Cultivarea virusurilor

Structur foarte simpl Ageni acelulari:

Segmente

de acizi nucleici nveli proteic protector

sunt adaptate la un parazitism obligatoriu intracelular (nu exist medii acelulare pe care putem cultiva virusuri) se pot dezvolta doar n celule vii

Schema de diagnostic n bolile virale

I. II.

Diagnostic virusologic Diagnostic serologic

Diagnostic virusologic
1. Recoltarea produselor patologice

2. Izolarea virusului

preparate microscopice (ME) se pot detecta Ag virale IF, metode imunoenzimatice, alte procedee

inocularea pe unul din sistemele celulare vii urmrim dezvoltarea virusului identificarea virusului

Diagnostic serologic

se recolteaz dou probe de ser prima prob odat cu produsul patologic A doua prob la 7 -14 zile interval Se urmrete creterea n dinamica titrului anticorpilor specifici

Sisteme celulare care asigur dezvoltarea i cultivarea virusurilor:

animale de experien
oul de gin embrionat culturi de celule

Animale de experien

apariia semnelor de boal leziunile care apar n esuturile afectate: preparate colorate incluzii virale = formaiuni rotunde-ovalare situate n nucleul celulelor parazitate de virus sau al citoplasmei uneori au importan diagnostic incluziile Babe-Negri n citoplasma neuronilor infectai cu virusul rabic detectarea anticorpilor specifici

Inocularea pe animale a permis izolarea:

virusului poliomielitei maimu virusurilor gripale inoculare intranazal la oarece nou-nscut virusul Coxsackie A oarece nou-nscut virusul rabic, arbovirusuri intracranian la oarece nou-nscut

Virusul Coxsackie A,B virus cu ARN (fam. Picornaviridae)

inoculare subcutanat n regiunea cefei la oarece nou-nscut a unei mici cantiti mici de produs patologic (LCR) v.coxsackie A oarecele moare ntr-o sptmn paralizie flasc leziuni n musculatura striat (degenerarea musculaturii, fenomene de miozit)

Pe seciuni din musculatur, colorate HE alterarea structurii normale a musculaturii striate

v.coxsackie B leziuni n principal la nivelul SN; oarecii mor cu paralizie spastic leziuni i n pancreas, ficat

Oul embrionat
= sistem celular nchis, steril; sunt celule tinere n dezvoltare, nu gpsim dezvoltate mecanismele de aprare umoral i celular inoculare din anii 1930 v. gripale (metod de elecie) v. urlian

Dezvoltarea virusurilor pe oul embrionat - urmrim viabilitatea embrionului - v. variolei se urmrea apariia pe membrana corioalantoidian a unor mici leziuni de culoare alburie - v. gripale:

nu omoar embrionul incubare 48 ore la frigider 18 ore se taie un cpcel n dreptul camerei de aer se absorb lichidul alantoidian i lichidul amniotic n acele lichidese cut prezena virusului gripal prin reacia de hemaglutinare (HA)

Reacia de hemaglutinare

diluii din lichidele embrionare (1/4, 1/8, 1/16, 1/32, ... ) suspensii de hematii de coco 1 or la temperatura camerei (TC) dac exist v. gripal aglutinarea hematiilor

identificarea virusului hemaglutinant prin reacia de hemaglutinoinhibare (HI) Se folosesc anticorpi antigripali cunoscui dac agentul hemaglutinant este virusul gripal, anticorpii s-au fixat pe suprafaa virusului, deci virusul nu mai aglutineaz hematiile (se depun ca un buton)

Culturi de celule
= sisteme celulare vii care permit izolarea

virusurilor n laborator introduse n practica de laborator n 1949 Tipuri de celule:

culturi primare culturi de celule diploide linii celulare

culturi de celule dezvoltarea virusurilor

1. ECP (efect citopatic) citocid (cu moartea celuleor infectate de virus) picornavirusuri sinciial (celulele fuzioneaz apar mase gigante multinucleate) paramyxovirusuri, virus respirator sinciial agregare (celulele formeaz palcarde) adenovirusuri transformarea tumoral a celulelor virusurile oncogene, retrovirusuri minim detecatrea virusului prin IF, HA, HAI fr modificri v. rubeolei

2.Incluzii nucleu v. herpetice, adenovirusurile citoplasm v. turbrii, poxvirusurile nucleu i citoplasm v. rujeolei, v. citomegalic 3. Hemaglutinare

4. Hemadsorbie: adsorbia hematiilor pe suprafaa celulelor n care se multiplic virusul 5. Imunofluorescena 6. Interferena prin acest fenomen se pune n eviden virusul rubeolei se adaug un virus despre care tim exact ECP dac al 2-lea virus nu mai produce efect citocid nseamn c n celulele respective s-a multiplicat v. rubeolei

Identificarea virusurilor
1. Reacia de hemaglutinare (HA), hemaglutinoinhibare (HI) HI confirm i identific varianta de virus izolat

Reacia HI i n diagnosticul serologic (pentru depistarea Ac specifici) dg. serologic, totdeauna lucrm probe perechi de seruri: o prob ct mai aproape de debutul bolii, serul se congeleaz pn la recoltarea celei de-a 2-a probe la 7 zile de la prima prob ambele probe se lucreaz n aceeai zi, cu acelei materiale

2. RFC

pentru identificarea virusului mai ales pentru dg. serologic tehnica Bradstreet-Taylor (pe plci cu godeuri) tehnic la rece: Dup ce se pun n contact diluii de ser de bolnav + Ag + C' (prin titrarea C' n tabl se ah se titreaz concomitent C' i hemolizina) 18 ore / 4 C + sistem hemolitic (hematii de oaie + hemolizin) = sistem Ag-Ac cu rol de indicator

3. Seroneutralizarea (SN)
reacie laborioas (rar n laborator) pentru unele picornavirusuri (v. poliomielitei) = neutralizarea infectivitii virale de ctre Ac specifici antivirali astfel nct aceste complexe Ag-Ac nu mai permit: producerea infeciei la animale infectarea oului embrionat infectarea culturilor de celule

4. IF pentru detectarea Ag din culturi de celule sau produs patologic i pentru detectarea Ac din ser 5. Metode imunoenzimatice pentru depistarea infeciei HIV confirmarea infeiei HIV prin alte procedee (Western blot) 6. Imunodifuzia n gel (CIEF) HBV