Sunteți pe pagina 1din 100

Enzimele utilizate n biologia molecular Enzimele de restricie fac posibil manipularea secvenelor acizilor nucleici.

. Noi enzime de restricie au fost identificate, purificate i clonate. Acestea particip la fenomenul de restricie (tiere ADN), adic un sistem de aprare al bacteriilor fa de bacteriofagi (ce const prin fragmentarea ADN-ului viral). Unele tulpini sau sue bacteriene conin enzime din familia endonucleaze i decupeaz ADN viral la nivelul secvenei recunoscut specific.

Bacteriofag

Ca urmare ADN-ul su va fi secionat n fragmente n care exist situsuri specifice genomului fagic. De ce ADN bacterian nu este distrus de aceste enzime ale bacteriofagului? Exist 2 posibiliti: fie ADN bacterian nu conine secvene recunoscute de enzime virale , fie ADN bacterian este metilat la nivelul resturilor de A sau C de ctre metilaza bacterian ceea ce determin nerecunoaterea acestor secvene metilate de ctre enzimele de restricie ale bacteriofagului. Numele de restricie vine de la faptul c exist o restricie a infeciei fagilor fa de anumite sue bacteriene care sintetizeaz endonucleaze. Numele enzimei de restricie provine de la numele genului i speciei de la care au fost izolate. Se disting 3 grupe de enzime de restricie: I, II i III.

Enzime de restrictie de tipul I cu activitate a nucleazei si metilazei intr-o singura enzima. Ele se unesc 4-6pb ale ADN-ului gazdaspecific, fiind separate de 6-8pb si continand adenine metilate. Zona de secionare a ADN poate fi realizata la o distanta de 1000 bp (perechi de baze) de locatia alipirii enzimei. Un exemplu este enzima EcoK intalnit la E.coli K12. Aceasta recunoaste locatia: 5- A C N N N N N N G T G C T G N N N N N N C A C G 5 unde N reprezinta nucleotidele nonspecifice iar rezidurile de adenina (A) sunt metilate.

Tipul III
Tipul III de enzime de restrictie se aseamana cu cele de Tip I in capacitatea lor de a metilan si de a restrictiona (de a taia) ADN-ul. Asemenea tipului I, acestea sunt enzime complexe cu doua subunitati. Locatiile de recunoastere ale acestor enzime sunt asimetrice iar clivajul substratului de ADN apare de la perechile de baze 24 26 spre capatul 3. Un exemplu al tipului III de enzime este HINFIII al H. influenzae. Recunoaste locatiile: 5 - C G A A T G C T T A 5 unde metilarea adeninei apare doar pe o catena.

Enzimele de restrictie de tip II


Enzimele de restrictie de tip II sunt cele mai folosite in condiii de laborator. Acestea nu detin activitatea de metilare in aceeasi celula cu activitatea nucleazei. Ele se unesc ca dimeri simpli cu locatiile de recunoastere a ADN-ului. Aceste locatii sunt de natura palindromica, insemnand ca pot fi citite la fel de la 5 la 3 pe ambele catene ale ADN-ului Enzimele de restrictie tip II cliveaza ADN-ul in locatiile de interactiune, producand fragmente de dimensiuni previzibile. Tipul II de enzime de restrictie a fost identificat in aproape toate procariotele, dar nici una nu a fost identificata pana acum la eucariote. Specificitatea actiunilor lor si sutele de enzime disponibile ce recunosc numeroase locatii sunt factori cheie in abilitatea de efectua recombinari de ADN in vitro.

palindrom

Taierea ADN-ului la secvente specifice sta la baza multor proceduri in tehnologia moleculara, inclusiv cartografierea, clonarea, ingineria genetica si analiza mutatiilor. Enzimele de restricite sunt folosite frecvent in laboratorul clinic, spre exemplu in analiza rearanjarii/redispunerii genelor si in detectarea mutatiilor. Desi toate enzimele de restrictie tip II functioneaza prin simetria bilaterala, modelul lor bicatenar se desface diferit.

Unele enzime desfac structura duplex printr-o separare esalonata la nivelul punctelor de recunoastere, lasand 2-4 baze suspendate la capetele lanturilor ADN.

Capetele monocatenare pot hibridiza cu capetele complementare ale altor fragmente de ADN, directionand alaturarea eficienta ale capetelor desprinse. Datorita abilitatii lor de a forma punti de hidrogen cu capetele suspendate complementare, aceste fragmente producand capete lipicioase/adezive la nivelul sectiunii.

Enzime tip II

Hae III
HaeIII is a restriction enzyme that searches the DNA molecule until it finds this sequence of four nitrogen bases.

5 TGACGGGTTCGAGGCCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5

Once the recognition site is found Hae III will cleave the DNA at that site

5 TGACGGGTTCGAGGCCAG 3 3 ACTGCCCAAGGTCCGGTC 5

Examples
Eco RI
GGCCTGCGAATTCCCGATCGAAGGCCCGAATTCTGGCCA CCGGACGCTTAAGGGCTAGCTTCCGGGCTTAAGACCGGT
AATTCTGGCCA GACCGGT

GGCCTGCG AATTCCCGATCGAAGGCCCG CCGGACGCTTAA GGGCTAGCTTCCGGGCTTAA

Hae III
GG CC

GGCCTGCGAATTCCCGATCGAAGGCCCGAATTCTGGCCA CCGGACGCTTAAGGGCTAGCTTCCGGGCTTAAGACCGGT

CCTGCGAATTCCCGATCGAAGG GGACGCTTAAGGGCTAGCTTCC

CCCGAATTCTGG GGGCTTAAGACC

CCA GGT

These cuts produce blunt ends


5 TGACGGGTTCGAGG 3 ACTGCCCAAGGTCC CCAG 3 GGTC 5

The names for restriction enzymes come from:


the type of bacteria in which the enzyme is found the order in which the restriction enzyme was identified and isolated.

EcoRI for example


R strain of E.coli bacteria I as it is was the first E. coli restriction enzyme to be discovered.

blunt ends and sticky ends


Hae III produced a blunt end? EcoRI makes a staggered cut and produces a sticky end 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 G AATTC 3 3 CTTAA G 5

blunt end

sticky end

More examples of restriction sites of restriction enzymes with their cut sites Hind III: 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5

Bam HI: 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 Alu I: 5 AGCT 3 3 TCGA 5

Unele enzime de restricie prefera ADN monocatenar altele preferandu-l pe cel bicatenar. Endonucleazele repararatoare functioneaza in zonele de denaturare ale ADN-ului, cum ar fi portiunile fara baze (apurinice si apirimidinice), zone cu dimeri de timina sau cu baze nepotrivite.

ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenelor de ADN i au rol n replicare i n reparaia ADN. Ele necesit o matrice fa de care se sintetizeaz secvena complementar. Este necesar iniierea reaciei de ctre o amors, prin intermediul creia ADN polimeraza realizeaz elongaia prin adiia de precursori trinucleotidici dNTP. ADN polimeraza are afinitate fa de matricea de ADN dar este capabil s copie lanuri de ADN cu o eficacitate mai slab .

Enzimele particulare utilizate sunt: ADN pol I specific E. coli i fragmentul Klenow, ADN polimeraza fagilor T7 i T4 i ADN pol. termostabile.
Transferaza terminal poate fi considerat o ADN pol. particular. Aceast enzim nu copie matricea dar adiioneaz nucleotide la extremitatea 3' a lanului de ADN.

ADN polimeraza catalizeaz 3 tipuri de reacii: -activitatea de ADNpol propriu-zis necesit matrice ADN care este copiat prin extensie unei amorse. Polimeraza ncorporeaz nucleotide ncepnd la nivelul 3'OH a amorsei. -activitate exonucleazei 3'-5' in vitro este o activitate de restricie care are ca scop eliminarea tuturor bazelor adugate eronat n cursul sintezei lanului de ADN.

Eliminarea bazelor eronate este urmat de ncorporarea bazei corecte cu ajutorul ADN polimerazei. Aceast activitate se exercit pe ADN simplu sau dublu catenar. - activitatea exonucleazei 5'-3', enzimele elimin nucleotidele de la 5' a ADN dublu catenar.

Aceast activitate este utilizat n tehnica de marcaj prin translaia seciunii.

ADN polimeraza I Aceast enzim a fost purificat la nceput din culturi bacteriene ale E. coli, exercit o activitate de ADN polimeraz, astfel c are dou activiti de exonucleaze. Activitatea exonucleazic 5'-3' a ADN pol I poate fi exercitat pe un hibrid ARN/ADN , ea este rezultatul deci a unei activiti de RNaz H intrinsec care const n eliminarea unui lan de ARN prin activitatea exonucleazei 5'-3'.

Aceast proprietate a fost exploatat n reacia de revertranscripie pentru eliberarea primului lan de ADN sintetizat i va permite sinteza unuia secundar. El va avea rol de amors necesar i la sinteza celui de-al doilea lan complementar.

La ora actual sunt i alte enzime utilizate pentru efectuarea de reacii de reverstranscripie. n activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol I are loc eliminarea unui grup fosfat n 5', care duce la imposibilitatea reaciei de elongaie. n consecin domeniul de aplicaie al acestei enzime este de a limita marcajul sondei prin translaia seciunii, aplicaie n care ea este utilizat n strns legtur cu DNaza I.

Fragmentul Klenow se realizeaz printr-o proteoliz limitat a ADNpol I de la E.coli, enzim monomeric care genereaz dou fragmente, foarte mari.

Ele au pierdut activitatea exonucleazic 5'-3' dar conserv activitatea exonucleazic 3'-5' i cea de ADNpolimeraz.

Aplicaiile fragmentului Klenow:


secvenierea dup metoda Sanger sinteza unui lan de ADN complementar marcare izotopic (32PdNTP) a extremitii 3' a ADN prin reacia de schimbare a nucleotidelor reci contra nucleotidelor marcate, catalizat prin activitate exonucleazic.

ADN polimeraza bacteriofagului T4 i T7 catalizeaz transferul fosforului radioactiv 32P pe ATP. Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia grupare a fosfatului de pe extremitatea 5 a fragmentului de ADN. Tehnica este aplicat pentru obinerea oligonucleotidelor marcate care vor fi utilizate ca sonde pentru criblajul bncilor.

T4 ADN polimeraza Aceast enzim a fost izolat la nceput din bacterioagul T4. ADN pol T4 i are o activitate exonucleazic 3'-5' foarte eficace pe ADN monocatenar i este de 200 de ori mai activ dect fragmentului Klenow de la E.coli

T7 ADN polimeraza Aceast enzim a fost obinut prin izolarea ei de la bacteriofagul T7, dup infecia bacteriei E.coli cu fagul. Este caracterizat prin eficacitate de sintez, replicarea rapid a fagului n cursul ciclului de infecie. Ea posed n acelai timp o activitate exonucleazic 3'-5' puternic exprimat, de aproximativ de 1000 de ori mai mare dect a fragmentului Klenow. Aceast activitate important exonucleazic explic fidelitatea mare a T7 ADN pol. Aplicaii principale: marcarea ADN n 3' mutageneza dirijat

T7 ADN pol modificat: secvenoza Tratamentul chimic al T7 ADNpol modific enzima diminund considerabil activitatea exonucleazic. Enzimele obinute secvenoza 1.0 i 2.0 sunt utilizate n reaciile de secveniere de bun calitate.

Taq ADNpol a fost izolat din Thermus aquaticus. Prezint particularitatea de a se dezvolta n izvoare calde la 80C. Este supus la temperaturi extreme. Este o pol dependent ADN. Posed de asemenea activitate exonucleazic 5'-3' dar este lipsit de funcii corectoare. Temperatura optim de funcionare de 70-75C. Originea sa i confer o stabilitate remarcabil la temperaturi nalte. Timpul de njumtire este mai mare de dou ore la 92C i de 40 minute la 95C.

Heat-stable DNA polymerase


Taq DNA polymerase was isolated from the bacterium Thermus aquaticus. Taq polymerase is stable at the high temperatures (~95oC) used for denaturing DNA.

Hot springs at Yellowstone National Park, Wyoming.

PCR

Aceast termorezisten st la baza utilizrii sale n metode de amplificare genic precum PCR n timpul crora se efectueaz numeroase cicluri termice care presupun temperaturi de 9095C. Alt avantaj hibridarea amorselor cu matricea se face la o temperatur mai mare ceea ce determin hibridarea specific. Sensibilitate tehnicii este mare. Aceast enzim a fost clonat. Un anumit numr de ADN pol termostabile au fost extrase din alte bacterii Archebacterii i Eubacterii. Fiecare are o particularitate i o utilizare specific.

Revertranscriptaza Aceast enzim transcrie ARNm n ADNc. RT permite remontarea fluxului gen, ARN, proteine i sinteza secvenei complementare unui ARN numit ADNc efectund aciune invers a transcripiei. Exist trei posibiliti: ncepnd de la amors sau primer specific

ncepnd de la oligo dT care permite activarea RT de la coada poliA a unui ARNm

ncepnd de la amorse aleatorii numite hexanucelotide . RT este o ADN polimeraz ARN dependent. Aceast enzim transform ARN n ADNul su complementar i poate sintetiza lan compelmentar ADN nou sintetizat (se obine un ADN dublu catenar).

Morfologie i structur virusului HIV


Virion de form sferic, diametru de 100nm, acoperit de o anvelop prevzut cu spiculi. Genomul este ARN monocatenar, compus din 3 gene gag, pol,env. gag-codifica proteinele capsidale pol- codifica enzimele virale env- codifica proteinele anvelopei Reverstranscriptaza este o enzim caracteristic retrovirusurilor

ARN polimeraza T7 ARNpol este produs de bacteriofagul T7, are o specificitate crescut pentru situsul promotor al fagului T7 de iniiere a transcripiei. Este foarte utilizat pentru sinteza 5'-3' in vitro a ARN obinnd sonde ARN i poate fi utilizat pentru secvenierea ADN clonat ntrun vector care conine secvena promotoare T7. Aplicaii: sinteza ARN pornind de la ADN pentru obinerea de sonde. SP6 ARNpolimeraza Spre deosebire de cealalt enzim aceasta este produs de SP6 , cu afinitate foarte mare pentru secvena situsului promotor SP6. Este utilizat pentru sinteza sondelor ARN.

T3 ARNpolimeraza Este ADN dependent avnd o mare afinitate pentru secvena promotorului bacteriofag T3, transcrie ADN n ARN de la 5' la 3'. Aplicaii identice cu T7 ARNpolimeraza. QB replicaza este ARN dependent in vitro avnd funcia de replicare a ADN genomic al fagului QB. Ea identific ADN de replicat pe baza structurii secundare. Enzime de modificare Fosfataza alcalin catalizeaz hidroliza gruprii 5' PO4 a ADN i ARN elibernd un rest fosfat i crend o extremitate 5'OH. Aplicaii: prevenirea legrii vectorilor de clonaj pe ei nsi eliminnd posibilitatea de formare a legturilor fosfodiester; eliminarea gruprii 5'PO4 nainte de marcajul acizilor nucleici prin T4 polinucleotid kinaza.

Aceast enzim este foarte des utilizat ca generator de semnal de unde natura dependent de substratul utilizat n sisteme de detecie a acizilor nucleici. Polinucleotidkinaza catalizeaz transferul unei grupe gama fosfat de la un ATP la extremitatea 5'OH a unui ADN sau a ARN. ADN nativ fosfatat n 5' este adesea necesar s fie tratat n prealabil cu fosfataz. Aplicaii: marcarea unei sonde ADN sau ARN n 5' terminal; marcarea unei amorse utilizate pentru secvena markerilor radioactivi utiliznd gamma 32P, gamma 33P i gamma 35S.

ADN ligaza asigur formarea legturilor fosfodiester ntre deoxiriboz 3'OH i 5'PO4 a dou nucleotide adiacente. Permite legarea sau lipirea a dou ADN dublu catenare. Are ntr-un fel activitate invers enzimelor de restricie. Aplicaii: subclonarea produilor de amplificare n vectori. Exist T4 ADN ligaz care leag extremitatea 5'PO4 a unui ADN sau ARN monocatenar cu extremitatea 3'OH.

Nucleazele sunt enzime care ataca acizii nucleici fie de la extremitatea 5' sau 3' numite i exonucleaze, fie din interior sau endonucleaze. ARNaza sau RNaze sunt endonucleaze care hidrolizeaz puntea fosfodiesteric de ARN: A, T1 i H. - RNaza A extras din pancreasul de bovine distruge ARN monocatenar ndeosebi dup resturile C i U. Hibrizii ADN-ARN i ARN dublu catenar sunt rezisteni.

Inhibitorii de RNaz Inhib activitatea RNazelor i mpiedic distrugerea ARN de ctre acestea. Aplicaii: protejeaz ARNm n cursul RT; crete randamentul sintezei sondelor de ARN cu ajutorul ARN polimerazelor; toate aplicaiile n care exist riscul de degradare a ARN de ctre RNaz Proteinaza K, enzim utilizat de extracia acizilor nucleici. Diger celule ntregi, nucleul chiar esuturi fcnd astfel accesibil ADN i ARN. Este stabil la 40-60Ci eficace n prezena detergenilor, dintre care cel mai bun este SDS anionic.

Ali detergeni neionici pot fi utilizai Non I, P40 i TWIN20. Ea i pierde activitatea proteazic la temperatua de 90C. Aplicaii: extracia acizilor nucleici. Agaraza permite eliberarea acizilor nucleici dintr-un gel de agaroz. Diger agaroza, dar nu distruge acizii nucleici. Este un mijloc de extragere a ADN din agaroz.

Extracie i purificarea ADN Extracia ADN Comport:recoltarea i pstrarea probelor i extracia propriu-zis Probele ADN trebuie potejate de: inhibitori ai enzimelor utilizate (inhibitori ai Taq polimeraz), nucleaze care pot degrada acizii nucleici (ARN este n special sensibil). Frecvent sunt probe totale de snge ele pot fi separate n plasma , ser i leucocite. Alte medii curent folosite sunt din:culturi (fagi, bacterii), urin, lichid cefalorahidian, expectoraii, probe rezultate prin puncionare i biopsie. Condiii de prelevare Probele trebuiesc recoltate steril.

O prob de snge poate fi colectat n tub uscat dac cercetrile obinute se realizeaz din ser sau pe EDTA dac se lucreaz pe plasm. Este recomandat lizarea globulelor roii nainte de extracia ADN ( de exemplu liza cu clorur de amoniu) apoi purificarea globulelor albe. Dac se utilizeaz un anticoagulant trebuie s inem cont de natura sa. Heparina este un inhibitor pentru Taq polimeraz mai mult sau mai puin dificil de eliminat dup procesul de extracie utilizat. esuturile sunt bogate n nucleaze (proteaze, DNaze i RNaze). n cazul LCR este recomandat pstrarea la frigider, imediat dup recoltare. Este cunoscut faptul c LCR i urina sunt medii bogate n inhibitori.

ARN este o molecul fragil, foarte sensibil la RN azele care sunt frecvente n mediu pn i pe degete. n cazul studiilor de ARN probele sau fraciunile lor trebuiesc congelate la -80C n primele 3 ore dup recoltare. Probele pot fi expediate n ghea carbonic. n timpul manipulrii este indispensabil s evitm contaminarea probei i ARN s fie conservat (este fragil). Se recomand: purtarea mnuilor, autoclavarea materialelor, utilizarea de pipete special rezervate acestui scop la capete cu filtre sterile.

n funcie de tipul ADN-ului se cunosc 2 tehnici de extracie pentru tipul genomic i pentru cel plasmidic. Extracia ADN cromozomial sau genomic Metoda fenol cloroform Extracia ADN din snge total este cea mai utilizat. Parcurge 3 etape: -liza celulelor i denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul intracelular -extracia propriu-zis pentru eliminarea proteinelor -precipitarea pentru purificarea ADN

Obinerea fraciunii de extras n practic ADN situat n celulele nucleate se recupereaz centrifugnd leucocitele pe baza gradientului de densitate. Se poate centrifuga tubul la vitez joas i se recolteaz de la interfa dintre plasm i coagulul de globule roii. Dup splare cu soluie tampon proba este gata de extracie.

Se poate apela la centrifugarea in gradient de densitate i la liza diferentiala. Pentru centrifugarea n gradient, sange complet sau maduva osoasa mixate cu solutie izotonica salina sunt poleite cu Ficoll. Ficolul este un polimer de sucroza extrem de ramificat ce nu penetreaza membranele biologice. Odata centrifugate, celulele albe mononucleare se stabilesc intr-un strat in gradientul Ficoll ce este dedesubtul componentelor plasmatice mai putin dense si deasupra celulelor polimorfonucleate si a celulelor rosii (RBCs). Stratul continand celulele mononucleare este eliminat din fiola si spalat cel putin de doua ori si centrifugat in solutie salina inaintea de a incepe procedura de izolare a acidului nucleic.

O alta metoda folosita in izolarea celulelor nucleate profita de diferentele in fragilitatea osmotica a RBC si WBC. Incubarea sangelui sau a maduvei in solutie tampon hipotonica sau apa va duce la liza hematiilor inaintea leucocitelor. Dup centrifugare membranele celulelor rosii se desprid iar hemoglobina se afl in din solutie.

n cazul mycobateriilor eliberarea acizilor nucleici necesit un tratament mai drastic pe baz de ultrasunete sau asociate cu sod caustic i nclzire, sau adugnd detergeni SDS i proteinaza K. Este indispensabil spargerea peretelui mycobacterian care este foarte rezistent.

Liza celulelor i denaturarea complexelor nucleoproteice pentru eliberarea ADN din mediul intracelular Un sistem utilizat curent adaptat la toate tipurile de probe este amestecul detergent/proteinaz care disociaz esuturile, celulele, capsida virusurilor i eliberaaz acizii nucleici. Proteinaza K, enzim utilizat pentru extracia acizilor nucleici. Diger celule ntregi, nucleul chiar esuturi fcnd astfel accesibil ADN i ARN. Este stabil la 40-60Ci eficace n prezena detergenilor, dintre care cel mai bun este SDS (dodecylsulfat de sodiu) anionic. Ea i pierde activitatea proteazic la temperatua de 90C.

Alte enzime utilizate sunt lizozimul sau zimolaza, ce digera polimerii peretelui celular sunt disponibile in comert. Alternativ, peretii celulari pot fi distrusi mecanic prin macinare sau prin mixarea puternica cu cioburi de sticla. Metodele enzimatice mai fine sunt putin eficiente Tratamentul cu detergent (1% sodium dodecil sulfat) si o baza puternica (tare) (0.2 M NaOH) in prezenta bazei Tris, acid etilendiamintetracetic (EDTA) si glucoza pot de asemenea sa distruga peretele celular al bacteriilor.

Fierberea in 8% sucroza, 8% detergent Triton X-100, tampon Tris si EDTA dupa tratarea cu lizozim, determin eliberarea ADN ce poate fi imediat precipitat in alcool. ADN-ul extras cu NaOH sau prin procedurile de fierbere, este denaturat (monocatenar) si este posibil sa nu fie potrivit pentru metode care folosesc enzimele de restrictie ce necesita ADN bicatenar. Avantajul acestor tipuri de extractie este viteza si simplicitatea. Metodele de amplificare vor functiona folosind acest tip de izolare a ADN-

Extracia propriu-zis
Dupa eliberarea ADN-ului din celula, purificarile ulterioare necesita eliminarea proteinelor, lipidelor, carbohidratilor si resturilor celulare. Acest lucru este realizat folosind o combinatie de salinitate mare, pH scazut si o mixtura organica de fenol si cloroform. Combinatia dizolva usor contaminantii hidrofobici ca lipidele si lipoproteinele, colecteaza resturile celulare si elimina cele mai multe proteine ADN-asociate.

Izolarea cantitatilor mici de ADN din probele vizate ca fungii poate fi facilitata prin pretratamentul cu bromura cetiltrimetilamonium, un detergent cationic ce separa eficient ADN-ul de contaminarea cu polizaharide. Pentru a evita contaminarea cu ARN, ARNazele pot fi adaugate la un moment dat. Alternativ, ARNazele pot fi adaugate deasemenea in ADN-ul resuspendat la sfarsitul procedurii.

Cand sunt adaugate fenol si cloroform din lizatul celular hidrofilic, se formeaza o emulsie bifazica. Centrifugarea va favoriza aezarea stratului hidrofobic (lipidele si alte componente hidrofobice) la baza si stratul hidrofilic deasupra. ADN-ul se va dizolva in etapele apoase superioare. Componentele amfifilice ce au atat proprietati hidrofobice si hidrofilice ca si resturile celulare, se vor aduna formand un precipitat alb la interfata dintre cele doua straturi. Etapa superioara, contine ADN colectat ce apoi este precipitat folosind etanol sau isopropanol intro concentratie mare de sare (amoniu, potasiu sau acetat de sodiu, litiu sau clorura de sodiu).

Isopropanolul este adaugat in solutia etapei superioare in raport 2:1 sau 1:1 iar ADN-ul formeaza un precipitat solid n urma centrifugrii. Sarea in exces este indepartata prin clatirea peletelor in etanol 70%, centrifugare si aruncarea supernatantului de etanol, apoi dizolvarea peletelor de ADN in solution tampon de rehidratare, de obicei 10 mM Tris, 1 mM EDTA (TE) sau apa. Izopropanolul este mai putin volatil decat etanolul si precipita ADN-ul la temperatura camerei. Aceasta metoda reduce coprecipitarea sarii. Deasemenea, comparat cu etanolul, izopropanolul este adaugat in cantitati mai mici; prin urmare izopropanolul poate fi mai practic pentru probele

Extracia ADN plasmidic n cercetare plasmidele sunt utilizate pentru inserarea unor secvene care sunt multiplicate concomitent n celule gazd (E.coli). Extracia are ca scop separarea ADN plasmidic de cel al celulei gazd. Tehnica cea mai frecvent include o etap de liz alcalin n prezena de SDS n care cele dou tipuri de acizi nucleici sunt denaturai. pH neutralizat rapid face ca ADN plasmidic s fie solubil iar cel cromozomial se transform n agregat insolubil incluznd i proteine denaturate i SDS precipitat.

Liza alcalina poate fi folosita pentru a selecta specific ADN-ul plasmidial deoarece ADN-ul cromozomial nu va renatura corect odata neutralizat si precipitat. ADN-ul cromozomial denaturat si proteinele pot fi indepartate prin centrifugare iar supernatantul va contine ADN-ul plasmidic. Dup centrifugare ADN plasmidic coninut n supernatant, este precipitat cu etanol i depozitul dup centrifugare este eluat cu TE sau ap steril. Exist numeroase variante. Utilizarea de cuar, rini, ageni haotropici i kituri pe baza acestor procedee. Tehnica fenol/cloroform este adaptat extraciei ADN plasmidelor.

Extracia ARN Eliberarea ribonucleazelor RNazele sunt ubicvitare i dificil de inactivat, deoarece spre deosebire de ADNaze funcionarea lor nu necesit cofactori. Cand tesutul este disociat, proba ar trebui sa fie pastrata in azot lichid sau scufundata in solutie tampon ce va inactiva ARNazele intracelulare. Acest lucru este valabil in mod special pentru tesuturi ca pancreasul, ce contine cantitati mari de ARNaze. ARN-ul bacterian si cel fungic sunt deasemenea izolate prin liza chimica sau prin maruntirea in azot lichid.

ARN-ul viral poate fi izolat direct din ser sau alte fluide prin intermediul sferelor sau coloanelor special formate.
Ca majoritatea metodelor de izolare a ADN-ului, nu se poate face diferenta intre ARNul microorganismelor si cel al celulei gazda, prin urmare folosirea unui preparat fara celule fiind cea mai potrivita.

Etapa de liza celulara din izolarea ARN-ului este realizata in detergent sau fenol in prezenta unei solutii puternic saline (0.2 0.5 M NaCl) sau a inhibitorilor de ARNaze. Tiocianatul de guanidina este un puternic agent denaturant al ARNazelor si poate fi folosit in locul solutiilor puternic saline. Agentii puternic reducatori ca 2-mercaptoetanolul pot fi adaugati deasemenea in timpul acestui pas. Odata ce celulele au fost lizate, proteinele pot fi extrase cu fenol. Solutiile acid fenol (ph 4-5): cloroform:isoamil alcool (25:2:1) extrag eficient ARN-ul.

Cloroformul imbunatateste extractia acidului nucleic prin denaturarea proteinelor si promovarea fazei de separare. Izopropanolul previne spumarea. Dupa separarea fazelor, faza superioara apoasa cu un continut de ARN, este indepartata si pusa intr-un tub curat, apoi ARN-ul este precipitat prin adaugarea a doua volume de etanol sau un volum de isopopanol.

Glicogenul sau ARN de transfer al drojdiilor (yeast-trasnfer ARN) pot fi adaugate in aceasta etapa ca si vectori ce ajuta la formarea peletelor de ARN. Precipitatul de ARN este spalat apoi in 70% etanol si resuspendat in solutie buffer RNF sau apa. Separarea in starea solida a ARN-ului incepe cu etape similare ca cele descrise mai sus pentru extractia organica. Conditiile puternice de denaturare trebuie ajustate inainte de aplicarea lizatului in coloane.

In unele proceduri, etanolul este adaugat in acest stadiu. Unele sisteme dau o coloana filtru ce elimina particulele inainte aplicarii la coloana absorbanta. Ca si in cazul ADN-ului, reactivi comerciali sunt adaugati impreuna cu coloanele in scopul optimizarii absorbtiei ARN si spalarea in matricea bazata pe siliciu. Lizatul este aplicat intr-o coloana in solutie tampon puternic salina iar ARN-ul absorbit este spalat cu solutii tampon speciale.

ADNaze pot fi adaugate direct in ARN-ul absorbit din coloana pentru a indeparta ADNul contaminant. Solutiile de spalare si eluantul pot fi atrase prin coloana, de catre gravitate, vid sau forta centrifuga. Coloane mici de material silica-based ce se potrivesc inauntrul microtuburilor sunt folosite pe scara larga pentru izolarea de rutina a acidului nucleic din toate tipurile de specimene.

ARN-ul extras este deobicei suficient ca si concentratie si puritate pentru folosirea in cele mai multe aplicatii. In general, 1 milion de celule eucariotice din 10-50 mg de tesut vor produce aproximativ 10 micrograme de ARN. Producerea de ARN din fluide biologice depinde de concentratia microorganismelor sau alte molecule tinta prezente in specimen.

Extractia organica a ARN-ului total

Izolarea ARN-ului pe matrice solida

Izolarea ARN-ului polyA (mesager) aproximativ 80-90% din ARN este rARN. De multe ori ARN-ul necesar analizelor este mARN, insemnand numai 2.5 5% din productia de ARN total. Majoritatea mARN-ului consta in mARN din genele puternic exprimante. Prin urmare, exemplarele rare sau unice de mARN reprezinta o mica parte din izolarea ARNului total. Pentru cresterea productivitatii de mARN, in special transcrierile rare, protocoale ce includ oligomeri ai timinei si uracilului imobilizati in coloanele sau sferele matricii de rasina, sunt adesea folosite. Oligomerii polyT sau polyU se vor lega de coada polyA regasita exclusiv in mARN.

Dupa spalarea ARN-ului rezidual, ARN-ul polyA este developat prin spalarea coloanei cu solutie tampon calduta, slab salina ce contine detergent. Prin aceasta abordare, se poate obtine aproximativ 30-40 ng de mARN din 1 microgram de ARN total. Exista limitari ale izolarii ARN-ului polyA folosind oligo dT sau dU. Eficienta legaturii polyA sau polyU este variabila.
Structura secundara (puntile de hidrogen intracatenare sau intercatenare) din proba tinta poate concura cu legarea la oligomerul de prindere.

Unele esuturi ca pancreasul, lichidul cefalorahidian (LCR) sunt foarte bogate n RNaze. Dei nu este posibil s le eliminm, ele sunt capabile s se renatureze dup supunerea la oc termic. Totui dup nczire adaosul de mercaptoetanol agent reductor, ajut la pstrarea RNazelor n stare denaturat mpiedicnd reformarea punilor disulfidice. Este indispensabil neutralizarea aciunii lor n lizatul celular tratnd proba cu detergeni i ageni haotropici ca mercaptoetanol i tiocianat de guanidin.

n laborator sunt dou surse de contaminare cu RNaze: minile operatorului i germenii n suspensie din aer care se depun pe sticlrie i consumabile. Deci este esenial s se lucreze permanent cu mnui, s se utilizeze materiale de unic folosin, sticlria s fie tratat cu dietilpirocarbonat (DEPC 0,1%) inhibitor puternic de RNaz - apoi autoclavat ( DEPC intr n reacie cu bazele purinice), fie s fie supus la temperaturi foarte mari (200C) la autoclav fr tratament cu DEPC. Materialul plastic este decontaminat cu sod caustic 0,1 N i EDTA 1 mM apoi splat cu DEPC. Reactivii i tampoanele trebuie tratate cu DEPC apoi autoclavate. Pentru tamponul TRIS nu se face autoclavare dar se utilizeaz ap tratat cu DEPC pentru prepararea tamponului. Apa deionizat este n principiu lipsit de ARNaz.

In concluzie sunt necesare trei etape succesive pentru obinerea ARN purificat. 1. Liza celular. Se folosesc dou grupe de detergeni puternici care inhib RNazele. n prima grup agentul disociant utilizat este tiocianatul de guanidin (GTC) iar n a doua se asociaz cu mercaptoetanol. Ambii sunt inhibitori de RNaz. Utilizarea combinat permite disocierea proteinelor liza celulelor, inactivarea RNazelor i denaturarea ARN. Dac se dorete eliminarea riscului de contaminare ARN cu ADN este necesar tratarea cu DNaz. Tehnica unete metode care necesit utilizarea fenolului i a detergentului. Adesea se adaug un inhibitor de RNaze /RNasin) izolat din pancreas de bovine. RNazele sunt de asemenea inactivate cu SDS, proteinaza K.

2. Extracia propriu zis a ARN ARN este extras cu fenol/cloroform. Separarea se face pe baza precipitrii diferite a ARN i ADN n funcie de pH. n condiii de pHacid ARN rmne n soluie apoas. ADN i proteinele fiind n interfaz. n mediu alcalin ADN rmne n soluie apoas. 3.Precipitarea ARN. Se efectueaz similar cu ADN cu izopropanol sau etanol de asemenea se face splare cu etanol 70%. ARN se mai poate obine cu bile magnetice. Exist numeroase kituri de extracie rapid. Dozarea ARN. Poate fi necesar n Northern blot, RNazin Protein Assey. Spectrofotometria. Este cea mai utilizat i msoar densitatea optim la 260-280 nm a unei diluii de ARN.

Sinteza unui ADNc in vitro Manipularea i studiu ARN este diferit din cauza marii sensibiliti la ribonucleaze care-l distrug. Este necesar recopierea secvenei de ARN pentru a crea o structur stabil i care va fi amplificat n funcie de necesiti. ARNm purificat, utilizd cromatografia prin afinitatea pe o coloan de oligodezoxitimidina, este legat n prima etap cu oligonucleotide poliT care se ataeaz la coada polyA. Pornind de la extremitatea 3 a acestei amorse poly T, transcriptaza invers, care este o ADN polimeraz, sintetizeaz un lan de ADN complementar al mesagerului de pornire

Odat ce s-a realizat aceast sintez se degradeaz ARN printr-o baz tare sau o ribonucleaz specific. Lanurile de ADN constituite formeaz spontan o bucl la extremitatea 3, sub forma de agraf de pr, care se hibrideaz pe ea nsi. Extremitatea 3 a acestei bucle va servi ca situs de demaraj pentru ADN polimeraza, care va sintetiza un lan de ADN complementar primei. O ribonucleaz specific ADN-ului monocatenar va suprima bucla la extremitate. ADNc dublu catenar este sintetizat. Se poate astfel constitui att ADNc ci ARNm exist ntr-o celul; ansamblul acestor ADNc formeaz o banc de ADNc.

Electroforeza Electroforeza este o metoda de separare a particulelor incrcate electric prin migrare diferenial sub actiunea unui cmp electric. Ne permite cuantificarea de manier precis a ADN i ARN, iar n anumite cazuri, aprecierea cantitii de acizi nucleici prezeni (prin raportarea la un marker de talie cunoscut). Se poate utiliza hrtie, acetat de celuloza, gel de poliacrilamid, gel de agaroz, gel de amidon, gel de siliciu. Exist dou tipuri de gel utilizate mai frecvent agaroz i poliacrilamid care permit o separare mai bun. Agaroza, polizaharid extras dintr-o varietate de alg roie, este un polimer al unei uniti dizaharidice; la nclzire n soluii apoase formeaz hidrosoli, care la rcire se transform n hidrogel.

Electroforeza n gel poliacrilamid Gelul de poliacrilamid se formeaz prin polimerizarea vinilic a monomerilor de acrilamid CH2=CH-CO-NH2 n lanuri lungi de poliacrilamid i prin reticularea lanurilor n urma includerii unui comonomer bifuncional adecvat de obicei N, N metilen bisacrilamid (Bis). CH2=CH-CO-NH-CH2- NH-CO-CH=CH2 Reacia de polimerizare d natere n mod aleatoriu unor asemenea lanuri de poliacrilamid ce ncorporeaz o mic cantitate de molecule Bis, acestea putnd reacioana cu alte grupuri ale altor lanuri determinnd reticularea i formnd o reea. Concentraia poliacrilic utilizat determin lungimea medie a lanului de polimer, n timp ce concentraia de Bis determin gradul de reticulare. Ambele concentraii decid proprietile fizice ale gelului precum densitatea, elasticitatea , rezistena mecanic i dimensiunile porilor.

n trecerea prin mediul de agaroz sau acrilamid, moleculele se separ n funcie de dimensiune. Cele mai mari sunt reinute, iar cele mai mici migreaz. Acrilamida are putere mai mare separatoare dect agaroza ns este mai toxic. Tehnica electroforezei Dup formarea, turnarea gelului, trasarea godeurilor i solidificarea acestuia se vor introduce probele de ADN. n primul godeu se introduce un marker cunoscut, care permite estimarea mrimii fragmentelor de ADN. Se utilizeaz frecvent ADN de fag restrictat cu o anumit enzim. Fragmentele rezultate au o mrime cunoscut, ceea ce permite folosirea lor ca etalon. n godeurile rmase se introduc pe rnd probele care urmeaz s fie analizate.

Se adaug doi colorani: unul bine vizibil pe gel care va migra foarte rapid, albastru de bromfenol, pus naintea fragmentelor de ADN pentru a delimita distana parcurs pn la anod. Al doilea, bromura de etidiu, care se se intercaleaz ntre bazele de acizi nucleici i imprim o culoare oranj cnd acestea sunt expuse la lumina UV. Astfel, moleculele de ADN complexate cu bromur de etidiu devin vizibile. Aparatul de electroforez se cupleaz la o surs de curent . Polul pozitiv este opus godeurilor.Cnd frontul de migrare ajunge n apropierea captului opus al gelului, se ntrerupe sursa de curent. Se scoate tvia cu gel i se vizualizeaz n UV la 254 nm, se vor fotografia fragmentele de ADN digerate n gel.

Distana de migraie este proporional masa molecular: exist o proporionalitate invers ntre mobilitatea i logaritmul masei, dar relaia este valabil pentru moleculele liniare avnd sub 20 kb. Se determin astfel mrimea fragmentelor de restricie obnute i se compar cu a celor de mrime cunoscut. migrarea moleculelor mari de 20kb este aproape independent de mrime i nu mai apare o relaie de linearitate; conformaia cerc deschis CD/OC - open circle, cerc covalent nchis CCI/CCC covalenty closed cirle. La aceeai mas molecular, CCI au cea mai mare mobilitate pe cnd conformaia CD este mai lent. Moleculele liniare au o mobilitate intermediar. tamponul de electroforez folosit este Tris Acetat (TAE).

Dup migrare probele se citesc la UV. n unele cazuri moleculele care trebuiesc separate sunt marcate prin ncorporarea unui izotop radioacitv care permite detectarea prin autoradiografie. Particulele energetice emise de radioizotop imprim un film fotografic pe gel. Se developeaz pentru a se vedea benzile negre care corespund moleculelor marcate radioactiv.

Efectele dimensiunii porilor n mediile gelificate, trecerea oricrei particule este ntrziat de structura matricei i depinde de mrimea relativ a particulelor i a porilor din reeaua gelului. Att dimensiunile ct i sarcina moleculelor au un rol important n procesul de separare. n gelurile de agar dimensiunea porilor este mare . Poliacrilamida are avantajul uurinei cu care mrimea porilor poate fi modificat prin concentraia acrilamidei i a proporiei de agent de reticulare. Pe msura creterii proporiei de agent de reticulare cinetica de reacie este ncetinit i matricea de gel devine mai puin omogen.

Alegerea gelului i a sistemului tampon adecvat De exemplu un amestec de proteine virale sau acizi nucleici cu greuti moleculare mari ar putea impune alegerea unui gel cu pori mari avnd o concentraie de poliacrilamid T sub 5% pentru a evita efectul excesiv de sit molecular. T=15-20% sau mai mult se preteaz pentru polipeptide ori histone cu greutate molecular mic, aceste concentraii accentund diferenele minore de dimensiuni n cadrul aceluiai nivel de greutate molecular.

La separarea unui amestec de proteine este puin probabil alegerea acelui set de condiii s poat garanta cel mai bun grad de separare a fiecrei componente de celelalte. Dac ntr-un gel se obine o singur band aceast nu conine n sine dovada prezenei unei singure componente omogene.

Gelurile plate verticale Grosimea gelurilor 0,5-1,5 mm. Cu ct sunt mai subiri cu att sunt mai rapide i eficiente pentru colorare, decolorare, iar rcirea din timpul electroforezei este mai rapid i mai uniform. Aceasta permite aplicarea unei tensiuni mai mari i a unor timpi de aciune mai redui. Gelurile sunt obinute n forme separate care ulterior sunt inserate n aparat cu ajutorul unor garnituri de cauciuc i introduse n tamponul ce reprezint mediul de rcire (rcire realizat prin mijlocirea tuburilor de ap).

Un colorant trasor este albastru de bromfenol. Acesta migreaz cu o vitez mai mare dect oricare dintre componententele macromoleculare ale probei i indic momentul stoprii electroforezei. Gelurile se introduc n baie de colorant cu bromur de etidiu 3 minute, apoi se examineaz la o lamp cu ultraviolete.

Lipoproteinele, au caracter parial proteic pot fi colorate naintea electroforezei pentru a le deosebi de proteine. Se folosete Sudan Black B. Exist densiometre laser care scaneaz gelurile la nivele de rezoluie extrem de ridicat. Rspunsul scanner-ului poate fi computerizat ceea ce permite nregistrarea, redarea, evaluarea i stocarea datelor pe disc sau imprimarea lor, precum i compunerea a dou geluri diferite. Semnalul densitometric este preluat, nregistrat i este cuantificat prin msurarea suprafeelor de sub peakurile individuale. Se poate recurge la integrarea electronuc sau prin achiziionarea de date pentru calcul computerizat al suprafeelor de sub peak, metod folosit pentru scanarea unui numr mai mare de geluri. nlimea peak-ului depinde de distana materialului parcurs prin gel.

Electroforeza proteinelor Proteinele se pot separa prin electroforez ca i acizii nucleici. Suportul poate fi acetat de celuloz, pentru proteinele din serul uman, sau hrtie, ntr-un tampon de pH de 8,6. Benzile corespunztoare proteinelor separate, sunt vizualizate prin colorare cu un colorant specific i printr-o scanare densiometric se obin indicaii despre cantitatea relativ a proteinelor din fiecare band separat. Dei mobilitatea proteinelor depinde n special de sarcina electric relativ a acestora, dimensiunea proteinelor joac de asemenea un rol important i aceasta contribuie desigur la poziia benzii corespunztoare moleculei de globulin.

Electroforeza proteinelor n gel de poliacrilamid Gelul de poliacrilamid se poate folosi n locul acetatului de celuloz sau al hrtiei pentru separarea proteinelor native. Un astfel de gel este folosit n mod obinuit n prezena dodecil sulfatului de sodiu (SDS). n acest caz proteinele oligomerice (alctuite din cteva uniti polipeptidice) se pot separa n subunitile lor individuale. Proteinele se separ ntr-o soluie SDS 1%. Acest detergent desface majoritatea legturilor dintre proteine i dintre acestea i lipide. Pentru a desface i punile disulfurice, se adaug foarte des i 2-mercaptoetanol.

Mobilitatea electroforetic a majoritii proteinelor (dar nu i a glicoproteinelor), depinde de dimensiunea lor, deoarece sarcina negativ adus de moleculele SDS legat de protein este mult mai mare dect sarcina net a proteinei nsi. O distribuie specific (pattern) de benzi se obine la colorarea gelului cu Albastru Comassie. Gelul de agaroz poate fi folosit n locul celui de poliacrilamid n cazul proteinelor mai mari sau pentru a obine o separare diferit n absena SDS. Se poate aplica metoda PAGE bidimensional, folosind condiii de lucru diferite de cele dou direcii de migrare: de exemplu un gradient constant de pH (pH 4-7%) pe o direcie i un pH 11-14%poliacrilamid n cealalt direcie.

S-ar putea să vă placă și