Sunteți pe pagina 1din 0

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE

GR. T. POPA IAI



FACULTATEA DE FARMACIE






Farmacist LAVINIA-MIRELA CRCIUN (REDE)

Studii privind mrirea
disponibilitii in vitro a
lupeolului cu transportori
hidrofili





REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT






Conductor tiinific:
Prof. univ. Dr. IULIANA POPOVICI




Iai, 2011











Teza de doctorat cuprinde:
204 pagini, din care:
48 pagini: PARTEA GENERAL
156 pagini: CONTRIBUII PERSONALE
care includ:
115 figuri;
49 tabele;
211 referine bibliografice;
anexe, cu:
lista i 7 lucrri publicate;
CV.






CUPRINS

Introducere
PARTEA GENERAL
Capitolul I TRITERPENE PENTACICLICE CU UTILIZARE TERAPEUTIC
LUPEOL
1.1. Proprieti fizico-chimice
1.2. Obinere i surse de lupeol
1.3. Stadiul aplicaiilor practice ale aciunii terapeutice a unor triterpene pentaciclice
Capitolul II UTILIZRILE CICLODEXTRINELOR N DOMENIUL
FARMACEUTIC
2.1. Structura ciclodextrinelor
2.2. Tipuri de ciclodextrine
2.3. Scurt istoric
2.4. Procedee de obinere a complecilor de incluziune
2.5. Metode de analiz a complecilor de incluziune
2.6. Utilizrile ciclodextrinelor n domeniul farmaceutic
CONTRIBUII PERSONALE
Capitolul III METODOLOGIA CERCETRII
3.1. Motivaia alegerii temei
3.2. Scopul i obiectivele studiului
3.3. Metodologia de lucru
3.4. Metoda statistic
Capitolul IV CORELAII QSAR NTRE STRUCTURA TRITERPENELOR I
CAPACITATEA DE LEGARE DE CICLODEXTRINE
4.1. Date introductive
4.2. Rezultate i discuii
4.3. Concluzii
Capitolul V PREPARAREA UNOR COMPLECI DE INCLUZIUNE A LUPEOLULUI
CU CICLODEXTRINE TRANSPORTORI HIDROFILI
5.1. Studii in vitro de solubilitate a complecilor de incluziune
5.2. Analiza morfologic a complecilor de incluziune
5.3. Caracterizarea complecilor de incluziune prin calorimetrie diferenial dinamic
(cu scanare sau baleiaj)
5.4. Analiza prin spectroscopie IR (FT-IR)
5.5. Analiza microstructural prin difracie cu raze X
Capitolul VI FORMULAREA I PREPARAREA DE UNGUENTE CU LUPEOL I
COMPLECII DE INCLUZIUNE LUPEOL-CICLODEXTRINE
6.1. Formularea unguentelor
6.2. Prepararea unguentelor
6.3. Concluzii
Capitolul VII CONDIIILE DE CALITATE I CONTROLUL FIZICO-CHIMIC AL
UNGUENTELOR CU LUPEOL I COMPLECII DE INCLUZIUNE
LUPEOL-CICLODEXTRINE
7.1. Metode fizico-chimice
7.2. Analiza caracterelor reologice
7.3. Analiza calitilor senzoriale
Capitolul VIII STUDII PRIVIND DETERMINAREA DISPONIBILITII IN VITRO
DIN UNGUENTE A LUPEOLULUI I A COMPLECILOR DE
INCLUZIUNE CU TRANSPORTORI HIDROFILI
8.1. Studiul cedrii in vitro din unguente a lupeolului i a complecilor de incluziune
8.2. Studiul cineticii de cedare in vitro din unguente a lupeolului i a complecilor de
incluziune
Capitolul IX TESTAREA ACIUNII ANTITUMORALE A LUPEOLULUI I A
COMPLECILOR DE INCLUZIUNE
Capitolul X EVALUAREA CITOTOXICITII I A ACIUNII
ANTIANGIOGENICE A LUPEOLULUI COMPARATIV CU UNELE
TRITERPENE PENTACICLICE
10.1. Introducere
10.2. Materiale i metode
10.3. Rezultate i discuii
10.4. Concluzii
Capitolul XI PREPARAREA DE NANOCAPSULE POLI(ETER)URETANICE
UTILIZATE CA TRANSPORTORI TRANSDERMICI PENTRU LUPEOL
11.1. Poliuretani cu aplicaii biomedicale
11.2. Metode de preparare
11.3 Rezultate i discuii
Capitolul XII METODE NEINVAZIVE FOLOSITE PENTRU TESTAREA
NANOCAPSULELOR LA NIVEL CUTANAT
12.1. Generaliti
12.2. Condiii de experimentare pe model animal
12.3. Determinri tewametrice
12.4. Determinri pH-metrice
12.5. Determinri sebumetrice
12.6. Determinri mexametrice
12.7. Determinri corneometrice
12.8. Concluzii generale
Capitolul XIII STUDIUL ACIUNII ANTIINFLAMATOARE A LUPEOLULUI CA
ATARE I DIN COMPLECI CU CICLODEXTRINE PE MODEL DIN
URECHE DE OARECE
13.2. Metoda de lucru
13.3. Rezultate i discuii
13.4. Concluzii
Capitolul XIV CONCLUZII GENERALE
ELEMENTE DE ORIGINALITATE
PROPUNERI I RECOMANDRI
BIBLIOGRAFIE
ANEXE
LISTA LUCRRILOR PUBLICATE DIN TEZA DE DOCTORAT
LUCRRI PUBLICATE IN EXTENSO

5
LIST DE ABREVIERI

Acetil Co-A acetil-coenzim A
ADI diizocianat alifatic
ADN acid dezoxiribonucleic
AMPc adenozin monofosfat ciclic
ARNm acid ribonucleic mesager
BA acid betulinic
BCC cancer al celulelor bazale
CAM membrana corioalantoid
CD ciclodextrin
CDL ciclodextrin cu lupeol
CFC cloro-fluoro-carburi
CI complex de incluziune
COX ciclooxigenaza
CSS cromatografie n strat subire
DGK Societatea tiinific german de cosmetice aplicabile
DIMEB 2,6-di-O-metil- ciclodextrina
DL doza letal
DMAPP dimetil alil pirofosfat
DMBA 7,12-dimetilbenz--antracen
DMF dimetilformamid
DMSO dimetilsulfoxid
DSC calorimetrie de scanare diferenial
EDTA acid etilen-diamino-tetraacetic
ERK Extracellular Regulation Kinase
ER estrogen receptor
FIK fosfatidil-inozitol kinaza
FPP farnesil-pirofosfat
FSP farnesil-pirofosfat sintetaza
GDP produs intern brut
GSH glutation redus
HDL lipoproteine cu densitate nalt
HEBCD -ciclodextrina hidroxietilat
HIV virusul imunodeficienei umane
HPB CD hidroxipropil--ciclodextrina
HPLC cromatografie lichid de nalt performan
IFN interferon gama
IPP izopentenil pirofosfat
IR infra-rou
KP produi de malaxare
L/H lipofil / hidrofil
LDL lipoproteine cu densitate sczut (Low density lipoproteins)
L-DOPA L-drihidroxifenilalanina
LT leucotriene
LUS lupeol sintetaza
MAPK Mitogen-activated protein kinase
pMDI 4,4-difenil-metan-diizocianat
MEL Mannosylerythrol lipids
MITF factor transcripional al tirozinazei
6
MO molecul oaspete
Mr masa molecular relativ
MSH Melanostimulation hormone
MTT test de proliferare celular
MVA acid mevalonic
NT nanotub
ODC ornitin decarboxilaza
OSCs oxido-squalenciclaza
PAH hidrocarburi poliaromatice genotoxice
PARP enzima poly-(ADP)ribos-polimerase
PEU poli(eter)uretan
PGE
2
prostaglandina E
2

PKA Protein-kinaza A
PKC proteinkinaza C
PM produi de amestecare fizic
pMDI 4,4-difenil-metan-diizocianat polimeric
PU poliuretan
PVP polivinilpirolidon
QSAR relaie cantitativ structur-activitate
RAID Rapid Acces to Intervention Development, SUA
RAMEB Random metil--ciclodextrina
RES rezonan electronic de spin
RMN rezonan magnetic nuclear
ROS Reactive oxygen species
RP-HPLC Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography
SCC cancer al celulelor scuamoase
SEM Scanning Electron Microscopy
SM spectroscopie de mas
SQE scualen epoxidaza
SQS scualen sintetaza
SUMEB monosuccinil DIMEB
TAS metod termofractografic
TDI toluilen-diizocianat
TEA analiz de evoluie termic
TEM Transmission Electron Microscopy
TEWL pierderea de ap transdermic
TNF Tumor Necrotic Factor
TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetat
TRIMEB 2,3,6-tri-O-metil--ciclodextrina
UV ultraviolet



7

Introducere
n ultimii 40 de ani a crescut mult incidena tumorilor cutanate, ceea ce a determinat
studierea intens a unor compui de sintez i mai ales a unor compui naturali, de origine
vegetal, de tip triterpenic, care prezint proprieti anticanceroase importante.
Se difereniaz dou tipuri de cancer al pielii.
Melanomul, neoplasmul malign al melanocitelor, este recunoscut ca unul din cele
mai agresive cancere ale pielii, cu formarea relativ mare de metastaze i care reprezint astzi
1% din cazurile de cancer din lume. Incidena melanomului continu s creasc cu o vitez de
3-8% pe an, cu toate iniiativele luate n domeniul sntii publice [80, 81].
Att melanomul, ct i epiteliomul, sunt legate direct de expunerea intensiv la soare,
n principal ntre orele 1016 ale zilei [67, 89, 108, 191].
Tumorile cutanate non-melanomice (epiteliomul) pot fi mai ales de tip cancer al
celulelor bazale (engl. Basal Cells Cancer, abrev. BCC), n proporie de 70%, cu malignitate
localizat, care nu dezvolt metastaze i cancer al celulelor scuamoase (engl. Squamous Cells
Cancer, abrev. SCC), care se dezvolt rapid i poate conduce la metastaze [84].
Pentru melanom, o boal ntlnit la est-europeni, este foarte important timpul
interveniei i tipul tumorii; aceea n profunzime conduce la o durat de supravieuire mai
mare dect tumora subire, mai uor de rspndit pe suprafaa mai ntins a pielii [62, 104].

Motivaia cercetrii
n cadrul afeciunilor pielii, cancerul cutanat, alturi de alte tipuri de cancer, ocup ca
importan unul din primele locuri, fiind considerat o problem de sntate public, prin
patologia sa, care impune o abordare medical multidisciplinar ct i prin consecinele
negative asupra sntii pacientului [50].
Astfel, tema de studiu a tezei de doctorat se nscrie n direciile prioritare de cercetare
trasate de Uniunea European, care include tratamentul cancerului printre bolile cu inciden
major [62].
tiina european i naional pune accentul pe prevenie, surse naturale de tratament
i terapii n boli cu inciden major: cancer, melanom, SIDA etc. Cercetarea tinde s
participe la soluionarea primelor dou dintre patologiile amintite, iar studiul lupeolului i
acidului betulinic se afl ntr-o serie variat de testri preclinice, astfel nct prin cercetarea
ntreprins n teza de doctorat se vor completa ariile de lucru care se deruleaz n Europa i n
lume. mbogirea ariei de formulri topice ca i terapii adjuvante n diverse patologii
importante de tipul cancerului cutanat sau nevilor este de asemenea un aspect prioritar pentru
cercetrile moderne. Asocierea unei terapii antiinflamatoare poate ajuta n terapia
antitumoral la nivel cutanat.
Pe plan european i internaional, n stadiul actual lupeolul, acidul betulinic i
celelalte triterpene pentaciclice sunt evaluate doar la nivel experimental, aplicaiile terapeutice
n forme finite fiind prea puin exploatate i propuse [3335, 43]. Aadar, este necesar
valorificarea eficacitii terapeutice a unor forme farmaceutice cu aceti compui. Literatura
citeaz ncercri n acest sens i mai puin soluii terapeutice concrete. Lupeolul se remarc tot
mai mult prin activitatea sa antitumoral i antiinflamatoare. Acestor idei li se mai adaug i
faptul c inclusiv testrile experimentale n melanomul malign, dar i carcinoame, ale acidului
betulinic i lupeolului necesit reevaluare [85, 88].
Dar lupeolul este o triterpen, substan practic insolubil n ap i care cedeaz lent
i nu total din formele farmaceutice. Din aceste considerente, este necesar creterea solubilitii
i a vitezei de dizolvare a lupeolului, care vor conduce la mrirea biodisponibilitii substanei.
8
Unul din cele mai moderne procedee de cretere a solubilitii l constituie includerea
substanei greu solubile n moleculele diferitelor ciclodextrine, procedeu selectat n cercetrile
efectuate n teza de doctorat. Dimensiunea molecular a lupeolului indic faptul c molecula
sa poate fi inclus n cavitatea beta- i gama-ciclodextrinelor, cu formare de compleci de
incluziune stabili.

Obiectivele cercetrii
Obiectivul principal al tezei de doctorat l-a constituit prepararea i studierea unor noi
forme farmaceutice moderne topice cu lupeol pentru uz uman i animal, destinate
tratamentului melanomului pielii.
Cercetrile efectuate au avut ca scop urmtoarele obiective:
1 mrirea disponibilitii lupeolului cu transportori hidrofili, prin prepararea i
caracterizarea unor compleci de incluziune cu beta- i gama-ciclodextrine;
2 evaluarea toxicitii i aciunii antitumorale a acestor compleci pe animale de
laborator;
3 dezvoltarea a dou forme farmaceutice moderne topice, cu aplicare pe piele, cu
aceti compleci de incluziune: unguente tip L/H i suspensii de nanocapsule;
4 utilizarea de metode de testare neinvazive a suspensiei de nanocapsule la nivel
cutanat;
5 teste privind reducerea leziunilor i iritabilitatea la nivelul epidermului
murinelor.
6 studiul aciunii antiinflamatoare a lupeolului ca atare i din complecii cu
ciclodextrinele pe model de ureche de oarece.
Studiul ntreprins n teza de doctorat va avea un nalt grad de multidisciplinaritate,
cuplnd discipline de tipul: farmacognozie, tehnologie farmaceutic, chimie farmaceutic,
histologie, toxicologie, farmacologie, imunologie i fiziologie, spectroscopie molecular.
Toate aceste domenii au un rol esenial pentru finalizarea unui deziderat: formulri
farmaceutice topice moderne cu lupeol pentru terapia carcinomului cutanat, a melanomului i
a inflamaiei.


PARTEA GENERAL

Aceast parte de generaliti este structurat n dou capitole.
Primul capitol sistematizeaz datele din literatura farmaceutic privind triterpenele
pentaciclice i utilizrile sale n terapeutic, cu o prezentare detaliat a lupeolului, compus cu
structur lupanic (fig. 1), cu spectru larg de proprieti care incud n principal: aciunea
antioxidant puternic, antitumoral, antimutagenic, antiinflamatoare i antiaterogen, att in
vitro ct i in vivo [121, 131, 138, 139, 144, 145, 153, 158, 174, 183190].

Fig. 1. Structura chimic a lupeolului
9
Capitolul II include o prezentare succint a ciclodextrinelor utilizate n domeniul
farmaceutic: tipuri de ciclodextrine i caracteristicile acestora, formarea complecilor de
incluziune i procedee de obinere i analiz, utilizrile ciclodextrinelor (tabelul VII) [51, 106,
107, 112, 132, 167-169, 171, 172].
Tabelul VII. Utilizrile ciclodextrinelor n domeniul farmaceutic
UTILIZARILE
CICLODEXTRINELOR
EXEMPLE
1. Controlul solubilitii a. HPBCD a crescut solubilitatea urmtoarelor substane:
- itraconazol (Sporanox), complexarea previne precipitarea n
stomac, rezult forme orale de administrare;
- tolnaftat, solubilitatea a crescut de peste 30 ori;
- miconazol;
- furosemid.
b. Triacetil--CD a redus solubilitatea acidului flufenamic, cu
realizarea unui preparat retard, fr efecte adverse.
2. Optimizarea
biodisponibilitii
a. Dac complexul de incluziune cu ciclodextrina este
caracterizat printr-o constant de stabilitate ridicat sau
ciclodextrina este luat n exces foarte mare se va obine un
efect retard;
b. Dac viteza procesului global de absorbie este dat de
procesul de dizolvare, formarea complexului va duce la
creterea absorbiei i implicit la creterea biodisponibilitii.
3. Stabilizarea substanelor
medicamentoase
a. stabilizarea penicilinei G n soluie apoas cu HPBCD; viteza
degradrii este de 9 ori mai mic dect pentru compusul liber;
b. stabilizarea eritropoetinei cu HPBCD; activitatea s-a pstrat
timp de 10 zile n proporie de 100 % n comparaie cu doar
50 % n absena ciclodextrinei;
c. protejarea nifedipinei i a derivailor si fa de
fotodegradare;
d. reducerea instabilitii prostaglandinelor cu ajutorul beta-
ciclodextrinei.
4. Mascarea efectelor
adverse ale moleculei-
oaspete
a. intensitatea iritaiei provocate de pilocarpin a sczut n urma
complexrii cu beta-ciclodextrin; eliberarea ocular a
substanei a fost semnificativ mbuntit;
b. Impiedicarea fenomenului de liz celular produs de
diclofenac, prin complexarea cu ciclodextrin; este necesar
o cantitate de patru ori mai mare de complex pentru a
provoca aceeai proporie de celule lizate ca i diclofenacul
liber;
c. Evitarea iritaiei gastrice produse de indometacin sau
meloxicam prin complexare cu - ciclodextrin.
5. Reducerea volatilitii
MO
Prin complexarea mentolului cu beta-CD se formeaz un
compus inodor, mentolul ncorporat fiind protejat fa de
volatilizare
6. Conversia substanelor
medicamentoase lichide
n forme cristaline
Obinerea complecilor nitrailor organici folosii n tratamentul
anginei pectorale cu beta-ciclodextrin
7. Dirijarea reaciilor
chimice
Hidroliza alcalin a esterilor acizilor aminobenzoici i a
acidului acetilsalicilic: dac funciunea ester se gsete la
10
interiorul cavitii, viteza reaciei de hidroliz este mai mic;
dac incluziunea este incomplet, viteza reaciei crete,
gruprile -OH secundare ale ciclodextrinei exercitnd un efect
catalitic.
8. Controlul fluorescenei Unii compui prezint o cretere sau descretere a intensitii
fluorescenei dup includerea lor ntr-un complex cu
ciclodextrin; acest proces prezint avantaj n domeniul chimiei
analitice.
9. Utilizarea ciclodextrinelor
ca selectori chirali
a. Electroforeza capilar (EC) a fost folosit pentru separarea
racemicelor a dou simpatomimetice: adrenalina i
noradrenalina, separarea complet fiind realizat n mai puin
de ase minute;
b. EC a fost utilizat pentru testarea eficienei sintezei chirale a
unor derivai de dihidropiridin blocani de calciu;
c. S-a realizat separarea cromatografic a unor aminoacizi,
folosind beta-ciclodextrina ca selector chiral;
d. ciclodextrinele au fost folosite ca selectori chirali n
spectroscopia RMN pentru separarea enantiomerilor
norgestrelului.
10. Utilizarea
ciclodextrinelor ca
molecule carrier
a. derivaii ciclodextrinelor, cum sunt: HPBCD, 6-O-maltozil-
beta-CD i sulfobutil-beta-CD pot fi utilizai ca molecule
carrier n administrarea parenteral;
b. ciclodextrinele peracilate pot fi utilizate ca transportori
hidrofobi care controleaz eliberarea unor substane hidrofile
(peptide, proteine);
c. ciclodextrinele amfifile sau ionizabile pot adera la suprafaa
membranelor celulare, crescnd absorbia substanelor
medicamentoase.



CONTRIBUII PERSONALE


Cercetrile personale au fost structurate n 12 capitole.

Capitolul III. Metodologia cercetrii, include date referitoare la scopul i
obiectivele generale, concrete i poteniale, ale studiilor efectuate n cadrul tezei de doctorat,
metodologia de lucru i statistica aplicat pentru efectuarea cercetrilor.

Capitolul IV. Corelaii QSAR ntre structura triterpenelor pentaciclice
i capacitatea de legare de ciclodextrine.

Modelarea structurii unor molecule bioactive precum acid betulinic, betulin, lupeol
i a unor compui nrudii structural: loganin, morroniside, acid oleanolic, acid ursolic s-a
realizat prin utilizarea de descriptori moleculari van der Waals cu ajutorul crora se stabilesc
relaii cantitative liniare ntre activitatea biologic (benefic sau nociv) a unor compui
organici pe organisme vii i structura lor molecular. Aceti descriptori moleculari au fost
calculai printr-un algoritm Monte Carlo implementat n programul de computer IRS.
11
Pentru a obine o serie de descriptori van der Waals, au fost calculate structurile
moleculare 3D cu ajutorul programului de mecanic molecular MM+ i celui de mecanic
cuantic AM1 din pachetul de programe HyperChem.
n fig. 5 sunt prezentate structurile moleculare 3D optimizate pentru o serie de
compui bioactivi de tip triterpenic:


betulin acid betulinic


lupeol
Fig. 5. Structurile moleculare 3D optimizate ale unor compui triterpenic. Comparaie ntre
substanele etalon betulin, acid betulinic i lupeol
n tabelul IX este redat afinitatea de legare cu -ciclodextrine a unor triterpene.
Tabelul IX. Afinitatea de legare cu -CD a unor triterpene
Steric Acc/Metal Donor Aromatic Total Score Molecule
52.14
50.91
48.21
47.48
45.43
0.72
0.36
0.15
0.28
0.13
0.14
0.00
0.18
0.34
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
53.00
51.27
48.54
48.10
45.55
betulinic acid
ursolic acid
lupeol
betulin
oleanolic acid

Moleculele au fost aranjate n ordinea descresctoare a scorului total care este o
msur a afinitii de legare. Conform rezultatelor cu funcia scor chemgauss2 cea mai mare
afinitate fa de -CD o au triterpenele pentaciclice.

Capitolul V. Prepararea unor compleci de incluziune a lupeolului
cu ciclodextrine transportori hidrofili

Incluziunea n ciclodextrine este o tehnic modern de cretere a biodisponibilitii
agentului activ. Se urmrete obinerea unor formulri semisolide, care conin ca agent activ
compleci de incluziune cu ciclodextrine, respectiv compui ternari, principalele metode de

obinere a acestora fiind malaxarea (
detaliat compuii obinui prin metoda
selectat raportul molar de 1:2
ciclodextrinelor.
Tabelul X. Formul
Cod prob
LUP Lupeol
COM1 Complex de incluziune MBCD cu lupeol
COM1a Complex de incluziune MBCD cu lupeol
COM2 Complex de incluziune HPGCD cu lupeol
COM2a Complex de incluziune HPGCD cu lupeol
COM3 Amestec ternar

5.1. Studii in vitro
S-a utilizat aparatul USP cu palet
Curbele de solubilitate a lupeolului, comparativ cu cele ale complec
redate n figurile 911.
Fig. 9. Curbe de solubilitate comparativ
Fig. 10. Curbele de solubilitate comparativ
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 10 20 30
A
b
s
o
r
b
a
n

a

(
2
1
0

n
m
)
-0,1
6E-16
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 10 20
A
b
s
o
r
b
a
n

a

(
2
1
0

n
m
)
12
malaxarea (kneading) i amestecarea fizic. S-
i prin metoda de malaxare, iar n cazul produ
de 1:2, raport calculat pe baza maselor moleculare ale lupeolului
Formulrile cu lupeol, compleci de incluziune i amestecul ternar
Agent activ Raport molar
Lupeol
Complex de incluziune MBCD cu lupeol
Complex de incluziune MBCD cu lupeol
Complex de incluziune HPGCD cu lupeol
Complex de incluziune HPGCD cu lupeol
Amestec ternar HPGCD cu lupeol i PVP
in vitro de solubilitate a complecilor de incluziune
a utilizat aparatul USP cu palet (DT 706 HH, Erweka, Hausenstamm, Germany
Curbele de solubilitate a lupeolului, comparativ cu cele ale complecilor de incl
Curbe de solubilitate comparativ lupeol vs. COM
Curbele de solubilitate comparativ lupeol vs. COM2
40 50 60 70 80 90 100 110 120
timp, min
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
timp, min
-au ales pentru analiza
de malaxare, iar n cazul produilor binari, a fost
alculat pe baza maselor moleculare ale lupeolului i
i amestecul ternar
Raport molar
-
1:2
1:1
1:2
1:1
1:1:1
ilor de incluziune
H, Erweka, Hausenstamm, Germany).
ilor de incluziune, sunt

lupeol vs. COM1

lupeol vs. COM2
120 130
LUP
COM1a
COM1
120 130
LUP
COM2a
COM2

Fig. 11. Curbele de solubilitate comparativ

Urmrind curbele de solubilitate din figurile anterioare, se pot eviden
caracteristici:
n toate cazurile, forma
lupeol crete gradul de solubilitate;
cea mai bun solubilitate o au formul
(HPGCD) i 6-
COM2;
cele mai mic grad de solubilitate a fost nregistrat n cazul lupeolului, notat cu
codul LUP, utilizat
comparativ;
urmrind influen
mai bune n cazul complec

5.2. Analiza morfologic
Complecii de incluziune ob
scanare [61, 68, 73, 86, 124, 142],
(JEOL Ltd., Japan) care utilizeaz
de 6 kV. Imaginile au fost m
n urma evalurii morfologiei complec
ciclodextrine, s-a evideniat o modificare semnificativ
de incluziune a substanei medicamentoase n cavitatea ciclodextrinelor a avut loc.

5.3. Caracterizarea complec
Am supus analizei att substan
preparai. Cu ajutorul calorimetriei diferen
identificarea complecilor,
al complecilor.
Diagrama DSC a probei cu lupeol prezint
temperaturii de 150C, care corespunde punctului de topire al substan
pic n jurul valorii de 212C, care corespunde descompunerii termice a lupeolului. Pentru
-0,1
6E-16
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 10 20
A
b
s
o
r
b
a
n

a

(
2
1
0

n
m
)
13
Curbele de solubilitate comparativ lupeol vs. COM3
rind curbele de solubilitate din figurile anterioare, se pot eviden
n toate cazurile, formarea complecilor de incluziune de tip ciclodextrine cu
te gradul de solubilitate;
solubilitate o au formulrile binare cu hidroxipropil
-O-maltozil--ciclodextrin (MBCD), notate cu codurile COM1
cele mai mic grad de solubilitate a fost nregistrat n cazul lupeolului, notat cu
codul LUP, utilizat n figurile 911, ca etalon pentru curbele de solubilitate
rind influena raportului molar ciclodextrin : lupeol, s
mai bune n cazul complecilor de incluziune cu raport molar de 1:2
5.2. Analiza morfologic a complecilor de incluziune
ii de incluziune obinui au fost analizai prin spectroscopie electronic
scanare [61, 68, 73, 86, 124, 142], utilizndu-se un microscop electronic model
(JEOL Ltd., Japan) care utilizeaz ca tehnic de scanare JEM-ASID la un voltaj de accelerare
mrite ntre 200-10.000 de ori.
rii morfologiei complecilor de incluziune ai lupeolului cu
iat o modificare semnificativ care duce la concluzia c
ei medicamentoase n cavitatea ciclodextrinelor a avut loc.
5.3. Caracterizarea complecilor de incluziune prin calorimetrie diferen
(cu scanare sau baleiaj)
Am supus analizei att substanele ca atare, ct i complec
i. Cu ajutorul calorimetriei difereniale cu baleiaj, am reu
puritatea probelor, precum i coninutul n componentul principal
Diagrama DSC a probei cu lupeol prezint dou picuri endotermice: unul n jurul
temperaturii de 150C, care corespunde punctului de topire al substan
pic n jurul valorii de 212C, care corespunde descompunerii termice a lupeolului. Pentru
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
timp, min

lupeol vs. COM3
rind curbele de solubilitate din figurile anterioare, se pot evidenia urmtoarele
ilor de incluziune de tip ciclodextrine cu
hidroxipropil--ciclodextrina
, notate cu codurile COM1 i
cele mai mic grad de solubilitate a fost nregistrat n cazul lupeolului, notat cu
11, ca etalon pentru curbele de solubilitate
: lupeol, s-au constatat rezultate
ilor de incluziune cu raport molar de 1:2 [30].
ilor de incluziune
spectroscopie electronic de
se un microscop electronic model JEM 100B
ASID la un voltaj de accelerare
incluziune ai lupeolului cu
care duce la concluzia c fenomenul
ei medicamentoase n cavitatea ciclodextrinelor a avut loc.
n calorimetrie diferenial dinamic
i complecii lor de incluziune
iale cu baleiaj, am reuit s determinm
inutul n componentul principal
picuri endotermice: unul n jurul
temperaturii de 150C, care corespunde punctului de topire al substanei, respectiv al doilea
pic n jurul valorii de 212C, care corespunde descompunerii termice a lupeolului. Pentru
120 130
LUP
COM3
14
complecii de incluziune ai ciclodextrinelor cu lupeol se observ faptul c temperatura la care
picul corespunztor punctului de topire este puin mai mare, probabil din cauza unei
complexri pariale a substanei active n cavitatea ciclodextrinei. Valoarea temperaturii celui
de-al doilea pic rmne neschimbat, ceea ce conduce la ideea c procesul de descompunere a
lupeolului nu poate fi stopat de prezena CD sau a polivinilpirolidonei, chiar i n cazul unei
complexri pariale a substanei active.

Prin analiza termic s-a stabilit domeniul de temperatur n care are loc
descompunerea complecilor cu lupeol. Din curbele DTG se pot distinge dou procese
globale:
a) n prima parte are loc pierderea apei de cristalizare pn la aproximativ 130C;
b) n partea a doua, n intervalul de temperatur 140-180C, are loc arderea
(descompunerea) matricei complexului de incluziune cu eliminarea produilor
gazoi CO i CO
2
cu efect puternic exoterm, ce poate fi nregistrat sau vizualizat
uor doar pe curbe DTA.
Picurile de pe cele 3 curbe, de la 214-215C, sunt caracteristice tenperaturii de topire
a lupeolului. Se observ n cazul acestora o uoar deplasare spre dreapta a punctului de topire
a lupeolului, ceea ce indic o stabilizare a acestuia n interiorul complecilor de incluziune
sintetizai.

5.4. Analiza prin spectroscopie IR (FT-IR)
Compuii de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrinele (conform tabelului X) au fost
ncapsulai n KBr de puritate corespunztoare. Peletele de KBr au fost preparate prin
amestecarea a 3 mg prob cu 500 mg KBr.
Pe spectrul FTIR al probelor analizate se pot observa cu uurin frecvenele
specifice ctorva grupri funcionale, din care amintim: 2960-2850 cm
1
(puternic,
caracteristic ntinderii CH saturat), 1470-1350 cm
1
(o dovad n plus, caracteristic
forfecrii, ndoirii CH saturat), 1260-1000 cm
1
(puternic, caracteristic alcoolilor i eterilor)
i 870-675 (puternic, caracteristic CH din inelele aromatice substituite).
Exist foarte puine deosebiri ntre spectrele celor patru probe studiate, de cea mai
mare importan fiind picul de la 480 cm
1
care lipsete doar n proba COM2. Domeniul 500-
10 cm
1
, infrarou ndeprtat, domeniu adiacent cu regiunea microundelor, de joas energie ce
poate fi utilizat pentru spectroscopie rotaional. n acest domeniu de frecven, se determin
cu uurin molecule biatomice (O
2
, CO, H
2
) sau triatomice (HCN sau HNC). Astfel picul
care apare la 480 cm
1
este caracteristic unei impuriti din prob.
O alt difereniere ntre cele patru probe este estomparea picului de la 930 cm
1
n
cazul probelor COM2 i respectiv COM3, ceea ce indic blocarea gruprii hidroxil a
lupeolului n timpul formrii complecilor de incluziune cu ciclodextrine.
Frecvenele de 2960, 2870 cm
1
sunt caracteristice grupelor metil saturate, iar 2920 i
2850 cm
1
pentru grupele metilen saturate (toate cele patru semnale fiind puternice).
La 1500 cm
1
apare un pic mediu caracteristic dublei legturi C=C din inele
aromatice, iar ntre 1140-1120 cm
1
se ntlnesc vibraii ale gruprii metilen. La 820 cm
1
este
picul corespunztor dublei legturi C=C.
Aceeai diferen ca la spectrul FTIR, proba COM2 nu are picul de la 480 cm
1
.

5.5. Analiza microstructural prin difracie cu raze X
Difractometria cu raze X este o metod util n detectarea complexrii ciclo-
dextrinelor n pulbere sau n stri microcristaline.
15
Spectrele de difracie cu raze X pentru cele patru probe au fost nregistrate cu un
difractometru de raze X DRONUM-1 (Rusia), sistem cu radiaie CuK1 ( = 1.54178 ) pe
intervalul 2-44 / 2. Condiiile de msurare au fost, dup cum urmeaz:
int, Cu, filtru, Ni;
tensiune, 35 kV;
curent, 20 mA;
constant de timp, 1S;
unghi angular 2 < 2 < 44.

Fig. 25. Spectrul de raze X pentru probele studiate

Analiza de difracie cu raze X confirm rezultatele anterioare. Dup cum se poate
vedea n Fig. 25, lupeolul prezint cteva picuri, caracteristice pentru compuii cristalini,
ntruct ele sunt practic absente n complecii de incluziune ciclodextrin cu lupeol analizai
n acest studiu. Faptul c nu are loc dispariia tuturor vrfurilor cristaline duce la concluzia c
un fenomen de tip amorfizare nu are loc, pentru c altfel se poate presupune c aceti
compleci de incluziune dintre substane triterpenice (lupeolul) i ciclodextrine ar avea un
spectru mult diferit fa de spectrul de baz al lupeolului (proba LUP).


Capitolul VI. Formularea i prepararea de unguente cu lupeol i complecii de
incluziune lupeol-ciclodextrine

n cercetarea ntreprins n teza de doctorat avnd n vedere proprietile terapeutice
poteniale ale lupeolului i complecilor si de incluziune, am selectat o baz de unguent pe
baz de polietilenglicol (PEG) pentru a prepara 4 (patru) variante de unguente.
n scopul realizrii unor formule topice cu aplicare epicutanat, am selectat o baz de
unguent tip emulsie L/H, cu polietilenglicol 4000, transcutol
R
, labrasol

, 2-propanol,
izopropil miristat, n care s-a inclus 5% lupeol, respectiv complecii de incluziune ai
lupeolului cu ciclodextrinele (tabelul XI).
16
Prepararea unguentelor s-a efectuat n condiii de laborator. Toate formulrile au fost
caracterizate conform prevederilor FR X i suplimente, ct i Ph. Eur. 7
th
2010 [210, 211]. S-
au urmrit: aspectul, omogenitatea, pH-ul, comportarea reologic, capacitatea de adeziune i
cedarea in vitro a lupeolului, comparativ cu complecii de incluziune.

Tabelul XI. Compoziia bazei de unguent emulsie L/H
Substana Cantitate (g)
Agent activ 5,00
2-propanol 37,30
Transcutol
R
9,30
Miristat de izopropil 9,30
Labrasol 0,30
PEG 4000 38,80
Total 100,00

S-au formulat 4 (patru) variante de unguente tip emulsie L/H (conform tabelului
XII), care conin 5% lupeol, respectiv complexul de incluziune al lupeolului cu
ciclodextrinele, n cantitate echivalent cu lupeolul.
Tabelul XII. Formulri de unguente cu lupeol i complecii de incluziune cu ciclodextrine
Ingrediente (g)
Formula
I
(LUP)
II
(COM1)
III
(COM2)
IV
(COM3)
Lupeol 5
COM1 (conf. tabelul X) echiv. 5
COM2 (conf. tabelul X) echiv. 5
COM3 (conf. tabelul X) echiv. 5
2-propanol 37,30 37,30 37,30 37,30
Transcutol
R
9,30 9,30 9,30 9,30
Miristat de izopropil 9,30 9,30 9,30 9,30
Labrasol 0,30 0,30 0,30 0,30
PEG 4000 38,80 38,80 38,80 38,80
Total 100 100 100 100

Prepararea unguentelor impune condiii specifice pentru a realiza unguente omogene.
S-au realizat unguente-emulsii tip L/H, n care faza lipofil: lupeol, miristat de
izopropil, au fost emulsionate cu transcutol
R
i labrasol

n PEG 4000.

Capitolul VII. Condiiile de calitate i controlul fizico-chimic al unguentelor cu
lupeol i complecii de incluziune lupeol-ciclodextrine

Aprecierea calitii unguentelor a avut n vedere condiiile pe care trebuie s le
ndeplineasc aceste preparate topice, semisolide, care sunt oficializate de FR X i suplimente
i de Ph. Eur. 7
th
, n monografia de generaliti: Preparate semisolide pentru aplicaii
cutanate.
Am efectuat un control macroscopic, fizico-chimic i farmacotehnic.
Controlul fizico-chimic se refer la studiile de aspect, omogenitate, culoare, gust,
miros, comportare reologic, viscozitate i o serie de teste specifice pentru produsele topice
aplicate pe piele, ca: evaluarea senzorial, capacitatea hidratant, pH-ul unguentelor.
17
Unguentele sunt omogene, de culoare alb, fr gust i fr miros. Formularea I, cu
lupeol, nu se dizolv total n ap la temperatura camerei, iar formulele IIIV, care conin complecii
de incluziune, au un grad de lavabilitate corespunztor, respectiv se spal uor fr spun.
pH-ul unguentelor se ncadreaz n valorile cuprinse ntre 6,36,9, un pH uor acid,
adecvat pH-ului pielii (tabelul XIII).
Tabelul XIII. Caracteristicile unguentelor formulate (conform Tabelul XII)
Formula Aspect Culoare Gust, miros Solubilitate pH
I omogen alb fr
nu se dizolv total n ap la
tC camerei
6,3
II omogen alb fr
se dizolv n ap la tC
camerei
6,9
III omogen alb fr
se dizolv n ap la tC
camerei
6,8
IV omogen alb fr
se dizolv n ap la tC
camerei
6,8

Formula de unguent cu lupeol a prezentat o consisten intermediar (grad maxim de
penetrare de 36 4,02 mm), iar formulele de unguent cu compleci de incluziune au prezentat
consistena cea mai crescut (25 2,8 mm).
Formula de unguent cu lupeol a prezentat o capacitate de ntindere intermediar
(7010 596 mm
2
), iar formulele cu compleci de incluziune au prezentat cea mai redus
capacitate de ntindere, deci consistena cea mai crescut.
Capacitatea de ntindere i aspectele reologice au fost n toate cele patru cazuri
corespunztoare pentru o formul topic, aplicat pe piele.
Rezultatele obinute sunt n concordan cu prevederile FR X i Ph. Eur. 7
th
[210,
211]; unguentele ndeplinesc condiiile de calitate impuse de aceste normative, sunt
fiziologice, au valori de pH apropiate de pH-ul pielii (4,26,5).

7.2. Analiza caracterelor reologice
Comportarea reologic a gelurilor permite caracterizarea fizico-mecanic a acestora.
Figurile 2633 redau curbele de curgere i viscozitate pentru cele patru unguente
studiate. Comportarea reologic a unguentelor formulate permite caracterizarea fizico-
mecanic a acestora.
Din analiza comparativ a reogramelor, respectiv a curbelor de viscozitate ale
unguentului cu lupeol i a unguentelor cu complecii de incluziune ai lupeolului cu
ciclodextrine (formulele II, III i IV), se constat urmtoarele:
toate formulele de unguente, inclusiv baza de unguent, imediat dup preparare
prezint un comportament reologic dilatant, iar dup un timp de depozitare se
formeaz o reea continu cu structur de gel, specific polietilenglicolului, care
confer sistemului o comportare reologic plastic;
toate formulrile prezint prag de curgere;
viteza de curgere crete cu creterea forei de forfecare;
toate unguentele prezint o bucl de histerez care are valori foarte apropiate la
toate formulrile;
viscozitatea unguentelor scade progresiv cu creterea vitezei de forfecare;
viscozitatea formulei I (unguentul cu lupeol) a fost cu foarte puin mai redus
dect aceea a formulrilor II, III, IV n care s-au introdus cei trei compleci de
incluziune lupeol-ciclodextrine;
n toate formulrile se observ c valorile viscozitii sunt mai mari dect n cazul
bazei de unguent.


Fig. 26. Curba de curgere a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent
Fig. 27. Curba de curgere a formulei II comparativ cu baza de unguent
Fig. 28. Curba de curgere a formulei III comparativ cu baza de unguent
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 20
t
e
n
s
i
u
n
e

d
e

f
o
r
f
e
c
a
r
e
,

P
a
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 20
t
e
n
s
i
u
n
e

d
e

f
o
r
f
e
c
a
r
e
,

P
a
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 20
t
e
n
s
i
u
n
e

d
e

f
o
r
f
e
c
a
r
e
,

P
a
18
Curba de curgere a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent
Curba de curgere a formulei II comparativ cu baza de unguent
Curba de curgere a formulei III comparativ cu baza de unguent
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s

Curba de curgere a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent

Curba de curgere a formulei II comparativ cu baza de unguent

Curba de curgere a formulei III comparativ cu baza de unguent
120
LUP
baza
120
COM1
baza
120
COM2
baza

Fig. 29. Curba de curgere a formulei IV comparativ cu baza de unguent
Fig. 30. Curba de viscozitate a formulei I
Fig. 31. Curba de viscozitate a fo
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 20
t
e
n
s
i
u
n
e

d
e

f
o
r
f
e
c
a
r
e
,

P
a
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20
v

s
c
o
z
i
t
a
t
e
,

P
a

s
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20
v

s
c
o
z
i
t
a
t
e
,

P
a

s
19
Curba de curgere a formulei IV comparativ cu baza de unguent
Curba de viscozitate a formulei I cu lupeol comparativ cu baza de unguent
Curba de viscozitate a formulei II comparativ cu baza de unguent
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s

Curba de curgere a formulei IV comparativ cu baza de unguent

comparativ cu baza de unguent

rmulei II comparativ cu baza de unguent
120
COM3
baza
120
LUP
baza
120
COM1
baza

Fig. 32. Curba de viscozitate a formulei
Fig. 33. Curba de viscozitate a formulei IV comparativ cu baza de unguent
Analiza reologic indic
care se aplic pe piele ct
transport.

Capitolul VIII. Studii privind determinarea disponibilit
lupeolului i a complec
n teza de doctorat pentru studierea disponibilit
formulrile propuse, am ales o metod
Cercetrile privind cedarea substan
membrane de dializ:
metoda in vitro
metoda ex vivo
U.V.;
metoda ex vivo
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20
v

s
c
o
z
i
t
a
t
e
,

P
a

s
0
10
20
30
40
50
60
70
0 20
v

s
c
o
z
i
t
a
t
e
,

P
a

s
20
Curba de viscozitate a formulei III comparativ cu baza de unguent
Curba de viscozitate a formulei IV comparativ cu baza de unguent
indic o comportare la curgere de tip plastic, adecvat
pe piele ct i comportrii n timpul procesului de fabrica
. Studii privind determinarea disponibilitii in vitro
i a complecilor de incluziune cu transportori hidrofili
n teza de doctorat pentru studierea disponibilitii in vitro
rile propuse, am ales o metod de cedare care utilizeaz celula Franz.
rile privind cedarea substanei au fost efectuate concomi
pe membran filtrant artificial poroas (POROFIL);
ex vivo pe membran natural, piele de obolan neexpus
pe membran natural, piele de obolan expus
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s
40 60 80 100
viteza de forfecare, 1/s

III comparativ cu baza de unguent

Curba de viscozitate a formulei IV comparativ cu baza de unguent
plastic, adecvat formulrilor
rii n timpul procesului de fabricaie, depozitare i
in vitro din unguente a
luziune cu transportori hidrofili
in vitro a lupeolului din
celula Franz.
ei au fost efectuate concomitent pe trei tipuri de
(POROFIL);
obolan neexpus la radiaii
obolan expus la radiaii U.V.
120
COM2
baza
120
COM3
baza

Pentru studiile de penetrabilitate
vertical celul de difuzie Franz (Hanson Microette TM Topical
System, Hanson Research Corporation,
Din fiecare formulare farmaceutic
XII) cte 0,5 grame de prob
(in vitro), respectiv pe piele de
(expUV), respectiv piele neexpus
Msurtorile cantitative de agent activ au fost realizate cu un spectrofotometru UV
VIS tip Hewlett Packard 8453
DAD).
Pentru determinarea lungimii de und
n UV pentru lupeol (fig. 35

Fig.

Curba de calibrare (etalonare) a lupeolului este redat
Fig. 36. Curba de calibrare a lupeolului n tampon fosfat cu pH=6,8
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

21
8.1.2.Material i metod
Pentru studiile de penetrabilitate i de difuzie prin membran a fost utilizat un sistem
de difuzie Franz (Hanson Microette TM Topical & Transdermal
System, Hanson Research Corporation, S.U.A.).
Din fiecare formulare farmaceutic semisolid obinut (notat
II) cte 0,5 grame de prob ca faz donoare au fost plasate pe o membran
v pe piele de obolan (rasa Spraque dawley) expus
(expUV), respectiv piele neexpus la radiaie UVB (nexUV) (ex vivo).
torile cantitative de agent activ au fost realizate cu un spectrofotometru UV
tip Hewlett Packard 8453, prevzut cu detector cu multidiode (Diode Array Detector
Pentru determinarea lungimii de und de detecie, s-a nregistrat spectrul de absorb
fig. 35). Maximul de absorbie se obine la lungimea de und
35. Spectrul de absorbie a lupeolului n UV
Curba de calibrare (etalonare) a lupeolului este redat n fig. 36.
Curba de calibrare a lupeolului n tampon fosfat cu pH=6,8
y = 0.0177x + 0.0164
R
2
= 0.9966
5 10 15 20 25 30
Concentraie (g/mL)
a fost utilizat un sistem
& Transdermal Diffusion Cell
(notat conform tabelului
pe o membran filtrant Porafil
) expus la lamp UVB

torile cantitative de agent activ au fost realizate cu un spectrofotometru UV-
cu detector cu multidiode (Diode Array Detector
a nregistrat spectrul de absorbie
ine la lungimea de und de 211 nm.

ie a lupeolului n UV


Curba de calibrare a lupeolului n tampon fosfat cu pH=6,8
30 35

n tabelul XXIV
privind procentul de lupeol cedat din formul
semipermeabile.
Tabelul XXIV.
Timp
(ore)
F I (LUP)
mem.art nexUV exUV
0,5 35 41 32
1 40 48 38
2 45 53 45
3 51 60 50
4 59 68 56
5 62 71 61
6 67 75 64

Fig. 41. Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I
Din analiza fig. 41
cazul formulei IV (COM3), urmat
comparativ cu lupeolul neinclus n transportori, unde cedarea este de 67% (formula I).

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1
L
u
p
e
o
l

c
e
d
a
t

%
22
n tabelul XXIV i fig. 4143 sunt prezentate datele experimentale, cumulative
privind procentul de lupeol cedat din formulrile studiate, prin cele tre
Cantitate % cedat de lupeol din formulrile semisolide
F II (COM1) F III (COM2)
exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV
37 38 35 32 35 30
53 55 49 50 55 48
58 65 52 59 66 53
63 71 54 65 70 54
67 76 56 70 77 57
71 79 59 72 79 59
73 84 61 73 83 60
Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I
prin membran artificial
fig. 41 se constat c cea mai mare cedare de lupeol, de 85%, se ob
cazul formulei IV (COM3), urmat de formulele II i III (COM1
comparativ cu lupeolul neinclus n transportori, unde cedarea este de 67% (formula I).
2 3 4 5 6
43 sunt prezentate datele experimentale, cumulative
rile studiate, prin cele trei tipuri de membrane
rile semisolide
F IV (COM3)
exUV mem.art nexUV exUV
40 42 37
55 59 45
67 71 52
75 81 59
79 88 62
83 90 63
85 92 65

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele IIV)
cea mai mare cedare de lupeol, de 85%, se obine n
III (COM1 i COM2) cu 73%,
comparativ cu lupeolul neinclus n transportori, unde cedarea este de 67% (formula I).
6
Timp (ore)
F1
F2
F3
F4

Fig. 42. Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I
prin membran
Analiznd datele experimental
cedare, de 92%, se obine tot n cazul formulei IV (COM3), urmat
84%, formula III (COM2) cu 83%

Fig. 43. Cedarea in vitro a lupeolului d
prin membran
n acest caz se constat
urmat de formula I (LUP) de 64%
(COM2) de 60%.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1
L
u
p
e
o
l

c
e
d
a
t

%
0
10
20
30
40
50
60
70
1
L
u
p
e
o
l

c
e
d
a
t

%
23
Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I
prin membran de obolan neexpuns la UV
Analiznd datele experimentale reprezentate n fig. 42, se constat
ine tot n cazul formulei IV (COM3), urmat de formula II (COM1) cu
84%, formula III (COM2) cu 83% i pe ultimul loc formula I, cu 75%.
Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele I
prin membran de obolan expuns la UV
n acest caz se constat o cedare de 65% a lupeolului din formula IV (COM3),
de formula I (LUP) de 64% i apoi de formula II (COM1) cu 61%
2 3 4 5 6
2 3 4 5 6

Cedarea in vitro a lupeolului din unguente (formulele IIV)
, se constat c cea mai mare
de formula II (COM1) cu

in unguente (formulele IIV)
o cedare de 65% a lupeolului din formula IV (COM3),
i apoi de formula II (COM1) cu 61% i formula III
Timp (ore)
F1
F2
F3
F4
Timp (ore)
F1
F2
F3
F4
24
8.1.4. Concluzii
n toate cazurile, formarea complecilor de incluziune cu ciclodextrine i lupeol
crete cantitatea de agent activ, lupeol, care difuzeaz prin membran, indiferent
de ce tip de membran se utilizeaz;
cantitile cele mai mari de agent activ difuzat se nregistreaz n cazul pielii de
obolan neexpus la radiaie UVB, iar cele mai mici cantiti de agent activ difuzat
se nregistreaz n cazul pielii de obolan expus la UV;
cea mai bun difuzie s-a nregistrat n cazul formulrii semisolide ternare cu poli-
vinilpirolidon (peste 90% lupeol difuzat), cantiti similare au fost nregistrate n
cazul unguentelor care conin compleci ciclodextrin cu lupeol, notate COM1,
respectiv COM2 (aproximativ 85% lupeol difuzat n cazul utilizrii pielii de
obolan neexpus la radiaie UV), iar cele mai mici valori au fost obinute pentru
unguentul cu lupeol neinclus n transportori hidrofili.
n concluzie, asocierea lupeolului cu ciclodextrine prin formarea de compleci de
incluziune binari sau ternari alturi de polivinilpirolidon, crete cantitatea de agent activ,
lupeol, care difuzeaz prin piele.

8.2. Studiul cineticii de cedare in vitro din unguente a lupeolului
i a complecilor de incluziune
Studiul cineticii de cedare a substanei medicamentoase din forma farmaceutic
prezint o importan deosebit n caracterizarea formei farmaceutice din punctul de vedere al
profilului de cedare. De asemenea, prin numrul mare de date i constante caracteristice
modelului obinut, cercettorul intr n posesia unor informaii definitorii pentru procesul de
optimizare a formulrii.
Din literatur au fost selectate n vederea fitrii 4 (patru) modele matematice,
corespunztoare unor mecanisme de cedare diferite: 1. modelul liniar (cedare de ordinul zero);
2. modelul exponenial (cedare de ordinul unu); 3. modelul Higuchi; 4. modelul Korsmeyer-
Peppas. Datele obinute pe cele 4 modele matematice sunt redate n tabelele XXVII-XXX.
Tabelul XXVII. Parametrii ecuaiilor modelului liniar de cedare a lupeolului i a
complecilor de incluziune din formulele I IV.
Var.
F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)
mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV
K
0
0.1368 0.1569 0.1323 0.1575 0.1775 0.1334 0.1597 0.1770 0.1330 0.1836 0.1993 0.1422
R
2
0.7622 0.7247 0.7696 0.6692 0.7221 0.5756 0.7056 0.7221 0.5982 0.7200 0.7334 0.6550

Tabelul XXVIII. Parametrii ecuaiilor modelului exponenial de cedare a lupeolului i a
complecilor de incluziune din formulele I IV.
Var.
F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)
mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV
K 0.25 0.4 0.2 0.4 0.45 0.3 0.4 0.45 0.3 0.5 0.6 0.4
R
2
0.8501 0.8665 0.8494 0.8514 0.9101 0.7294 0.8974 0.9165 0.7630 0.9287 0.9569 0.8453
25
Tabelul XXIX. Parametrii ecuaiilor modelului Higuci de cedare a lupeolului i a
complecilor de incluziune din formulele I IV.
Var.
F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)
mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV
K
H
29.6500 34.1554 28.6529 34.5061 38.6594 29.4961 34.8120 38.5250 29.3300 39.9879 43.3490 31.2085
R
2
0.9346 0.9167 0.9450 0.8890 0.9246 0.8188 0.9150 0.9235 0.8377 0.9256 0.9331 0.8821
Tabelul XXX. Parametrii ecuaiilor modelului Korsmeyer Peppas de cedare a lupeolului i
a complecilor de incluziune din formulele I IV.
Var.
F I (LUP) F II (COM1) F III (COM2) F IV (COM3)
mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV mem.art nexUV exUV
n 0.28 0.28 0.3 0.26 0.28 0.26 0.28 0.28 0.22 0.28 0.28 0.24
K
P
39.442 45.5481 37.1994 47.2181 51.4734 40.6148 46.3478 51.2475 42.1516 53.2417 51.6472 43.7628
R
2
0.9917 0.9936 0.9974 0.9887 0.9921 0.9663 0.9825 0.9844 0.9679 0.9932 0.9917 0.9960

n fig. 5659 redm parametrii ecuaiilor modelului Korsmeyer-Peppas de cedare a
lupeolului i a complecilor de incluziune COM1, COM2, COM3 din formulrile IIV.

Fig. 56. Fitarea profilului de cedare a lupeolului din F I (LUP)
conform modelului Korsmeyer Peppas

26

Fig. 57. Fitarea profilului de cedare a complexului din F II (COM1)
conform modelului Korsmeyer Peppas


Fig. 58. Fitarea profilului de cedare a complexului din F III (COM2)
conform modelului Korsmeyer Peppas
27

Fig. 59. Fitarea profilului de cedare a complexului din F IV (COM3)
conform modelului Korsmeyer Peppas

8.2.4. Concluzii
Rezultatele obinute n cadrul acestor studii au evideniat faptul c lupeolul este
cedat din formula studiat printr-un proces de difuzie indiferent de membrana folosit n
cadrul testului de dizolvare. n cazul complecilor de incluziune, rezultate optime s-au obinut
doar n cazul fitrii pe modelul de cedare Korsmeyer Peppas, pentru n = 0,3. Astfel, apreciem
c n cazul acestor compleci, prin procesul de incluziune au fost modificate caracteristicile
de penetraie i solubilitatea lupeolului.


Capitolul IX. Testarea aciunii antitumorale
a lupeolului i a complecilor de incluziune
Studiul unguentelor formulate (unguentul cu lupeol, respectiv unguentele cu
complecii de incluziune ai ciclodextrinelor cu lupeol) cuprinde i o parte de testare pe animal
de laborator [22, 180, 196, 198, 199, 200, 208].
Obiectivul acestui studiu a fost compararea activitii anticanceroase a produselor
topice pe baz de lupeol sau compleci ciclodextrin-lupeol.
S-au utilizat oricei, la care s-a aplicat DMBA (7,12-dimetil-benzantracen, iniiator de
cancer) i TPA (12-O-tetradecanoilphorbol-13-acetat) ca promotor de tumori). Pe zonele afectate
s-au aplicat unguentele IIV. Pentru o evaluare detaliat a refacerii pielii s-a utilizat un
mexametru model Courage-Khazaka (fig. 63).


Fig. 63. Valorile melaninei
de aplicare a unguentelor (formulele I
Nu au fost constatate modific
a eritemului (nivelului de hemoglobin
discutat faptul c cele mai bune valori n privin
nregistrat n cazul unguentului formulat
COM3 (formula IV).

Capitolul X. Evaluarea citotoxicit
comparativ cu unele triterpene pentaciclice
Prezentul studiu const
induse de compuii analiza
produse la nivelul plexului vascular, in
citotoxicitatea lor pe linii celulare specifice: A431 (cancer de piele), A2058 (melanom uman),
B16 (melanom de oarece)
Conform unor studii recente BA
anticanceroase care acioneaz
difereniatori keratinocitari

Testul MTT
Efectul antiproliferativ al compu
celulare umane: HeLa (adenocarcinomul de colul uterin)
utilizarea testului MTT (bromur
citat frecvent prin Mosmann [
Metoda evalurii pe membrana corioalantoid
Metoda aleas pentru evaluarea celor doi fitocompu
lor n modelarea procesului angiogenic a fost testare
puiului de gain (Gallus gallus domesticus
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
V
a
l
o
a
r
e

a
r
b
i
t
r
a
r

28
Valorile melaninei i eritemului la finalul experimentului
de aplicare a unguentelor (formulele I-IV)
Nu au fost constatate modificri majore ale valorilor melaninei (pigment
a eritemului (nivelului de hemoglobin) ntre startul i finalul experimentului. Totu
cele mai bune valori n privina unei creteri reduse
unguentului formulat pe baz de complex de incluziune ternar, notat
. Evaluarea citotoxicitii i a aciunii antiangiogenice a lupeolului
comparativ cu unele triterpene pentaciclice
ezentul studiu const ntr-o evaluare preliminar a modific
ii analizai la nivelul esutului mezenchimal, al epiteliului corionic
produse la nivelul plexului vascular, interpretate la nivel macro i analiza com
citotoxicitatea lor pe linii celulare specifice: A431 (cancer de piele), A2058 (melanom uman),
oarece) i HuMsc (celule stem mezenchimale ca indice de toxicitate).
Conform unor studii recente BA i derivai ai si sunt menionai ca o nou
ioneaz la nivelul factorilor de transcripie, ct
iatori keratinocitari i ageni citotoxici importani [115, 120, 122, 182
10.2. Materiale i metode
Efectul antiproliferativ al compuilor testai a fost evaluat in vitro
celulare umane: HeLa (adenocarcinomul de colul uterin) i A431 (cancer cutanat), prin
utilizarea testului MTT (bromur de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoli
citat frecvent prin Mosmann [115].
rii pe membrana corioalantoid avian (CAM)
pentru evaluarea celor doi fitocompui n ceea ce prive
lor n modelarea procesului angiogenic a fost testarea lor pe membrana corioalantoid
Gallus gallus domesticus).
melanina i eritemul

i eritemului la finalul experimentului
ri majore ale valorilor melaninei (pigmentrii pielii) i
i finalul experimentului. Totui trebuie
teri reduse a eritemului s-au
de complex de incluziune ternar, notat
iunii antiangiogenice a lupeolului
a modificrilor morfologice
esutului mezenchimal, al epiteliului corionic i la cele
i analiza comparativ cu
citotoxicitatea lor pe linii celulare specifice: A431 (cancer de piele), A2058 (melanom uman),
i HuMsc (celule stem mezenchimale ca indice de toxicitate).
i ca o nou clas de molecule
la nivelul factorilor de transcripie, ct i ca ageni
i [115, 120, 122, 182].
in vitro, pe dou linii
i A431 (cancer cutanat), prin
difeniltetrazolin) indicat i
(CAM)
i n ceea ce privete implicaiile
mbrana corioalantoid a
LUP
COM1
COM2
COM3

Evaluarea procesului angiogenic
Preparatele au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Nikon Eclipse E600,
imaginile fiind achiziionate n sistem JPEG
Fotografiile membranei corioalantoide
probelor au fost efectuate cu aparat fotografic Sony Cybershot 7,2 megapixeli.
Evoluia reelei vasculare a membranei corioalantoide a fost studiat
semi-cantitative. Metoda hot spot a servit la identificarea ariilor de pe sec
remarcat prin prezena unei re
anormal ca form de vase de snge. n esen
metod de observare a angiogenezei. Orice compus care reduce sau modific
vascular a embrionului este un compus cu poten
n fig. 65 redm activitatea antiproliferativ
Fig. 65. Activitatea antiproliferativ
Aciunea lupeolului
betulina este n cele mai multe cazuri dep
Testul MTT a fost utilizat
lupeolului comparativ cu complexul de incluziune lupeol
HeLa (adenocarcinomul de col uterin)
Fig. 76. Activitatea in vitro lupeol
pe celule HeLA (0,2 mg/mL solu
%

L
u
p
e
o
l

29
Evaluarea procesului angiogenic
Preparatele au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Nikon Eclipse E600,
ionate n sistem JPEG i prelucrate statistic.
tografiile membranei corioalantoide in ovo, efectuate zilnic dup
probelor au fost efectuate cu aparat fotografic Sony Cybershot 7,2 megapixeli.
elei vasculare a membranei corioalantoide a fost studiat
ative. Metoda hot spot a servit la identificarea ariilor de pe sec
a unei reele vasculare mai slab dezvoltate, cu un num
de vase de snge. n esen studiul const n aplicarea evalu
de observare a angiogenezei. Orice compus care reduce sau modific
a embrionului este un compus cu potenial antiangiogenic.
m activitatea antiproliferativ a triterpenelor pe linia celular
Activitatea antiproliferativ a triterpenelor studiate
pe linia celular A431 diluia 300
lupeolului dei nu este att de remarcabil comparativ cu
este n cele mai multe cazuri depete media. Toicitatea compusului este redus
Testul MTT a fost utilizat i pentru evaluarea efectului antiproliferativ
lupeolului comparativ cu complexul de incluziune lupeol--CD, pe dou
HeLa (adenocarcinomul de col uterin) i A 431 (cancer cutanat) (fig. 76
Activitatea in vitro lupeol--ciclodextrin comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)
pe celule HeLA (0,2 mg/mL soluie stoc)
Preparatele au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Nikon Eclipse E600,
, efectuate zilnic dup administrarea
probelor au fost efectuate cu aparat fotografic Sony Cybershot 7,2 megapixeli.
elei vasculare a membranei corioalantoide a fost studiat folosind metode
ative. Metoda hot spot a servit la identificarea ariilor de pe seciuni care au s-au
ele vasculare mai slab dezvoltate, cu un numr redus sau
n aplicarea evalurii vasculare ca
de observare a angiogenezei. Orice compus care reduce sau modific reeaua
a triterpenelor pe linia celular A 431.

a triterpenelor studiate
comparativ cu acidul betulinic i
compusului este redus.
i pentru evaluarea efectului antiproliferativ in vitro, al
CD, pe dou linii celulare umane:
cutanat) (fig. 76 i 77).

comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)
Timp

Fig. 77. Activitatea in vitro lupeol
pe celule HeLA (0,5 mg/mL solu
1. Triterpenele pentaciclice prezint
aciune pe linii celulare spec
2. Dintre triterpenele pentaciclice acidul betulinic betulina
citotoxic cea mai intens

Capitolul XI. Prepararea de nanocapsule poli(
nglobarea de substan
la dimensiune ajustabil prin simpla modificare a masei moleculare a precursorilor este o
noutate absolut pe plan interna
unor medicamente sau preparate derm
farmaceutice i cosmetice justific
Pentru prepararea nanoc
hidroxilic (diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o component
semiprepolimer izocianic pe baz
Nanocapsulele sunt analizate prin calorimetrie de scanare diferen
detectrii unei modificri ale propriet
Morfologia particulelor a fost examinat
Hitachi 2400S (Hitachi Scientific Ltd, Japonia).
Ex. n fig. 93 este redat

%

L
u
p
e
o
l

30
Activitatea in vitro lupeol--ciclodextrin comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)
pe celule HeLA (0,5 mg/mL soluie stoc)

10.4. Concluzii
Triterpenele pentaciclice prezint o activitate antitumoral important
iune pe linii celulare specifice dar i pe oul embrionat.
Dintre triterpenele pentaciclice acidul betulinic betulina i acidul ursolic au activitatea
cea mai intens dar nu trebuie neglijat nici lupeolul i acidul oleanolic.

. Prepararea de nanocapsule poli(eter)uretanice utilizate ca transportori
transdermici pentru lupeol
nglobarea de substane biologic active n nanocapsule polieter
prin simpla modificare a masei moleculare a precursorilor este o
pe plan internaional. Interesul pentru acest mijloc de transport transdermic a
unor medicamente sau preparate dermato-cosmetice din partea produc
i cosmetice justific studiul n acest domeniu.
Pentru prepararea nanocapsulelor poli(eter)uretanice se utilizeaz
(diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o component
semiprepolimer izocianic pe baz de lizin-diizocianat), solvent i surfactan
sunt analizate prin calorimetrie de scanare diferen
ri ale proprietilor termice comparativ cu substan
Morfologia particulelor a fost examinat utiliznd microscopul de scanare electronic
Hitachi 2400S (Hitachi Scientific Ltd, Japonia).
Ex. n fig. 93 este redat imaginea SEM a probei COM2.

comparativ cu lupeol (1 mg/mL DMSO)
important. Ele pot dovedi
i acidul ursolic au activitatea
i acidul oleanolic.
eter)uretanice utilizate ca transportori
e biologic active n nanocapsule polieter-uretanice sintetizate
prin simpla modificare a masei moleculare a precursorilor este o
ional. Interesul pentru acest mijloc de transport transdermic a
cosmetice din partea productorilor de produse
uretanice se utilizeaz o component
(diol, poliol sau cel mai frecvent amestecul lor), o component izocianic (un
i surfactani.
sunt analizate prin calorimetrie de scanare diferenial n scopul
ilor termice comparativ cu substanele pure.
utiliznd microscopul de scanare electronic
Timp
31

Fig. 93. Imaginea SEM a probei COM2 la scara 2 m
Valorile dimensiunilor, potenialului zeta, solubilitatea n ap i respectiv aceton i
pH-ul soluiilor apoase de nanocapsule (obinute prin redizolvare) sunt prezentate n tabelele
XXXIIXXXIV.

Tabelul XXXII. Valorile dimensiunilor i potenialul zeta pentru nanocapsulele preparate

Diametru (nm)
Medie, deviaie standard
Potenial zeta (mV)
Medie, deviaie standard
MART 601 142 28,4 6,2
LUP1 623 122 31,2 5,2

Tabelul XXXIII. Solubilitatea nanocapsulelor n ap distilat i aceton (g/100 g, 25C)
Ap Aceton
MART 8 10
-2
4 10
-2

LUP1 10
-1
4 10
-2

LUP2 7 10
-2
3 10
-2

LUP3 8 10
-2
4 10
-2

COM1 7 10
-2
5 10
-2

COM2 8 10
-2
4 10
-2

COM3 9 10
-2
5 10
-2

32
Tabelul XXXIV. pH-ul soluiilor apoase de nanocapsule (7 10
2
g / 100 g, 25C)
pH
MART 7,2
LUP1 7,4
LUP2 7,1
LUP3 6,9
COM1 6,9
COM2 7,0
COM3 6,8

Din datele cuprinse n tabele, se desprinde faptul c introducerea substanei active n
cadrul preparrii nanocapsulelor, nu afecteaz diametrul particulelor, stabilitatea acestora fa
de tendina de aglomerare, solubilitatea lor, respectiv pH-ul soluiilor obinute prin
redizolvare. Putem observa c exist diferene ntre valorile din aceste tabele, dar c variaia
acestor valori este mic, neliniar i nu poate fi corelat cu structura substanei active.


Capitolul XII. Metode neinvazive folosite pentru testarea nanocapsulelor la nivel
cutanat
Nanocapsulele cu lupeol i respectiv complecii de incluziune a lupeolului cu
ciclodextrine au fost analizai prin urmtoarele metode: mexametrie, sebumetrie, corneometrie,
skin-pH-metru, TEWA-metrie ct i n condiii de experimentare pe model animal (tabelul
XXXVI).
Tabelul XXXVI. Loturile de oareci notate n funcie de
substana activ inclus n nanocapsule
Lotul Descriere
MART Se aplic doar aceton
LUP1 Se aplic nanocapsule cu lupeol (conc. 30 mg/3 mL)
LUP2 Se aplic nanocapsule cu lupeol (conc. 100 mg/3 mL)
LUP3 Se aplic nanocapsule cu lupeol (conc. 200 mg/3 mL)
COM1 Se aplic nanocapsule cu complex ciclodextrin-lupeol (conc. 30 mg/3 mL)
COM2 Se aplic nanocapsule cu complex ciclodextrin-lupeol (conc. 100 mg/3 mL)
COM3 Se aplic nanocapsule cu complex ciclodextrin-lupeol (conc. 200 mg/3 mL)

Pierderea de ap transdermic (TEWL = TransEpidermal WaterLoss) constituie
un parametru de analiz a condiiei pielii studiate. Astfel valori cuprinse ntre 0-10 g/h/m
2

corespund unei pieli aflate ntr-o condiie foarte bun, 10-15 g/h/m
2
n condiie bun, 15-25
g/h/m
2
n condiie normal, 25-30 g/h/m
2
n stare proast, respectiv peste 30 g/h/m
2
n stare
foarte proast. Valorile respective sunt valabile pentru pielea sntoas n condiii ambientale
normale (20
o
C i 40-60% umiditate).
Cele mai bune evoluii se nregistreaz n cazul lotului LUP1, respectiv COM1 unde
valorile se menin aproape constante.


Fig. 99.

Valorile de pH nregistrate experimental se reg
pentru testele efectuate (6,1
valorilor ntr-un interval strns pentru lotul martor (ntre 6,8
n general, se poate afirma c
corelat cu concentraia substan

Fig. 100

Evoluia valorilor medii de sebum
n fig. 101, indic o cretere sinuoas
33
. Variaia valorilor TEWL n cazul celor 7 loturi
nregistrate experimental se regsesc ntr-un interval relativ larg
pentru testele efectuate (6,1-7,5). Se observ uor pe fig. 100 o tendin
un interval strns pentru lotul martor (ntre 6,8-7,1).
eneral, se poate afirma c variaia valorilor de pH este haotic
ia substanei active sau tipul acesteia.
100. Variaia valorilor de pH n cazul celor 7 loturi
ia valorilor medii de sebum nregistrate n cazul celor
tere sinuoas a valorilor n cazul fiecrui lot.

ia valorilor TEWL n cazul celor 7 loturi
un interval relativ larg
o tendin fireasc de pstrare a
ia valorilor de pH este haotic i nu poate fi

ia valorilor de pH n cazul celor 7 loturi
nregistrate n cazul celor apte loturi, prezentat
34

Fig. 101. Variaia valorilor de sebum n cazul celor 7 loturi
Valorile determinate se afl ntr-un interval relativ strns (ntre 4-16 uniti) avnd n
vedere faptul c scala aparatului cuprinde 100 uniti. O tendin accentuat de pstrare a
valorilor se regsete n cazul lotului LUP3, care pstreaz aspectul pielii n intervalul 7-9,
aplicrile asigurnd o meninere a nivelului de sebum al pielii de oarece chiar mai bun dect
n cazul lotului MART. Acelai aspect poate fi subliniat i n cazul lotului COM3 (variaia
valorilor are loc n intervalul 5-7 uniti de sebum).
Ca o concluzie referitoare la determinarea valorilor de sebum prin metode
neinvazive, utilizarea unor concentraii mari de substan activ (lupeol sau complex de
incluziune a -ciclodextrin cu lupeol) asigur o bun pstrare a nivelului de sebum al pielii
de oarece pe o perioad de 12 sptmni de experimentare (aplicare / determinare).
Determinrile mexametrice cuprind evaluarea indicelui de melanin, care exprim
nivelul de pigmentare a pielii. Acest indice este situat ntr-un interval ngust de valori: 85-165
uniti de melanin (fig. 102).

Fig. 102. Variaia valorilor melaninei n cazul celor 7 loturi
35
Se observ o tendin fireasc de nemodificare a pigmentrii pielii n timpul
experimentului n cazul lotului MART (se pstreaz la aprox. 90 uniti), n timp ce o
pigmentare accentuat se regsete n cazul lotului LUP2.
Loturile pe care s-au aplicat concentraii mari de substan activ (LUP3 i respectiv
COM3) prezint o cretere uoar, aproape insesizabil a nivelului de melanin.
Variaia valorilor eritemului este redat n fig. 103.


Fig. 103. Variaia valorilor eritemului n cazul celor 7 loturi
n general, modificri ale eritemului cuprinse ntre 0-30 uniti, aa cum se regsesc
n cazurile loturilor studiate, sunt justificate de condiiile de experimentare (aplicare /
determinare) i nu este cazul unei inflamri datorate nocivitii compuilor studiai.
Alturi de evoluia aproape staionar a lotului MART, similitudini pot fi gsite n
evoluiile loturilor LUP3 i respectiv COM3, unde diferenele dintre valorile de start i cele
din sptmna 12 sunt maxim 25 uniti.
Determinrile corneometrice sunt redate n fig. 104.


Fig. 104. Variaia valorilor stratului cornos n cazul celor 7 loturi
36
n cazul valorilor determinate pe loturile de oareci supuse acestui experiment, s-a
observat c aplicarea de suspensii care conin nanocapsule cu lupeol, respectiv cu compleci
de incluziune -ciclodextrin cu lupeol scade ntr-o foarte mic msur umiditatea stratului
cornos.
Scderea cea mai important, observat i prin creterea exagerat a melaninei i
eitemului, se regsete n cazul lotului LUP2. Cea mai constant evoluie fr modificare
semnificativ se prezint n cazul lotului LUP1, respectiv COM1.
Ca o concluzie, se poate afirma c cele mai bune suspensii aplicate, din punct de
vedere al umiditii stratului cornos trebuie s conin cantiti foarte reduse de substan
activ.

Capitolul XIII. Studiul aciunii antiinflamatoare a lupeolului ca atare i din
compleci cu ciclodextrine pe model
din ureche de oarece
n studiile publicate n literatura de specialitate, rezultatele pe animale sunt de multe
ori diferite de cele ale studiilor clinice, pe oameni. ns modelele experimentale, pe animale,
nu pot fi evitate, pentru c sunt, n acest moment, cea mai relevant i cea mai sigur metod
de testare.
Inflamaia a fost indus n ambele urechi pentru fiecare oarece prin aplicare topic
de TPA (12-O-tetradecanoilphorbol-13-acetat), dup care s-a aplicat lupeol, respectiv COM1, COM2
i COM3 i martor indometacin. S-a msurat grosimea urechii pentru a se calcula edemul i apoi
procesul de inhibiie (tabelul XLIX i fig. 108).
Tabelul XLIX. Edemul i procentul de inhibiie pentru grupurile luate n studiu
Grupul de oareci Edem indus SEM, mm procent de inhibi ie (PI), %
A 0,17 0,03 40,15
B 0,31 0,06 0,00
C 0,19 0,03 38,71
D 0,14 0,04 54,83
E 0,13 0,06 58,06
F 0,14 0,05 54,81
G 0,08 0.04 74,19

Admind faptul c lupeolul are o aciune anti-inflamatoare demonstrat n studiile
anterioare publicate n literatura de specialitate [184a], rezultatele acestui studiu demonstreaz
c aciunea anti-inflamatoare este mai puternic n cazul complecilor de incluziune ai
lupeolului cu ciclodextrine, chiar dac valorile obinute sunt mai mici dect n cazul
controlului pozitiv (indometacin), (fig. 108).
Analize morfo-patologice
Dup experiment, urechile au fost cntrite i s-au efectuat analize morfo-patologice.
Rezultatele arat c lupeolul este un compus activ care reduce masiv inflamaia
epitelial la o inflamaie discret, dar prezint o aciune anti-inflamatoare uoar n
comparaie cu indometacinul unde, de asemenea, rezultatele au artat esuturi epiteliale i
cartilaj cu o inflamaie subepitelial foarte discret.
37

Fig. 108. Inhibiia procentual comparativ ntre grupurile de oareci

Un rezultat mai bun pentru tratament a fost n cazul grupurilor D, E i F, atunci cnd
au fost utilizai complecii de incluziune ai lupeolului cu ciclodextrine (COM1, COM2 i
respectiv COM3). Analiza morfo-patologic a artat c esutul epitelial i cartilaginos n cazul
celor trei compleci au prezentat edeme subepiteliale minore. n aceste cazuri, edemele sunt
prezente doar n faza iniial a inflamaiei acute cnd are loc o permeabilitate crescut a
vaselor de snge din care rezult o transpiraie a proteinelor i lichidului plasmatic n esutul
care prezint edem, dar nu este prezent o inflamaie subepitelial. Dei cei trei compleci
lupoel-ciclodextrine au prezentat o aciune anti-inflamatoare mai bun, mpotriva inflamaiei,
acest efect este mai uor dect cel nregistrat n cazul indometacinului.


13.4. Concluzii
Lupeolul este un fitocompus biologic activ a crui activitate anti-inflamatoare poate
fi demonstrat pe modelul experimental al urechii de oarece. Complexarea acestui
fitocompus biologic activ cu ciclodextrine conduce la o aciune anti-inflamatoare crescut i
reprezint o metod bun de a crete solubilitatea lupeolului n soluii apoase cu scopul
obinerii unui rspuns terapeutic mai bun. Rezultatele acestui studiu experimental sunt
importante pentru stabilirea celei mai bune formulri a acestui compus biologic activ,
lupeolul.





-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
blank TPA lup COM1 COM2 COM3 indom
I
n
h
i
b
i

i
a

p
r
o
c
e
n
t
u
a
l


a

e
d
e
m
u
l
u
i
,

%
38
Capitolul XIV. CONCLUZII GENERALE

Teza de doctorat Studii privind mrirea disponibilitii in vitro a lupeolului cu
transportori hidrofili reprezint o cercetare tiinific de vrf i cu mare originalitate, prin
tema abordat i obiectivele de cercetare propuse, din domeniul terapiei antitumorale i
antiinflamatoare. Aceasta a fost conceput dup urmtoarea structur: Introducere, Partea
general, Contribuii personale, Concluzii generale i Bibliografie.
Partea general este structurat n dou capitole i sistematizeaz datele din
literatura farmaceutic privind triterpenele pentaciclice, cu referire la lupeol i utilizrile sale
n terapeutic, datorate proprietilor sale: aciune antioxidant puternic, antitumoral,
antimutagenic, antiinflamatoare i antiaterogen.
Al doilea capitol include o prezentare succint a ciclodextrinelor utilizate n
domeniul farmaceutic i formarea complecilor de incluziune ca transportori hidrofili cu
substane insolubile n scopul mririi solubilitii i deci a biodisponibilitii substanei active.
Contribuiile personale au fost structurate n 12 capitole, din care se desprind
urmtoarele concluzii:
1. O prim direcie a cercetrilor a reprezentat-o prepararea unor compleci de
incluziune a lupeolului cu unele ciclodextrine: i .
n acest scop mai nti au fost stabilite corelaiile QSAR ntre structura triterpenelor
pentaciclice i capacitatea de legare de ciclodextrine. S-au obinut o serie de descriptori
moleculari tip Van der Waals i s-a determinat afinitatea de legare de CD, care a fost n
ordinea: acid betulinic, acid ursolic, lupeol, betulin i acid oleanolic.
S-au preparat 5 compleci de incluziune ai lupeolului cu , respectiv -CD n raport
molar 1:1, 1:2 i respectiv un complex ternar: -CD, lupeol i povidon 1:1:1.
S-a determinat solubilitatea n ap a acestor compleci de incluziune, din care se
remarc o cretere a solubilitii comparativ cu lupeolul, i n funcie de raportul molar CD;
rezultate mai bune au prezentat complecii cu raportul molar 1:2 i complexul ternar (COM1,
COM2, COM3).
De asemenea s-a efectuat analiza morfologic a complecilor de incluziune prin
spectroscopie electronic de scanare (SEM), care sunt compui amorfi; s-au caracterizat prin
calorimetrie diferenial dinamic (DSC), prin spectroscopie IR (FT-IR) i difracie de raze X.
2. Cei trei compleci de incluziune (COM1, COM2, COM3) i lupeolul au fost
formulai n 4 variante de unguente pe baz de polietilenglicol (PEG). n condiii de laborator,
s-au realizat unguente-emulsie tip L/H, prin asociere de emulgatori ca Transcutol

i
Labrasol

.
Aprecierea calitii unguentelor a avut n vedere condiiile pe care trebuie s le
ndeplineasc aceste forme, conform FR X i supl. i Ph. Eur. 7
th
.
3. Am efectuat un control macroscopic, fizico-chimic i farmacotehnic. Astfel, am
urmrit: aspectul, omogenitatea, culoarea, mirosul, pH-ul; rezultatele fiind n concordan cu
normele de calitate.
Comportarea reologic a unguentelor permite caracterizarea fizico-mecanic a
acestora. Toate formulele de unguente, inclusiv baza de unguent, prezint, imediat dup
preparare, un comportament reologic dilatant, iar n timp, formeaz o reea gelic, specific
PEG-ului, care confer o comportare reologic plastic, cu prag de curgere i bucl de
histerez.
Viscozitatea unguentelor scade progresiv cu creterea vitezei de forfecare.
Capacitatea de ntindere i penetraia este adecvat formulrilor, care pledeaz
pentru o etalare facil, cu o bun adeziune pe piele.
39
4. Rezultatele obinute n urma studiilor de cedare in vitro a lupeolului ca atare i a
celor 3 compleci de incluziune (COM1, COM2 i COM3), efectuate pe celula Franz,
concomitent pe trei tipuri de membrane de dializ (1. membrana artificial poroas Porofil;
2. membran natural, piele de obolan neexpus la radiaii UV i 3. membran natural, piele
de obolan expus la radiaii UV) au evideniat o cretere a cantitii de lupeol cedat din
unguentele ce conin complecii de incluziune (F IIIV).
Cantitile cele mai mari de lupeol cedat se nregistreaz n cazul pielii de obolan
neexpus la UV; iar cele mai mici cantiti difuzate au fost obinute pentru unguentul cu
lupeol neinclus n transportori hidrofili.
5. Pentru determinarea cantitativ a lupeolului din unguentele studiate s-a pus la
punct o metod spectrofotometric, n UV, la = 211 nm. Metoda a fost validat i utilizat
pentru studiile de cedare in vitro.
6. De asemenea, s-a studiat cinetica de cedare in vitro a lupeolului i a complecilor
de incluziune, prin aplicarea a 4 (patru) modele matematice: de ordinul zero, de ordinul unu,
Higuchi i Korsmayer-Peppas. Rezultatele obinute au evideniat faptul c lupeolul este cedat
din formele studiate printr-un proces de difuziune, indiferent de membrana folosit n cadrul
testului de dizolvare. n cazul complecilor de incluziune, rezultate optime s-au obinut doar
n cazul fitrii pe modelul de cedare Korsmayer-Peppas, pentru n = 0,3. Astfel apreciem c n
cazul acestor 3 (trei) compleci, prin procesul de incluziune au fost modificate caracteristicile
de penetraie i solubilitatea lupeolului.
7. n premier naional s-a efectuat testarea aciunii antitumorale a lupeolului i a
celor trei compleci de incluziune din unguentele formulate, pe animale de laborator oricei;
s-a pus la punct o metod de lucru de determinare a melaninei i a eritemului; cele mai bune
rezultate le-a prezentat formularea IV, care conine amestecul ternar (COM3).
8. Tot ca originalitate, s-a evaluat citotoxicitatea i aciunea antiangiogenic a
lupeolului, comparativ cu unele triterpene pentaciclice prin utilizarea de diferite metode:
testul MTT (pe bromur de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolin), testul CAM
(membrana corioalantoid avian). Efectul antiproliferativ a fost evaluat in vitro pe dou linii
celulare umane: HeLa (adenocarcinomul de col uterin) i A 431 (cancer cutanat).
S-au studiat: acidul betulinic, betulina, lupeolul, acidul ursolic i acidul oleanolic.
Se remarc cea mai mare aciune citotoxic asupra celulelor tumorale n ordinea:
acid betulinic, betulin, lupeol.
Referitor la aciunea antiangiogenic se observ c tot acidul betulinic i betulina
prezint o aciune inhibitorie intens asupra dezvoltrii vaselor sanguine, comparativ cu restul
triterpenelor pentaciclice studiate; lupeolul se claseaz tot pe locul trei.
9. O alt direcie original a cercetrilor din teza de doctorat a constituit-o prepararea
de nanocapsule poli(eter)uretanice, utilizate ca transportori transdermici pentru lupeol i
reprezint o noutate absolut, pe plan internaional. S-au preparat ase variante de formulri
trei cu lupeol i trei cu complexul de incluziune lupeol-CD.
Aceste nanocapsule au fost analizate prin calorimetrie de scanare diferenial (DSC),
morfologia nanoparticulelor a fost examinat cu microscopul de scanare electronic (SEM), s-
a determinat dimensiunea nanocapsulelor (diametrul), potenialul zeta i stabilitatea lor n ap
distilat, respectiv n aceton, pH-ul suspensiilor apoase de nanocapsule.
10. Pentru testarea nanocapsulelor la nivel cutanat au fost utilizate o serie de metode
moderne, neinvazive, ca: mexametria, sebumetria, corneometria, skin-pH-metria, TEWA-
metria, n condiii de experimentare pe model animal (oareci). Determinrile efectuate relev
buna compatibilitate a nanocapsulelor cu esutul cutanat i capacitatea acestora de a fi
transportori transepidermici pentru lupeol.
40
11. O ultim direcie original a cercetrilor din teza de doctorat a constituit-o studiul
aciunii antiinflamatoare a lupeolului i respectiv a celor trei compleci de incluziune cu
ciclodextrine pe model experimental animal ureche de oarece.
Rezultatele experimentale arat c lupeolul este un compus activ care reduce masiv
inflamaia epitelial la o inflamaie discret, dar, comparativ cu indometacinul (luat ca
martor), aciunea sa este mai mic. Un rezultat mai bun l prezint complecii de incluziune a
lupeolului cu CD; dar i n acest caz sub aciunea antiinflamatoare a indometacinului.
12. Analiza morfo-patologic a artat c esutul epitelial i cartilaginos n cazul celor
trei compleci de incluziune a lupeolului cu CD au prezentat edeme subepiteliale minore,
comparativ cu indometacinul.
Complexarea lupeolului cu CD conduce deci la o aciune antiinflamatoare crescut i
reprezint o metod bun de a crete solubilitatea sa n soluii apoase, n scopul obinerii unui
rspuns terapeutic mai bun.
Studiile realizate n premier n ara noastr n cadrul cercetrilor din teza de doctorat
au permis evaluarea aciunii antitumorale, antiinflamatoare i antiangiogenice a unui compus
triterpenic pentaciclic lupeolul, ca atare i sub forma unor compleci de incluziune a
acestuia cu ciclodextrine i formularea a dou forme farmaceutice.
De asemenea, cercetrile efectuate au demonstrat creterea solubilitii n ap i deci
implicit a biodisponibilitii lupeolului din complecii de incluziune cu ciclodextrinele, ca
transportori hidrofili ai substanelor insolubile.
Rezultatele obinute relev eficiena celor dou forme farmaceutice, cu posibilitatea
de aplicare n terapeutic.

ELEMENTE DE ORIGINALITATE
Prin cercetrile efectuate n teza de doctorat se reliefeaz elemente de originalitate
care pot fi dup cum urmeaz:
1. Se prezint studii de toxicitate corelate pe pielea uman i studii implementate
pe animale de experien care apeleaz la tehnici moderne de analiz i
investigare.
2. Formularea i prepararea a dou forme farmaceutice: unguente-emulsie tip L/H
i nanocapsule, cu lupeol i respectiv cei trei compui de incluziune a lupeolului
cu CD.
3. Studii de cedare in vitro a lupeolului ca atare i sub form de compleci de
incluziune cu CD, din unguente-emulsie tip L/H pe celula Franz, prin trei tipuri
de membrane de dializ (una artificial i dou naturale) ct i studiul cineticii
de cedare.
4. n premier naional s-a efectuat testarea aciunii antitumorale a lupeolului i a
celor trei compleci de incluziune cu CD, din unguentele studiate, pe animale de
laborator (oricei).
5. Determinarea citotoxicitii i a aciunii antiangiogenice a lupeolului, comparativ
cu unele triterpene pentaciclice prin teste moderne: CAM, MTT, ct i a
efectului antiproliferativ.
6. Teza subliniaz implementarea tehnicilor non-invazive moderne ca metode de
studiu al calitii organului cutanat.
7. Prepararea de nanocapsulele care au fost investigate prin metode moderne de
analiz pe animale de experien.
8. Studiul aciunii antiinflamatoare pe model experimental animal urechea de
oarece, a lupeolului i respectiv a celor trei compleci de incluziune lupeolCD.

41
PROPUNERI I RECOMANDRI

1. Folosirea complecilor de incluziune a -ciclodextrinelor cu lupeol n formulri
farmaceutice trebuie realizat echilibrat. Se va avea n calcul ideea de folosire a unor
doze eficiente farmacologic, dar reduse pentru a preveni nocivitatea dat de supra-dozaj.
2. Aplicaiile complecilor de incluziune a -ciclodextrinelor cu lupeol pot fi extinse pe
domenii variate, inclusiv n ceea ce privete formularea de nanocapsule. Aceste
formulri se pot executa cu doze mici de substan activ i sunt lipsite de efecte nocive
marcante.
3. Aplicarea testelor CAM sau pe animale de laborator prezint o soluie modern i
detaliat a determinrii nocivitii unui complex de incluziune a -ciclodextrinelor cu
lupeol.
4. Testele se pot corela ntre ele i apoi cu altele de alt natur pentru a aprecia detaliat
toxicitatea complecilor de incluziune a -ciclodextrinelor cu lupeol chiar i la doze
reduse.
5. Pentru evaluarea complecilor de incluziune a -ciclodextrinelor cu lupeol i
formulrilor acestora este indicat folosirea de metode neinvazive (Mexametrie,
TEWAmetrie etc.) care vor reda rapid i exact degradarea cutanat.
6. Se recomand folosirea unor tipuri de compleci de incluziune a -ciclodextrinelor cu
lupeol care confer putere de penetrare similar atunci cnd se testeaz cedarea
principiului activ prin membran celulozic sau piele de animal.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
22. Cpitnescu AA, Kyritsis G (2007) Cercetarea pe animale - intre necesitate si abuz.
Revista Romn de bioetic 3(2). Disponibil la adresa: http://www.bioetica.ro/
bioetica/ie2/info.jsp?item=9830&node=1475. Accesat n 02.X.2011.
24. Chatterjee P, Kouzi SA, Pezzuto JM, Hamann MT (2000) Biotransformation of the
antimelanoma agent betulinic acid by Bacillus megaterium ATCC 13368. Applied and
Environmental Microbiology 66(9), 3850-3855.
26. Cichewicz RH, Kouzi SA (2004) Chemistry, biological activity and chemoterapeutic
potential of betulinic acid for the prevention of treatment of cancer and HIV infection.
Medicinal Research Reviews 24(1), 90-114.
51. Fromming HK, Szejtli J (1993) Cyclodextrins in Pharmacy, Dordrecht: Kluwer
Academic Publishers.
106. Loftsson T, Hreinsdottir D, Masson M (2005) Evaluation Of Cyclodextrin
Solubilization Of Drugs. Int. J. Pharm. 302(1-2), 18-28.
107. Loftsson T (2010) What are cyclodextrins? Disponibil la adresa: http://www.
eurocdsoc.com. Accesat n 02.X.2011.
112. Martin Del Valle EM (2004) Cyclodextrins And Their Uses: A Review, Process
Biochemistry 39(9), 1033-1046.
115. Mosman T (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicity assays.
Journal of Immunological Methods 65, 55-63.
120. Nihal M, Ahmad N, Mukhtar H, Wood GS (2005) Anti-proliferative and proapoptotic
effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate on human melanoma: possible implications for
the chemoprevention of melanoma. Int. J. Cancer 114, 513-521.
42
121. Niham N, Prasad S, Shukla Y (2007) Preventive effects of lupeol on DMBA induced
DNA alkylation damage in mouse skin. ScienceDirect 45, 2331-2335.
122. Nikiema JB, Vanhaelen-Fastre R, Vanhaelen M, Fontaine J, De Graef C, Heenen M
(2001) Effects of anti-inflammatory triterpenes isolated from. Leptadenia hastata latex
on keratinocyte proliferation. Phytother Res. 15, 131-134.
131. Poon KaH (2004) Betulinic acid enhances 1,25-dihydroxyvitamin D3-induced
differentiation in human HL-60 promyelocytic leukemia cells. Anti-Cancer Drugs 15,
619-624.
132. Popovici I, Lupuleasa D (2011) Tehnologie farmaceutic. Vol. 1. Ed. Polirom, Iai.
138. Ramadoss S, Jaggi M, Siddiqui MJA, Khanna AB (1999) Use of betulinic acid
derivatives for inhibiting cancer growth, US Patent 6214814.
139. Raughuvar Gopal DV, Narkar AA, Badrinath Y, Mishra KP, Joshi DS (2005) Betulinic
acid induces apoptosis in human chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K-562
without altering the levels of Bcr-Abl. Toxicology Letters 155, 343-351.
140. Recio MC, Giner RM, Manez S (1995) Investigations on the steroidal anti-
inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas. Planta Med. 61, 9-
12.
141. Ribatti D, Djonov V (2011) Angiogenesis in development and cancer today. Int J Dev
Biol. 55(4-5), 343-344.
144. Ryu SY, Oak MH, Yoon SK (2000) Anti-allergic and antiinflammatory triterpenes from
herb of Prunella vulgaris. Planta Med. 66, 358-360.
145. Saeed MA, Sabir AW (2002) Irritant potential of triterpenoids from Ficus carica leaves.
Fitoterapia 73, 417-420.
153. Salti GI (2001) Betulinic acid reduces ultraviolet-C-induced DNA breakage in
congenital melanocytic naeval cells:evidence for a potential role as a chemopreventive
agent. Melanoma Research 11, 99-104.
158. Selzer E (2000) Effects of Betulinic Acid alone and in combination with irradiation in
human melanoma cells. J. Invest. Dermatol. 114, 935-940.
167. Szejtli J (1982) Cyclodextrins And Their Inclusion Complexes, Akademiai Kiado,
Budapesta.
168. Szejtli J (1992) The Properties And Potential Uses Of Cyclodextrin Derivatives. J. Incl.
Phenom. 14(1) 25-36.
169. Szejtli J (1998) Introduction and General Overview of Cyclodextrin Chemistry. Chem.
Rev. 98(5): 1743-1754.
171. oica CM, Dehelean CA, Ordodi V, Antal D, Vlaia V (2008b) Complexation with
hydroxipropilgamma cyclodextrin of birch tree extract. Physico-chemical
characterisation of their binary products. Revista de Chimie 59(6), 678-681.
172. oica CM, Peev CI, Ciurlea S, Ambrus R, Dehelean CA (2010) Physico-chemical and
toxicological evaluations of betulin and betulinic acid interactions with hydrophilic
cyclodextrins. Farmacia 58(5), 611-619.
174. Takada Y i Aggarwal BB (2003) Betulinic acid suppressed carcinogen-induced NF-kB
activation through inhibition of IkBkinase and p65 phosphorylation: abrogation of
cyclooxygenase-2 and matrix mettaloprotease-9. The Journal of Immunology 171,
3278-3286.
43
180. Valanzano A (2004) Rules of good practice in the care of laboratory animals used in
biomedical research. Ann Ist Super Sanit 40(2), 201-203.
182. Yafan Li Y, Wheeler DL, Ananthaswamy HN, Verma AK, Oberley TD (2007)
Differential Tumor Biology Effects of Double-Initiation in a Mouse Skin Chemical
Carcinogenesis Model Comparing Wild Type versus Protein Kinase Cepsilon
Overexpression Mice. Toxicol Pathol 35(7), 942-951.
183. Yamashita K (2002) Effect of three triterpenoids, lupeol, betulin, betulinic acid on the
stimulus-induced superoxide generation and tyrosyl phosphorylation of proteins in
human neutrophils. Clinica Chimica Acta 325, 91-96.
184. Yanamandra N (2003) Triterpenoids from Glycine max decrease invasiveness and
induce caspase-mediated cell death in human SNB19 glioma cells. Clinical and
Experimental Metastasis 20, 375-383.
185. YingMeei T, Rong Y, Pezzuto JM (2003) Betulinic acid-induced programmed cell
death in human melanoma cells involves mitogen-activated protein kinase activation.
Clinical Cancer Research 9, 2866-2875.
186. Yu Z, Cui M, Yan C, Song F, Liu Z, Liu S, Zhang H (2010) Gas phase isomeric
differentiation of oleanolic and ursolic acids associated with heptakis-(2,6-di-O-
methyl)-beta-cyclodextrin by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron
resonance mass spectrometry, J. Mass Spectrom. 45(4), 444-450.
187. Yuspa SH (1994) The pathogenesis of squamous cell cancer: lessons learned from
studies of skin carcinogenes. Cancer Res. 54, 11781189.
188. Zdzisinska B (2003) Differential effect of betulin an dbetulinic acid on cytokine
production in human whole blood cell cultures. Pol. J. Pharmacol. 55, 235-238.
189. Zuco V (2002) Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not on
normal cells. Cancer Lett. 175(1), 17-25.
190. Wada S, Iida A, Tanaka R (2001) Triterpene constituents from the stem barks of Pinus
luchuensis and their DNA topoisomerase II inhibitory effect. Planta Med 67, 659-664.
196. *** Animal Welfare Act - produced by Ministry of Agriculture 2009, Government
Offices of Sweden.
198. *** Information, regulation and instruction - Wenner-Gren Insitute, Animal House.
Disponibil la adresa: http://www.wgi.su.se/pub/jsp/polopoly.jsp?d=11885. Accesat n
02.X.2011.
199. *** Legea 276/33. DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT
AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for
scientific purposes, Official Journal of the European Union.
200. *** Legea 305/685/2006. Lege privind ratificarea Conveniei europene pentru protecia
animalelor vertebrate utilizate n experimente i alte scopuri tiinifice, adoptate la
Strasbourg la 18 martie 1986, i a Protocolului de amendare a Conveniei europene
pentru protecia animalelor vertebrate utilizate n experimente i alte scopuri tiinifice,
adoptat la Strasbourg la 22 iunie 1998, semnate de Romnia la 15.II.2006. Monitorul
Oficial Nr. 168-169 , art. Nr : 762.
208. ***, Wistar rat. Disponibil la adresa: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Wistar_rat.jpg.
Accesat n 02.X.2011.
44

LISTA LUCRRILOR PUBLICATE
DIN TEZA DE DOCTORAT

1. Crciun (Rede) Lavinia, Dehelean C, oica CM, Ciurlea S, Peev C, Aigner Z
(2008) Preliminary studies regarding lupeol hydrosolubility and interventions on
its in vitro efficacy/ noxious activity. Timioara Medical Journal (TMJ) 58(2),
379-383.

2. Dehelean CA, Muresan A, Ciurlea S, Ionescu D, Peev CI, Soica CM, Crciun
(Rede) Lavinia (2009) Evaluri toxicologice pentru 7,12-dimetilbenzantracen
ca promotor tumoral in melanomul experimental. Rev. Med. Chir. Soc. Med.
Nat. 113(2), 99-103.

3. Ciurlea S, Ionescu D, Crciun (Rede) Lavinia, Soica CM, Peev CI, Popovici I
(2010) Lupeol, a pentacylcic triterpene that reduces the lesions and irritability on
murine skin and is effective on in vitro tumor models. Journal of Agroalimentary
Processes and Technologies 16(4), 427-432.

4. Feflea S, Peev CI, Tiulea C, Ambrus R, Ionescu D, Crciun (Rede) Lavinia,
Dehelean CA (2010) The antiinflammatory activity of lupeol applied in a topical
formulation on an experimental model (poster), International Workshop: Drugs
from Nature Targeting Inflammation, April 8-10, Innsbruck, Austria.

5. Crciun (Rede) Lavinia, Munteanu M, Ionescu D, oica C, Peev C, Ambrus
R, Ksa jr. P, Popovici I (2010) New types of cyclodextrin complexes with
lupeol and their in vitro behaviour. Conferina doctoranzilor, Tg. Mure, iulie
2010.

6. Crciun (Rede) Lavinia, Ionescu D, Kaycsa A, Ciurlea S, Borcan F, Rdoi B,
Popovici I (2011) Lupeol as anti-inflammatory compound tested on Balb/c -
TPA Model. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 17(2), 157-
162.

7. Crciun (Rede) Lavinia, Borcan F, Ionescu D, Ambrus R, Galucan A,
Popovici I (2011) Synthesis and characterization of a polyurethane transdermal
carrier for lupeol. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies
(JAPT) 3.







CURRICULUM VITAE


Nume: REDE (cstorit CRCIUN)
Prenume: LAVINIA MIRELA
Data i locul naterii: 24 Septembrie 1973, Arad
Domiciliul: B-dul Revoluiei, bl. 1, et. 7, ap. 25, Arad, Romnia
Tel. 0722.688.273

I. FUNCII I SPECIALIZRI
1. 1992 am absolvit cursurile liceale ale Liceului Moise Nicoar din Arad, secia
Filologie.
2. 1996 absolvent a Facultii de Farmacie din cadrul Universitii de Vest Vasile
Goldi din Arad, liceniat la Universitatea de Medicin i Farmacie din Trgu-
Mure.
3. n prezent lucrez ca farmacist diriginte la S.C. OLIMPIA FARM din Lipova, jud.
Arad, i am o vechime de 15 ani.
4. Sunt membr a Colegiului Farmacitilor din Arad i dein dreptul de liber practic i
avizul socio-profesional.
5. Masterat n Farmacognozie, fitoterapie i fitochimie (20062007, U.M.F. Oradea).
6. 2007 am obinut Certificat de competen lingvistic de limba francez, la Univ. A.
Vlaicu Arad.
7. 1995 am obinut o adeverin de operator calculator.
8. Permis de conducere categoria B.
9. Limbi strine: francez, englez, spaniol nivel mediu.

II. CURSURI DE PERFECIONARE
la Universitatea Victor Babe Timioara:
- Tendine n dezvoltarea tehnologiei farmaceutice (05.2001);
- Medicina Mileniului III TimMedica ediia a III-a (21-23 Nov. 2002);
- Norme GMP n industria farmaceutic (21-24 Feb. 2003);
la Universitatea Iuliu Haieganu Cluj-Napoca:
- Farmacia Mileniului III Locul i rolul farmacistului (17-23 Mar. 2003);
- Noile formulri farmaceutice (04.2004, Timioara);
- Cum tratm riscul bolilor cardiovasculare (04.2004, Arad);
- Necesitatea standardelor calitative n medicaia generic (03.2005, Arad);
- Atestat ce confer avizul socio-profesional (03.2005, Oradea);
- n perioada 2005-2006 am lucrat cu 4 ore la Farmacia Spitalului de boli cronice din
Lipova;
- lEcole dEte Pathologie et Pharmacologie moleculaires. Biotechnologies (4-16 iulie
2005, Univ. V. Goldi Arad);
- Noi strategii terapeutice. Forme moderne oftalmologice (05.2007);
- Curs de formare profesional din cadrul Trgului AR MEDICA, organizat la Expo
International Arad noiembrie 2008;

- Obinerea Certificatului de Membru al Colegiului Farmacitilor din Romnia
(28.11.2005);
- nscrierea la Doctorat la U.M.F. Iai, n 2007, avnd drept coordonator pe doamna
Prof. Dr. Iuliana Popovici;
- Curs postuniversitar de perfecionare Cardioactive Naturale, desfurat la Catedra
Farmacognozie-Fitoterapie a U.M.F. Cluj-Napoca, 2009;
- Cursul Plante medicinale recunoatere, recoltare i utilizare, desfurat la Catedra
de Botanic farmaceutic a U.M.F. Cluj-Napoca, aprilie 2010;
- Obinerea Certificatului RBPF pentru farmacia pe care o conduc S.C. Olimpia Farm
S.R.L.;
- Atestat de formare profesional curs intitulat Autentic Pharma Conference,
Timioara, 2011;
- Evaluri toxicologice ale compuilor terapeutici utiliznd modele animale
experimentale Timioara, 2011;

III. PARTICIPRI LA MANIFESTRI TIINIFICE
- Al 5-lea Congres de farmacologie, terapeutic i toxicologie clinic (05.2004,
Climneti - Cciulata);
- Simpozion Farmacia astzi ntre promovare i cercetare (05.2005, Timioara);
- Al 6-lea Congres Naional de farmacologie, terapeutic i toxicologie clinic (06.2005,
Cluj-Napoca);
- Farmacia Romniei n 2005 din cadrul Trgului AR MEDICA (3-5 Noi. 2005);
- Simpozionul Naional de Farmacie Farmacia astzi, ntre promovare i cercetare
Timioara, 2008;
- 2
nd
International Conference on Gerontology Arad, 2008;
- Simpozionul Medicamentul de la concepere pn la utilizare Iai, 2009;
- Pharma Forum, Timioara, 2010;
- A 3-a Conferin a doctoranzilor Trgu-Mure, iulie 2010;
- Aprecieri toxicologice asupra unor compui terapeutici cu potenial nociv la nivel
cutanat Timioara, 2010;
- Produse naturale cu aciune la nivel cutanat U.M.F. Cluj-Napoca, ianuarie 2011;
- Congresul Internaional Timmedica, iunie 2011;
- Cosmeceuticele active n era peptidelor de mici dimensiuni Timioara, 2011.

IV. LUCRRI PUBLICATE
1. Crciun (Rede) Lavinia, Dehelean C, oica CM, Ciurlea S, Peev C, Aigner Z
(2008) Preliminary studies regarding lupeol hydrosolubility and interventions on its in
vitro efficacy/ noxious activity. Timioara Medical Journal (TMJ) 58(2), 379-383.
2. Dehelean CA, Muresan A, Ciurlea S, Ionescu D, Peev CI, Soica CM, Crciun
(Rede) Lavinia (2009) Evaluri toxicologice pentru 7,12-dimetilbenzantracen ca
promotor tumoral in melanomul experimental. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. 113(2),
99-103.
3. Ciurlea S, Ionescu D, Crciun (Rede) Lavinia, Soica CM, Peev CI, Popovici I
(2010) Lupeol, a pentacylcic triterpene that reduces the lesions and irritability on
murine skin and is effective on in vitro tumor models. Journal of Agroalimentary
Processes and Technologies 16(4), 427-432.
4. Feflea S, Peev CI, Tiulea C, Ambrus R, Ionescu D, Crciun (Rede) Lavinia,
Dehelean CA (2010) The antiinflammatory activity of lupeol applied in a topical
formulation on an experimental model (poster), International Workshop: Drugs from
Nature Targeting Inflammation, April 8-10, Innsbruck, Austria.

5. Crciun (Rede) Lavinia, Munteanu M, Ionescu D, oica C, Peev C, Ambrus R,
Ksa jr. P, Popovici I (2010) New types of cyclodextrin complexes with lupeol and
their in vitro behaviour. Conferina doctoranzilor, Tg. Mure, iulie 2010.
6. Crciun (Rede) Lavinia, Ionescu D, Kaycsa A, Ciurlea S, Borcan F, Rdoi B,
Popovici I (2011) Lupeol as anti-inflammatory compound tested on Balb/c - TPA
Model. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 17(2), 157-162.
7. Crciun (Rede) Lavinia, Borcan F, Ionescu D, Ambrus R, Galucan A, Popovici I
(2011) Synthesis and characterization of a polyurethane transdermal carrier for lupeol.
Journal of Agroalimentary Processes and Technologies (JAPT) 3.




Farm. Lavinia-Mirela Rede (cs. Crciun)

Semntura