF HIGH BRIGHTNESS ELECTRON BEAMS L.Cultrera, C. Cojanu, P. Miglietta, E.L. Papadopoulou, A. Perrone, Poster presentation at E-MRS 2008 Spring Meeting, Strasbourg (France, 26-30 May, 2008) 14. BIOACTIVE AND BIOCOMPATIBLE NANOSTRUCTURED GLASS COATINGS SYNTHESIZED BY PULSED LASER DEPOSITION L. Duta, A. Popescu, F. Sima, C. Ristoscu, C. Cojanu, I. N. Mihailescu, R. Mustata, L. Sima, S. Petrescu, D. Tanaskovic, Dj. Janakovic Poster presentation at NATO-ASI Nanostructured Materials for Advanced Technological Applications, Sozopol, Bulgaria, 1-13 iunie, 2008 15. POROUS BIOPOLYMER SYNTHESIS BY MATRIX ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION FOR CONTROLLED DRUG DELIVERY APPLICATIONS A. Popescu, R. Cristescu, L. Duta, C. Cojanu, D. Mihaiescu, T. Buruiana, I. Stamatin, I. N. Mihailescu Poster presentation at NATO-ASI Nanostructured Materials for Advanced Technological Applications, Sozopol, Bulgaria, 1-13 iunie, 2008 16. FT-IR MICROSCOPY / RAMAN SPECTROMETRY STUDY OF MAPLE DEPOSED NANOFILM DEGRADATION PROCESS D. Mihaiescu, A. Ionescu, O. Ionescu, R. Cristescu, C. Cojanu, S. Buteica Poster presentation at Second International Conference on Nanostructures SElf-Assembly NANO SeA 2008, Monteporzio Catone, Rome, Italy, July 7-11 2008 17. MAPLE DEPOSED MULTILAYER NANOFILM CHARACTERIZATION AND TESTING AS CONTROLLED DRUG DELIVERY SYSTEM D. Mihaiescu, A. Ionescu, O. Ionescu, R. Cristescu, C. Cojanu, S. Buteica Poster presentation at Second International Conference on Nanostructures SElf-Assembly NANO SeA 2008, Monteporzio Catone, Rome, Italy, July 7-11 2008 18. FUNCTIONALIZED NANOSTRUCTURED THIN FILMS OF BIOPOLYMERS SYNTHESIZED BY LASER PROCESSING APPROACHES FOR DRUG DELIVERY AND FAST DIAGNOSTIC/MEDICINE APPLICATIONS R. Cristescu, C. Popescu, I.N. Mihailescu, T. Buruiana, I. Stamatin, M. Jelinek, R.J. Narayan, D.B. Chrisey, Poster presentation at 1st Intl. School on "Laser-surface interactions for new materials production: tailoring structure and properties", San Servolo Island - Venice, Italy, 13-20 July 2008 19. SYNTHESIS OF FUNCTIONALIZED POLYETHYLENEGLYCOL THIN STRUCTURES BY MATRIX ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION USABLE AS CARRYING AGENT IN DRUG DELIVERY SYSTEMS C. Popescu, R. Cristescu, A. Popescu, S. Grigorescu, L. Duta, D. Mihaiescu, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, G. Caraene, R. Albulescu, Ion N. Mihailescu, Poster presentation at 1st Intl. School on "Laser-surface interactions for new materials production: tailoring structure and properties", San Servolo Island - Venice, Italy, 13-20 July 2008 20. BIOGLASS-POLYMER THIN COATINGS OBTAINED BY PULSED LASER TECHNOLOGIES FOR A NEW GENERATION OF ORTHOPEDIC IMPLANTS F. Sima, C. Popescu, A. Popescu, C. Ristoscu, I. N. Mihailescu, R. Mustata, S. M. Petrescu Poster presentation at 15-th International School on Condensed Matter Physics, Varna, Bulgaria, 31 august 5 septembrie 2008 21. FUNCTIONAL POLYETHYLENE GLYCOL DERIVATIVES NANOSTRUCTURED THIN FILMS SYNTHESIZED BY MATRIX-ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, D. Mihaiescu, S.D. Gittard, R.J. Narayan, T. Buruiana, I. Stamatin, D.B. Chrisey Poster presentation at 6-th International Conference on Photo-Excited Processes and Applications, ICPEPA6, Sapporo, Hokkaido, Japan, 9 - 12 Septembrie 2008 22. IMPLANT-LIKE STRUCTURES METALLIC SUBSTRATE/BIOFUNCTIONAL BIOGLASSES FILMS SYNTHESIZED BY PULSED LASER DEPOSITION A. Popescu, F. Sima, L. Duta, C. Popescu, I. N. Mihailescu, R. Mustata, L.E. Sima, S.M. Petrescu, A. Ianculescu, D. Tanaskovic, D. Janackovic, Poster presentation at Advanced Laser Technologies, Siofok, Ungaria, 13 - 18 septembrie 2008 23. APPLICATION OF ADVANCED IMAGING TECHNIQUES IN MULTILAYER MAPLE DEPOSED NANOFILM CHARACTERIZATION D. Mihaiescu, A. Ionescu, O. Ionescu, R. Cristescu, C. Cojanu, S. Buteica Poster presentation at Systems Chemistry, Acquafredda di Maratea, Italy , October 3-8, 2008

51

24. NOBLE METAL DOPED TRANSITION METAL OXIDE THIN FILMS GROWN BY PULSED LASER DEPOSITION C. Popescu (Cojanu), E. Gyrgy, A. Perez del Pino, A. Popescu, E. Axente, I. N. Mihailescu Oral presentation at International Symposium on Transparent Conductive Oxides TCO Hersonission, Crete, Greece, October 22 - 26, 2008 25. BIOGLASS NANOSTRUCTURES USED AS COATINGS FOR BIOMIMETIC METALLIC IMPLANTS L. Duta, A. Popescu, C. Popescu, F. Sima, C. Ristoscu, I. N. Mihailescu, L. Sima, S. Petrescu, D. Tanaskovic, D. Janakovic Poster Presentation at International Conference on Biomaterials and Medical Devices - BiomMedD'2008, Bucharest, Romania, 13-16 Noiembrie, 2008 26. TARGETED POLYVINILALCOHOL DERIVATIVES THIN FILMS FOR SUSTAINED DRUG RELEASE SYSTEMS: LASER DEPOSITION AND MORPHOLOGICAL, CHEMICAL AND IN VITRO CHARACTERIZATION R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, M. Spiroiu, A. Andronie, I. Stamatin, T. Buruiana, D.B. Chrisey, Poster presentation at EMRS 2009 Spring Meeting, Symposium Q: Laser and Plasma Processing for Advanced Materials, Strasbourg, France, June 8-12, 2009 27. FUNCTIONALIZED PORPHYRINS IMMOBILIZATION BY MATRIX ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION TECHNIQUE FOR WARFARE AGENT DETECTION R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, A. Andronie, I. Stamatin, E. FagadarCosma, D.B. Chrisey, Poster presentation at EMRS 2009 Spring Meeting, Symposium M: Bioinspired and Biointegrated Materials as New Frontiers Nanomaterials, Strasbourg, France , June 8-12, 2009 28. PROCESSING AND IMMOBILIZATION OF ENZYME RIBONUCLEASE A THROUGH LASER IRRADIATION C. Popescu, J. Roqueta, A. Perez del Pino, M. Moussaoui, M. V. Nogus, E. Gyrgy Oral presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium B, Strasbourg, France, June 07-11, 2010 29. LASER PROCESSING OF FUNCTIONAL BIOPOLYMER DRUG CONJUGATES THIN FILMS FOR DRUG DELIVERY SYSTEMS C. Popescu, R. Cristescu, G. Socol, N. Serban, I.N. Mihailescu, S. D. Gittard, P.R. Miller, R.J. Narayan, T. Buruiana, A. Andronie, I. Stamatin, D.B. Chrisey, Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium B, Strasbourg, France, June 07-11, 2010 30. POLYVINYL ALCOHOL DERIVATIVES THIN FILMS FOR CONTROLLED DRUG DELIVERY: LASER DEPOSITION AND MORPHOLOGICAL, CHEMICAL AND IN VITRO CHARACTERIZATION C. Popescu, R. Cristescu, A.C. Popescu, I.N. Mihailescu, M. Spiroiu, A. Andronie, I. Stamatin, T. Buruiana, D.B. Chrisey Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium BStrasbourg, France, June 07-11, 2010, 31. HYBRID IRON OXIDEDEXTRAN THIN FILMS DEPOSITED BY LASER TECHNIQUES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS Camelia Popescu, Emanuel Axente, Ion N. Mihailescu, Eniko Gyorgy, M. Radu, M. C. Munteanu, A. Dinischiotu, I. Pasuk, Daniela Predoi, Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium TStrasbourg, France, June 07-11, 2010, 32. FUNCTIONALIZED GENTAMICIN- POLY(1,3-BIS-(P-CARBOXYPHENOXY PROPANE)-CO-(SEBACIC ANHYDRIDE)) 20:80 AND -POLY(D,L-LACTIDE) THIN FILMS FOR SUSTAINED DRUG RELEASE SYSTEM R. Cristescu, C. Popescu, G. Socol, A. Visan, I.N. Mihailescu, S.D. Gittard, P.R. Miller, R.J. Narayan, A. Andronie, I. Stamatin, D.B. Chrisey Poster presentation at E-MRS 2010 Spring Symposium R, Strasbourg, France, June 7-11, 2010 33. PORPHYRIN THIN FILMS: STRUCTURAL, TOPOGRAPHICAL AND ELECTROCHEMICAL INVESTIGATIONS R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, S. Iordache, A. Andronie, I. Stamatin, E. Fagadar-Cosma, D.B. Chrisey, Poster presentation at E-MRS 2010 Spring Symposium R, Strasbourg, France, June 7-11, 2010 34. BIOGLASS REINFORCED PMMA THIN COATINGS ON BIOMEDICAL TI SYNTHESIZED BY MAPLE: IN VITRO STUDIES F. Sima, A. Popescu, C. Ristoscu, C. Popescu, I.N. Mihailescu, Dj. Janackovic, R. Mustata, L.E. Sima, S.M. Petrescu, Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium B, Strasbourg, France, June 07-11, 2010 35. PULSED LASER PROCESSING OF FUNCTIONALIZED POLYSACCHARIDES FOR CONTROLLED RELEASE DRUG DELIVERY SYSTEMS Camelia Popescu, Rodica Cristescu, Andrei C. Popescu, Gabriel Socol, Ion N. Mihailescu, Georgeta Caraene, Radu Albulescu, Tinca Buruiana, Douglas B. Chrisey Poster/oral presentation at Technological Innovations in Detection and Sensing of Chem.-Bio-Radiological-Nuclear and Ecological Terrorism, NATO-ASI School, Chisinau, Moldavia, June 07-17, 2010

52

36. MAGNETIC NANOFLUID THIN FILMS SYNTHESISED BY MAPLE: CHEMICAL, MORPHOLOGICAL AND IN VITRO BIOLOGICAL ASSAYS INVESTIGATIONS R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, E. Axente, I.N. Mihailescu, D. Mihaiescu, A. M. Grumezescu, A. Andronie, I. Stamatin, V. Lazar, C. Chifiriuc, C. Saviuc, M. Popa, D.B. Chrisey Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium J, Strasbourg, France, May 09-13, 2011 37. ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF FLAVONOID-BIOPOLYMER ANTIBIOTIC THIN FILMS SYNTHESIZED BY ADVANCED PULSED LASER METHODS R. Cristescu, C. Popescu, G. Socol, I.N. Mihailescu, P.R. Miller, R. D. Boehm, R.J. Narayan, A. Andronie, I. Stamatin, D.B. Chrisey Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium P, Strasbourg, France, May 09-13, 2011 38. BIOMOLECULAR RECOGNITION OF SACCHARIDES BY NOVEL NANOSTRUCTURED PORPHYRIN CONJUGATE THIN FILMS DEPOSITED BY MAPLE R. Cristescu, C. Popescu, A. Popescu, S. Grigorescu, I.N. Mihailescu, A.A. Ciucu, S. Iordache, A. Andronie, I. Stamatin, E. Fagadar-Cosma, D.B. Chrisey Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium P, Strasbourg, France, May 09-13, 2011 39. LASER IMMOBILIZATION OF ACTIVE PROTEINS ON CALCIUM HYDROXYAPATITE LAYERS FOR ANTIMICROBIAL THERAPIES AND REGENERATIVE MEDICINE E. Gyorgy, E. Axente, M. Motoc, C. Popescu, A. Perez del Pino, I. N. Mihailescu, L. Sima, S. M. Petrescu Poster presentation at E-MRS Spring Meeting, Symposium K, Strasbourg, France, May 09-13, 2011

Participari la conferinte nationale 1. "NANOCRYSTALLINE Er:YAG THIN FILMS PREPARED BY PULSED LASER DEPOSITION FOR WAVEGUIDE AMPLIFIERS APPLICATIONS" Daniela Stanoi, Andrei Popescu, Corneliu Ghica, Gabriel Socol, Camelia Cojanu, Emanuel Axente, Carmen Ristoscu, Ion N Mihailescu, Andrea Stefan, Serban Georgescu Poster Presentation, ROMOPTO 2006, Sibiu , August 28 - 31, 2006 2. MATRIX ASSISTED PULSED LASER EVAPORATION OF BLOOD PROTEINS FOR FAST DIAGNOSTIC, C. Cojanu, R. Cristescu, A. Popescu, T. Kocourek, A. Moldovan, L. Stamatin, D. Mihaiescu, M. Jelinek, I. Stamatin, I.N. Mihailescu, D.B. Chrisey Oral presentation, Simpozionul Micro- Nano Interacii i Sisteme pe baz de polimeri naturali i sintetici, Ediia a V-a, Iai, 29 Septembrie 2006 3. FILME NANOSTRUCTURATE DE BIOPOLIMERI OBINUTE PRIN METODA MAPLE PENTRU APLICAII N INDUSTRIA FARMACEUTIC C. Cojanu, R. Cristescu, A. Popescu, L. Duta, I.N. Mihailescu, G. Caraene, R. Albulescu, T. Buruiana, I. Stamatin Oral presentation, Simpozionul Micro- Nano Interacii i Sisteme pe baz de polimeri naturali i sintetici, Ediia a VI-a, Iai, 28 Septembrie 2007 4. METODA DEPUNERII LASER PULSAT ASISTAT DE O MATRICE PENTRU DEPUNEREA FILMELOR DE POLIMERI HIDROSOLUBILI PENTRU APLICAII AVANSATE, R. Cristescu, G. Socol, T. Buruiana, G. C. Chitanu, R. Piticescu, F. Miroiu, C. Popescu, A. Ghita, L. Duta, Ion N. Mihailescu Seminar presentation, Simpozion: Polimeri hidrosolubili pentru aplicatii avansate, April 14 17, 2008, Iasi, Romania

Referent la Journalul Molecular BioSystems, IF 3,825 Stagii in strainatate i burse obinute 01 Octombrie 2003 31 Iulie 2004, un an academic in Pisa (Universita di Pisa, Dipartimento di Fisica), bursa Erasmus 26 Octombrie 30 Noiembrie 2005, cursuri European School of Medical Physics, Archamps, France, finaliyate cu diploma 18 22 Septembrie 2006, 14-th International School on Quantum Electronics: Laser Physics and Applications, Sunny Beach, Bulgaria

53

14 Octombrie 14 Noiembrie 2007, stagiu de lucru la University of Lecce, Physics Department, Italy 21 Noiembrie 11 Decembrie 2007, stagiu de lucru la Foundation for Research and Technology Hellas, Institute of Electronic Structure and Laser (FORTH-IESL), Heraklion Crete, Greece 16 23 Mai 2008, stagiu de lucru la Institute of Physics, Prague, Czech Republic 13 20 Iulie 2008, participare la 1st International School on Laser-surface interactions for new materials production: tailoring structure and properties, Isola di San Servolo, Venezia Italy 1 9 Octombrie 2008, stagiu de lucru la Institute of Chemistry & Theoretical Physics, Athens, Greece 2 16 Martie 2009, stagiu de lucru la Centre d'Investigacions en Nanocincia i Nanotecnologia (CIN2), Barcelona, Spain 16 31 Iulie 2009, stagiu de lucru la Centre d'Investigacions en Nanocincia i Nanotecnologia (CIN2), Barcelona, Spain 19 23 Octombrie 2009, stagiu de lucru la the University of Nicosia, Cyprus 7 17 Iunie 2009, participare la Technological Innovations in Detection and Sensing of Chem.-Bio-RadiologicalNuclear and Ecological Terrorism, NATO-ASI School, Chisinau, Moldova 7 13 Noiembrie 2010, stagiu de lucru la the University of Marmara, Istanbul, Turkey 2007 - 2010 National Fellowship for PhD Funding, Financed by National Univerity Research Council (CNCSIS)

Hirsch index: 3 Numarul total de citari: 25

54