Sunteți pe pagina 1din 6

CULTURA DE CELULE I ESUTURI ANIMALE: Aspecte generale Cultura de celule este o metoda de biologie celulara pe larg utilizat pentru

cercetarile biomedicale fundamentale (biochimie, biologie celular i molecular, genetic) i aplicative (biotehnologie, inginerie tisular, inginerie genetic etc). LABORATORUL DE CULTURI CELULARE Laboratorul de culturi celulare se compune din mai multe spatii de lucru si anexe, legate intre ele intr-un circuit functional, care sa asigure pe de o parte protectia personalului, iar pe de alta parte conditiile sterile de lucru, de care depinde reusita procedurilor de lucru. Camera pentru preparare a mediilor si sterilizare, vestiarul, camera-filtru si boxele sterile sunt principalele incaperi, care alcatuiesc circuitul unui laborator de culturi celulare. In afara de acestea, un spatiu separat este prevazut pentru stocarea probelor biologice la rece, sau camera de criostocare. In camera de preparare a mediilor si sterilizare sunt amplasate aparatle necesare pentru obtinerea unui mediu de cultura (aparatul pentru obtinerea de apa distilata sau ultrapura, balanta analitica, plita magnetica, pH-metru, etuva, autoclav, frigider etc) Vestiarul este dotat cu dulapuri si spatii de depozitare a hainelor de exterior si materiale pentru igiena personala (chiuveta cu apa curenta, sapun, prosoape de hartie). In camera-filtru se gasesc echipamentele vestimentare pentru operatorii culturilor de celule (halate, manusi, capeline, masti, papuci de laborator), dezinfectante pentru maini si alte materiale de lucru, care necesita depozitarea intr-un spatiu curat, cu decontaminare periodica. Camera steril este dotat cu sisteme eficiente de sterilizare (aparat pentru filtraea sterila a aerului, lampa cu radiaie UV, echipamente sterile pentru personal). In camera sterila se lucreaza cu materialul biologic (celule si tesuturi), utilizand aparatura specifica pentru obtinerea suspensiilor celulare, pentru incubarea celulelor si monitorizarea acestora. Astfel, in camera sterila (boxa sterila de lucru) sunt amplasate urmatoarele aparate: Hota cu flux de aer laminar vertical - o incinta de lucru cu deschidere frontal. Are montate in plafon filtre HEPA cu o dimensiune a porilor de 0,22 m, care nu permit trecerea microorganismelor. Astfel, filtrele HEPA au rolul de a steriliza aerul care intra in contact cu celulele, lichidele si celelalte materialele sterile in lucru.

Incubatorul in care celuele sunt meninute la o temperatur de 37 OC, o concentratie a bioxidului de carbon (CO2) din aer de 5-6 % si 96-97% umiditate. Atmosfera hipoxica (imbogatita cu CO2) este un factor stimulator al cresterii celulare pe de o parte si un factor de mentinere a echilibrului acido-bazic in mediile de cultura formulate pe baza de NaHCO3, pe de alta parte. Umiditatea este importanta pentru evitarea cresterii osmolaritatii mediilor de cultura prin evaporarea apei din acestea. Microscopul optic inversat in contrast de faza, cu ajutorul caruia sunt analizate celulele din cultura. Centrifug de laborator cu sistem de racire, necesara pentru procesul de izolare si spalarea a celulelor. In camera de criostocare sunt pastrate, la diferite intervale valorice ale temperaturilor <0oC, celule, fragmente de tesuturi si o serie de suplimente pentru prepararea mediilor de cultura: serului fetal de viel, L-glutamatul, factori de crestere si altele. - Inghetarea la 200C - conservarea serului fetal si a factorilor de crestere, a reactivilor si solutiilor care au indicata de producator, pastrarea prin inghetarea la aceasta temperatura - Inghetarea la 80 oC - criostocarea celulelor si fragmentelor de tesut pentru o perioada scurta de timp (1-2 luni) - Inghetarea la -1960C in azot lichid (NH2) criostocarea celulelor si fragmentelor de tesut pentru o perioada indelungata de timp ani

Containere de stocare a celulelor in azot lichid

MATERIALE DE LUCRU

Materialel specifice tehnicii culturilor de celulare sunt: - recipientele pentru creterea celulelor (cutii Petri, flacoane tip Corrner cu suprafata de crestere diferita, plci multicelulare simple i supraetajate) - tuburi pentru criostocare, - tuburi pentru centrifugare, - pipete gradate si pipete automate cu varfuri detasabile, - sisteme de filtrare a solutiilor cu pori de 0,22 m, - camere de numarat celule, - alte materiale, comune laboratoarelor cu specific de biochimie si biologie moleculara Este bine sa fie folosite recipiente de cultura de unica folosinta, presterilizate (din policarbonat, polistiren sau polipropilen) in locul sticlriei clasice, care necesita spalare si sterilizare.

Plasi de cultura simple

Tuburi de centrifuga

Placi de cultura multi-well (multicelulare), sau cu godeuri

Pipete serologice umplere a acestora

si

dispozitiv

de

Flacoane de cultura

Camera de numarat celule (hemocitometru)

Filtre cu pori de 0,2 m, atasabile la seringa

Pipete automate si varfuri pentru pipete automate

MEDII DE CULTUR Mediile de cultur folosite intr-un laborator de culturi celulare sunt de mai multe tipuri si sunt alese in functie de protocolul. In functie de tipul celulelor multiplicate si a obiectivelor urmarite se pot utiliza:

medii de spalare a celulelor (solutii saline tamponate) medii de cultura pe baza de ser fetal bovin (SFB) medii de cultura sintetice, cu suplimente nutritive formulate in functie de tipul celulelor din cultura (medii fara SFB) Mediile de cultura sunt solutii saline fiziologice tamponate, imbogatite cu suplimente organice cu rol nutritiv, energetic, de reglare a metabolismului celular si a diviziunii celulare. (aminoacizi, vitamine, glucoza si altele). Mediile de cultura pot fi suplimentate cu amestec de antibiotic in raport de 1% (penicilina, streptomicina si neomicina) si cu indicatorul de pH de tipul rosu-fenol. PROCEDEE DE STERILIZARE

Toate materialele si lichidele care intra in contact cu celulele in cultura trebuie sa fie sterile. Alegerea metodei de sterilizare a acestora este dictata de stabilitatea lor la temperaturi inalte. Sterilizarea cu aer uscat si fierbinte, sterilizarea in abur fierbinte, iradierea, sterilizarea chimica si filtrarea sunt cele 5 posibilitati aplicate in functie de materiialul sterilizat, conform tabelului de mai jos. METODA CONDITII 160oC, 1 Aer ora fierbinte Abur fierbinte 121oC, 1520 min MATERIALE Metal, sticla, PTFE (teflon) LIMITARI Pot avea loc schimbari de culoare a materialelor sterilizate Ambalaje permiabile la abur; Un timp mai mare de incalzire din cauza unui volum mare de apa necesar pentru sursa de abur Alterari chimice si degradari macromoleculare Necesita o sursa de generare a electronilor, fiind mai putin accesibila pentru laboratoarele mici

Lichide stabile: apa, solutiile saline, mediile autoclavabile, materiale plastice cu o stabilitate relativa la temperaturi inalte: siliconii, policarbonatul (PC), nylonul, polipropilena (PP)

Iradiere: Radiatii

25KGy

Plasma (fascicol de electroni)

25KGy

Materiale plastice de tipul polistirenului (PS), suporturi organice, reactivi si substante sensibile la incalzire Materiale plastice de tipul PS, suporturi organice, reactivi si substante sensibile la incalzire

Microunde

Radiatiile UV din spectrul lungimilor scurte Sterilizare chimica Etilen oxid 1h

5 min, intensitate superioara 254 nm, 50100 W, 30 min

Apa, gelurile de tipul agarului

Este posibil pentru volume mici Nu este accesibil pentru zonele umbrite; Rezistenta pentru spori

Solutii contaminate, material plastic, aerul din incinta, suprafete de lucru cu suprafata extinsa.

Materiale plastice terminstabile Instrumentar metalic

70% solutie apoasa 1 ora de de alcool etilic imersie

Din cauza compusilor toxici reziduali, necesita o ventilare de cateva zile Nu distruge sporii; Exista un risc crescut de imflamare daca se asociaza cu flambarea la flacara Nu poate fi folosit pentru solutiile vascoase sau DMSO (di-metilsulfoxid)

Filtrare Filtre atasabile la seringa sau unitati de filtrare pentru volum mare de lichid

Pori de 0,10,2 m

Toate solutiile apoase, in special cele termosensibile, ce contin proteine

NORME DE SECURITATE SI PROTECTIA MUNCII IN LABORATORUL DE CULTURI CELULARE: 1) 2) 3) 4) 5) In laborator nu se intra in hainele si incaltamintea de strada. Nu se consuma alimente sau lichide Inainte de a intra si la parasirea spatiilor laboratorului de culturi celulare mainile se spala cu sapun lichid cu proprietati dezinfectante Se evita expunerea la radiatiile UV. Lampile UV sunt pornite dupa terminarea lucrarilor si sunt oprite cu cel putin 20-30 min inainte de a intra in laborator Pentru colectarea materialelor cu potential risc biologic se utilizeaza sacii si galetile din material plastic de culoare galbena, cu in scriptia BIOHAZARD risc biologic