Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Doua categorii de date experimentale au dus la conceperea unui model structural al ADN
http://www.dnai.org
Sectionarea cu aceeasi enzima de restrictie a doua molecule de DNA pot duce (datorita portiunilor monocatenare – ‘lipicioase’) la
colaje de fragmente si astfel la molecule noi de ADN (recombinant)
Denaturarea reversibila a DNA:
animatii
F://animatii
http://www.dnai.org/d/index.html
http://en.wikipedia.org
http://en.wikipedia.org-DNA-Wkipedia
http://en.wikipedia.org-DNA-Wkipedia
DNA polimeraze
Procariote:
DNA polimeraza I (E. coli), procesivitate mica, 5’ exonucleaza asociata, 3’exonucleaza asociata
DNA polimeraza II (E.coli) procesivitate mica
DNA polimeraza III (E. coli) inalt procesiva, 3’exonucleaza asociata
DNA polimeraza IV (E.coli) procesivitate mica, poate face sinteza translezionala a dimerilor de timina
DNA polimeraza V (E coli) procesivitate mica, fidelitate mica, face sinteza translezionala cu greseli
Taq polimeraza (Termus aquaticus) procesivitate mica, 5’polimeraza asociata
Eucariote:
DNA polimeraza α (cu centru catalytic suplimentar de ARN polimeraza (primaza); neprocesiva
DNA polimeraza β neprocesiva
DNA polimeraza γ (mitocondrialla)
DNA polimeraza δ inalt procesiva, centru catalytic 3’exonucleazic
DNA polimeraza ε inalt procesiva, centru catalytic 3’ exonucleazic
DNA polimeraza η procesiva, poate face sinteza translezionala T-T fara eroare
DNA polimeraza ζ procesiva, face sinteza translezionala cu erori
Caractere comune:
Toate adauga nucleotide (din nucleozid trifosfati) la extremitatea 3’ a unui primer, conform unui model monocatenar)
Toate au nevoie de un model (DNA in cele mai multe, ARN la revers-transcriptaze)
Toate au nevoie de un primer (ADN sau ARN) complementar cu modelul
Diferente:
Functii enzimatice suplimentare (datorate unor centri catalitici diferiti de cel polimerazic)
5’ exonucleazic
3’ exonucleazic
Fidelitate
Procesivitate (datorata unei subunitati speciale numite factori de procesivitate), uneori folosita alternativ de una sau alta din
polimeraze (de exemplu polimeraza eucariota delta si polimeraza eta folosesc acelasi factor de procesivitate PCNA, dar nu simultan.
Capacitatea de a adauga (sau nu) un nucleotide suplimentar la catena sintetizata dupa terminarea modelului
Molecule circulare (in special la procariote) : cromozomi bacterieni (sute de mii de perechi de nucleotide), plasmide (mii de perechi de
nucleotide)
Cromosomi la eucariote : DNA linear cu extremitatile celor doua catene sudate. DNA cromosomal este impachetat cu proteine, sub
forma de cromatina
Structurile DNA in vivo nu au capete libere. Impachetarile duc la suprahelicare (numar de treceri ale unei catene asupra celeilalte
diferite de cele de echilibru. Superhelicare negativa (numar mai mic de treceri decit cel de echilibru) sau pozitiva (numar mai mare de
treceri). Forma obisnuita de superhelicare – superhelicarea negativa.
Formele superhelicate (pozitiv sau negativ) si cele relaxate ale aceleiasi molecule de DNA – topoizomeri. Topoizomerazele catalizeaza
trecerea de la un topoizomer la altul.
Topoizomeraze:
Enzime care catalizeaza trecerea unui topoizomer: de exemplu DNA superhelicat, adica avind un n –linking number-diferit de cel de
echilibru in DNA relaxat, cu n – linking number- apropiat de cel de echilibru
Sinteza DNA in vivo (replicarea). Se face dupa modul semiconservativ (ca si sinteza in vitro). Ca si la sinteza in vitro, este nevoie de
dezoxinucleozid trifosfati (A,G, T, C), model monocatenar, DNA polimeraza si primeri. Primerii sunt sintetizati ca scurte catene de
ARN construite de o ARN polimeraza (care poate sintetiza pornind de la primul nucleotid) numita primaza. Monocatena model se
obtine prin denaturarea catalizata a ADN bicatenar. Catalizatorii sunt enzime numite helicaze.
In vivo, furca de replicare se deplaseaza in aceeasi directie pentru ambele catene, desi catenele sunt antiparalele si DNA polimerazele
nu adauga nucleotide decit la extremitatea 3’ a catenei care se alungeste, spre polul 5’ a catenei model. Aceasta face ca una din catene
(care se alungeste in directia de deplasare a furcii de replicare) sa se poate replica continuu, cealalta (care se alungeste in sensul invers
furcii de replicare) nu se poate replica decit discontinuu, sub forma fragmentelor Okazaki (cu sinteza de primer RNA de fiecare data)
Catena cu sinteza discontinua (lagging) se poate alungi in directia furcii de replicare numai daca catena model dupa care se copiaza
este cudata. Cudarea se poate face prin montarea si demontarea (pentru fiecare fragment Okazaki) a factorului de procesivitate (β
clamp, PCNA) pe si de pe subunitatea catalitica a polimerazei care face sinteza discontinua (lagging strand)
Fragmentele Okazaki sunt prelucrate (li se detaseaza partea ARN), alungite de o polimeraza cu procesivitate mica si sudate prin DNA
ligaza
DNA ligaza actioneaza intr-un mod asemanator cu topoizomerazele de clasa I
Fidelitatea replicarii DNA
Probabilitatea de a introduce un nucleotid gresit este in jur de 10-9. Ea este atit de mare in ciuda faptului ca:
- erorile datorate numai formelor tautomere ale bazelor ar avea frecventa de ordinul 10-5
-agitatia termica ar duce la ruperea legaturilor N- glicozidice la un numar de aprox. 10-4 – 10-5 situri abazice. In timpul replicarii,
acele situri ar putea fi complementate cu orice nucleotid, corect sau gresit.
-factori fizici (radiatia UV, radiatiile ionizante, chimicale ca acidul nitros si derivatii sai, agentii alkilanti, hirocarburile policiclice (din
fum, gudroane, etc) pot modifica un numar variabil de baze azotate. In acest caz, in cursul replicarii, aceste baze modificate ar putea
duce la complementarea gresita pe catenele noi sintetizate.
- Functia editoare (3’-exonucleazica) a DNA polimerazelor (mai ales in cazul erorilor produse de formele tautomerice
minore a bazelor azotate (care dureaza foarte putin in timp
Dezaminare
2.Alkilari (metil metan sulfonat, gaz mustar si alti agenti alkilanti)
3. Legaturi covalente nenaturale intre baze azotate (raze UV)
4. Rupturi monocatenare (UV, procese ale metabolismului DNA)
1. Legaturile fosfodiesterice la ADN sunt mult mai stabile decit cele de la ARN (labilizate de vecinatatea functiei hidroxil la
2’)
2. ARN are proprietati catalitice, datorita aceleiasi functii hidroxil de la pozitia 2’ a ribozei. ARN poate cataliza reactii de
transesterificare si transpeptidare
Majoritatea moleculelor de ARN sunt monocatenare; exista si ARN bicatenar
Specii de ARN in vivo
ARN monocatenar
Nuclear Citoplasmatic
snRNA
tRNA (transfer)
ARN regulatori
Sinteza ARN
Se face prin transferul unuia din cele 4 nucleotide componente: Adenilic, Guanilic, Citidilic, Uridilic de la ATP, GTP, CTP sau UTP la
hidroxilul 3- a unui nucleotid (sau polinucleotid) anterior. Extremitatea 5’ a unui ARN nou sintetizat este intotdeauna un nucleozid
trifosfat.
RNA polimeraze :
ADN dependente
ARN dependente sau ARN replicaze (caz particular, in special la celulele vegetale) rezultind intr-un ARN bicatenar care poate fi
fragmentat in RNAi (scurte molecule de ARN bicatenar de catre complexul Dicer existent in toate celulele eucariote)
Copiile de ARN ale DNA sunt partiale si folosesc una sau cealalta catena a DNA. Se pune problema selectiei copierii : selectia catenei,
selectia locului de incepere si de terminare a copierii (transcriptiei). Secventa de DNA numita promotor semnalizeaza inceputul
transcriptiei si atasarea proteinelor participante. Proteinele participante sunt factorii generali de transcriptie (aceiasi pentru toate
transcriptele uneia din polimeraze) si factori regulatori de transcriptie (diferiti pentru grupe de gene diferite)
In jurul casetei TATA a promotorului se ataseaza factorii generali de transcriptie. Factorii regulatori se ataseaza de alte secvente, in
general in amonte de caseta TATA.
Initierea transcriptiei are nevoie de helicaze, topoizomeraze si factori generali de transcriptie intre care proteinele care recunosc
caseta TATA (s la procariote, TBP la eucariote) si ARN polimeraza. Ceilalti factori generali de transcriptie au diferite roluri in
constituirea complexului de initiere.
Dolan : http://www.dnai.org/d/index.html
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm
Transcriptele primare se prelucreaza in nucleu si citoplasma pina ajung la ARN matur: mRNA, rRNA, tRNA si alte forme (de
exemplu, siRNA). Aceste prelucrari sunt catalizate de ARN insusi (ribozim)
Precizia eliminarii intronilor este asigurata de molecule de ARN (U1 – U6) din categoria snRNA
http://en.wikipedia.org
`
Reglarea expresiei genice
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm
Codul genetic
Alfabetul de 4 litere al DNA trebuie sa codifice 20 de aminoacizi. Aceasta se poate face doar prin grupare
Daca fiecare nucleotide ar codifica un aminoacid cele 4 nucleotide ar putea codifica 4 nucleotide
Daca un grup de doua nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 2 nucleotide ar putea codifica 42
= 16 aminoacizi
Daca un grup de trei nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 3 nucleotide ar putea codifica 43
= 64 aminoacizi
Mai mult decit sufficient pentru cei 20 aminoacizi + citeva semne de punctuatie
Un triplet de nucleotide este unitatea de cod = codon
Care sunt codonii pentru fiecare aminoacid? (Nirnberg, Chorana, Ochoa, 1960-1966)
http://www.dnai.org/d/index.html
Moleculele si structurile supermoleculare care iau parte la biosinteza lanturilor polipeptidice (procesul de translatie a
mesajului genetic)
Etape:
1. Initiere
Subunitatea mica se asociaza cu mRNA si cu tRNAmet initiator plasat in situl P impreuna cu codonul initiator de pe
mRNA. Apoi asociaza si subunitatea mare
2. Alungire
Se intimpla in cicluri; fiecare ciclu rezultind in adaugarea unui nou aminoacid la aminoacidul initiator (ciclu 1) sau
a unui lant polipeptidic cu n aminoacizi (ciclul n)
3. Terminare
Se intimpla cind in situl A al ribosomului apare un codon ‘stop’ nerecunoscut de nici un anticodon ci de un factor
proteic de terminare. Lantul polipeptidic se desface de ultimul tRNA si subunitatile ribosomului disociaza
1. Initiere
Antibioticele si toxinele ca inhibitori ai sintezei de polipeptide
Mutatii punctuale:
Efecte posibile:
a. Nici un effect
b. Inlocuirea unui aminoacid cu alt aminoacid (mutatie missense – sens gresit)
c. Scurtarea prematura a lantului (mutatie nonsens, datorita transformarii unui codon sens (codifica aminoacid) in codon
‘stop’)
Efecte:
a. Alterarea completa a secventei de aminoacizi inspre extremitatea C, pornind de la locul mutant;
b. Lant polipeptidic mai scurt sau mai lung, ca effect al schimbarii cadrului de citire