Eugenio Martin Rafael Héctor Gordon Neftali Pérez Molphe Balch Ramirez Malag6n _—Nidftez Palenius Ochoa Alejo | INTRODUCCION AL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES unieRsiDaD auTonoMa De aGuascatientes _ re eee aU4 Introduccién al Cultivo de Tejidos Vegetales D.R.© Universidad Auténoma de Aguascalientes Av. Universidad # 940 CP. 20100, Aguascalientes, Ags. Primera edicién 1999 ISBN 968-6259-62-7 Impreso en México / Printed in Mexico Este libro se publica con el apoyo del Fondo para la Modernizacién de la Educaci6n Superior, FOMES 97-1-5 eile te oe tase ee I ee ee ee ee ee le eeiNDICE GENERAL Presentacién 1. Cultivo de Tejidos Vegetales 2. Medio de cultivo y nutricidn in vitro de los tejidos vejetales 3. Control hormonal del crecimiento y desarrollo in vitro 4. Problemas asociados al CTV y formas de combatirlos 5. Tejido calloso: induccién, mantenimiento y usos 6. Organogénesis in vitro 7. Embriogénesis somatica 8. Cultivo de meristemos, yemas y apices 9. Micropropagacién 10. Cultivo de células en suspension M1. Cultivo de rafves 12, Produccién in vitro de metabolitos secundarios 13, Aislamiento y cultivo de protoplastos 14, Cultivo de anteras y microsporas y generacién de plantas haploides 15. Variabilidad genética de las plantas generadas in vitro 16. Aplicaciénes de CTV para la conservacién de germoplasma 17. Transformacién genética de plantas 18. Andlisis de resultados en el CTV Bibliografia Indice de Tablas Indice de Figuras Indice de Fotografias Abreviaturas 15 a7 7 51 57 65 7 81 a1 7 m 7 125 129 135 149 153 171 173 175 179PRESENTACION La biotecnologia vegetal es una de las disciplinas cientificas que mas i desarrollo ha mostrado en los tltimos aftos. Actualmente ofrece una alternativa real para la resolucién de un gran mimero de problemas re- ~ acionados con el mejor aprovechamiento de las plantas por parte del hombre. Esta disciplina es sin duda una herramienta invaluable para inerementar tanto la cantidad como la calidad de los alimentos de origen vegetal, as{ como para obtener nuevos productos con diversas aplicacio- nes a partir de las plantas, La biotecnologia vegetal tiene como una de st sus bases al cultivo de tejidos vegetales, el cual consiste en una serie de técnicas que permiten el cultivo y manipulaci6n, bajo condiciones i artificiales y controladas, de células, tejidos y Srganos vegetales. Entre las aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales se pueden mencionar — a la micropropagacién o clonacién in vitro de plantas, a la produccion in vitro de compuestos naturales de alto valor en cultivos de células u Srganos vegetales, a la obtencién de materiales mejorados mediante la seleccién in vitro u otras técnicas y a la conservacién de germoplasma vegetal mediante criopreservacién 0 almacenamiento en condiciones 3 de minimo crecimiento, Por otro lado, el cultivo de tejidos vegetales, junto con las técnicas de ingenierfa genética, han hecho posible la = transferencia directa de genes a las plantas. Esto tiltimo ha abierto una inmensa gama de posibilidades tanto para el mejoramiento de las plantas cultivadas, como para la obtencién de nuevos productos a par- tir de ellas. Este libro esté dirigido a aquellos estudiantes o profesionales de las areas biolégica, agronémica 0 bioquimica, que deseen conocer los fuundamentos del cultivo de tejidos vegetales, asf como las diversas aplicaciones précticas que éste tiene.1. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES INTRODUCCION Se le llama Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) al conjunto de técnicas que permiten el establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de una planta, desde una célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas. EL.CTV es una herramienta invaluable para la resoluci6n de pro- blemas basicos y aplicados en la biologia vegetal, ya que por una parte ofrece una serie de sistemas modelo ideales para la investigacin fisiolégica, bioquimica, genética y estructural, y por otro lado tiene una aplicacién préctica en la clonacién, conservacién y manipulacién in vitro de cualquier material vegetal. Los principios basicos del CTV fueron definidos a principios del siglo XX por Haberlandt (1902), Hanning (1904), Kuster (1909) y otros investigadores, pero fue hasta mediados del siglo cuando White (1943 y 1963) y Gautheret (1934, 1942) desarrollaron las bases en que se fun- damentan los métodos actuales (Hurtado y Merino 1987, Endress 1994) Los primeros trabajos en este campo tuvieron, por lo general, un éxito limitado, debido a tres factores fundamentales. El primero de ellos era el desconocimiento de los requerimientos nutricionales de los tejidos vegetales cultivados in vitro; el segundo, era el uso frecuente de teji- dos vegetales maduros y bien diferenciados para iniciar los cultivos. Estos tejidos, como se sabe actualmente, son los que muestran una me- nor capacidad de respuesta al cultivo int sitro. Finalmente, el tercer fac- tor que retards el desarrollo de las técnicas de CTV fue la ignorancia de laexistencia y del papel que juegan en el desarrollo vegetal las llamadas fitohormonas o reguladores del crecimiento. Estas substancias eran desconocidas hasta 1928 cuando Wenty Thimann descubrieron el écido indolacético (AIA), y 1955 cuando Skoog descubrié la cinetina (CIN). En 1957 Skoog y Miller fueron los primeros que consiguieron manipu-Introduccién al cultivo de tejidos vegetales lar la formaci6n in vitro de brotes, races y tejido calloso mediante el uso de diferentes combinaciones de una auxina (AIA) y una citocinina (CIN). Otro de los pasos fundamentales para la consolidacién de las téchicas de CTV lo dieron en 1962 Murashige y Skoog al desarrollar un medio de cultivo (MS) que reunfa las caracteristicas apropiadas para ser utilizado en el cultivo de una gran variedad de tejidos de diferen- tes especies vegetales; dicho medio de cultivo sigue utilizéndose de manera rutinaria en innumerables trabajos que se realizan actualmen- te (Murashige y Skoog 1962). Los avances antes mencionados dieron un auge importante al CTY, a tal grado que en 1963 se organiz6 ya el Primer Congreso Internacional de Cultivo de Tejidos Vegetales. A pe- sar de esto, el desarrollo de estas técnicas continué siendo relativamen- te lento hasta finales de los aos 70 y principios de los 80 en que se logré la consolidaci6n definitiva del CTV en el campo de la investiga cidn en biologfa vegetal y se comenzé con su uso directo en cuestiones aplicadas como la micropropagacién, la generacién de plantas libres de enfermedades y la conservacién de germoplasma in vitro. A media- dos de los afios 80, el CTV tomé una importancia atin mayor al contri- buir al nacimiento de la ingenieria genética de plantas, junto con la cual integra lo que hoy en dfa se conoce como biotecnologfa vegetal. TIPOS DE CULTIVOS DE TEJIDOS VEGETALES Enla actualidad, se practican varios tipos de cultivos de tejidos vegetales que varian en mayor o menor grado entre ellos. A.continuacién se men- cionan y definen los més importantes: 1. Cultivo de plantas completas. En este caso se trabaja con individuos completos, aunque cultivados bajo condiciones artificiales. Algunos ejem- plos de su uso lo son las fases finales de la micropropagacisn, cuando se tienen plantas completas y se est en espera de su crecimiento 0 adap- tacién para ser transferidas a suelo, o bien cuando éstas son mantenidas in vitro afin de ser utilizadas como fuente de tejidos axénicos para el es- tablecimiento de otros tipos de cultivos o para la transformacién genética. 2. Cultivo de érganos, Esta modalidad del cultivo in vitro se refiere al cultivo de 6rganos vegetales aislados. Por ejemplo, el cultivo de rafces normales 0 transformadas con Agrobacterium rhizogenes pata la pro- duccién in vitro de metabolitos de interés. Otro caso es el cultivo de em- briones. Los embriones aislados, ya sean maduros o inmaduros pueden ser cultivados int vitro con varios fines; por ejemplo, el lograr su desa- rrollo para obtener plantas completas, bien el generar a partir de ellos otros tipos de tejido como callo embriogénico o bien el tejido organo- génico. En algunas especies de coniferas, es muy diffciliniciar cultivos 101. Cultivo de tejidos vegetales in vitro a no ser que se parta de un embrién como explante inicial. También es posible el cultivo de anteras y 6vulos, Estas son técnicas utilizadas para la regeneracién de plantas haploides, las cuales tienen tuna aplicacién importante en el campo del fitomejoramiento. 3. Cultivo de tejidos o segmentos de drganos. Dentro de esta categoria se encuentra el cultivo de tejido calloso. Bste se refiere al mantenimiento in vitro de masas celulares no diferenciadas, Hlamadas callos 0 tejido ca- lloso, Este tipo de tejido tiene innumerables aplicaciones en estudios de tipo fisiolégico, bioquimico, genético, produccién de compuestos se- cundarios, y para la generacién de variacién genética en los cultivos. Por otro lado, es frecuente el cultivo de segmentos de érganos (hoja, tallo, rafz, ete.) con el fin de inducir la formacién de tejido calloso o la regeneracién de plantas completas a partir de los mismos. 4. Cultivo de células. Un primer tipo de cultivo de células es el cultivo de células en suspensién. En este caso se cultivan células aisladas o peque- flos actimulos no diferenciados de células, lo cual se realiza en un medio Iiquido bajo agitacién continua. Este cultivo es ideal para estudios fisioldgicos a escala celular, para la produccién in vitro de metabolitos de interés o bien para la selecciGn in vitro de variantes deseablés, Un segundo tipo de cultivo de células vegetales es el cultivo de protoplas- tos, los cuales son células vegetales desprovistas de pared celular. La eliminacién de la pared celular puede hacerse por medios fisicos 0 més comtinmente utilizando enzimas hidroliticas. Los protoplastos se obtienen y cultivan para su aplicacidn en ciertas técnicas como son la fusién, la clonaci6n celular, microinyeccidn y electroporacién. En algu- nas especies es posible regenerar plantas completas a partir de un solo protoplasto. Por tiltimo, es posible también el cultivo de células gamé- ticas aisladas con el fin de obtener tejidos o plantas haploides. 5. Cocultivo. Se le da este nombre al cultivo de cualquier tejido vegetal junto con otro organismo, generalmente un microorganismo. Se utili- za, por ejemplo, para la transformacién genética de tejidos vegetales con el sistema de Agrobacterium tumefaciens 0 A. rhizogenes. Los tejidos vegetales cultivados int vitro también pueden ser inoculados con virus © infectados con nematodos y de esta manera servir como modelo pa- ra el estudio de dichos patégenos. PRINCIPIOS BASICOS DEL CTV EICTV se basa en tres principios basicos, de cuya comprensién y mani- pulacién depende el éxito o fracaso de cualquier trabajo en este campo. Los principios basicos son los siguientes: "1Introduccién al cultivo de tejidos vegetales « Eleccién del explante, Se le llama explante al érgano, tejido o segmento de tejido vegetal que vaa ser utilizado para iniciar el cultivo. Este puede ser una semilla, un embridn aislado, un segmento de hoja, de tallo, de cotiledén, de raiz.o de organos reproductores, entre otros. En teoria, cualquier segmento de tejido vegetal que contenga células vivas pue~ de ser utilizado como explante. Sin embargo, debe tenerse siempre en cuenta que el tipo de explante que se elija sera determinante para la ob- tencién de la respuesta deseada, ya que cada uno de ellos responder o se comportaré de manera diferente al cultivo. Por regla general, entre més joven y menos diferenciado sea un tejido, mas facil ser su adap- tacién y respuesta al cultivo in vitro. Otro hecho a considerar es el que elaislamiento de un fragmento de tejido vegetal para ser cultivado en condiciones artificiales lleva implicito el cese de sus relaciones con otros drganos, tejidos y células de la planta completa. Estas relaciones deben ser de alguna manera compensadas por el medio y las condicio- nes de cultivo. * Eleccién del medio y condiciones de cultivo. El medio de cultivo junto conel tipo de explante determina la respuesta que se obtendra del mis- mo, por lo cual su eleccin y adecuada formulacién son uno de los aspectos fundamentales para el éxito del CTV. A grandes rasgos, el me- dio de cultivo consiste en dos grupos de componentes. Los primeros son los esenciales, es decir aquéllos que satisfacen los requerimientos nutricionales basicos del tejido cultivado. Este grupo incluye a los nu- trientes minerales, la fuente de carbono y algunas vitaminas. El segun- do grupo de compuestos son los Iamados opcionales, que si bien en ocasiones no son indispensables para mantener la vida del tejido cultivado, sf determinan en gran medida el tipo de respuesta que se obtendré de éste, y por lo tanto influyen en el éxito 0 fracaso del esta- blecimiento y repuesta de los cultivos in vitro. A este grupo pertenecen las fitohormonas o reguladores del crecimiento vegetal. Ademés de la formulacion del medio, es importante considerar las condiciones fisi- cas del cultivo (luz, fotoperiodo, temperatura y humedad), ya que és- tas contribuyen también a la respuesta del explante. * Condiciones asépticas. Para que el cultivo de cualquier tejido vegetal prospere de la manera deseada, debe excluirse del mismo a cualquier tipo de organismo contaminante, Esto resulta particularmente dificil debido a que los medios utilizados para el CTV son muy ricos, y por lo general, con un alto contenido de carbohidratos, lo que los hace idea- les para el desarrollo de, practicamente, cualquier microorganismo saprofito. Debido a lo anterior, tanto el material vegetal, como el me- dio de cultivo deben esterilizarse para evitar cualquier tipo de conta- minacién, El esquema bsico que resume estos principios se presenta en la Figura 1 12 F | Lek lend, Jd Jul eed Jd Soe! en! Lin) Jl Sl bee es J Je let tlm — faa ae1. Cultivo de tefidos vegetales CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES EXPLANTE MEDIO DE CULTIVO CONDICIONES ASEPTICAS RAICES DESARROLLO ADVENTICIAS ry NECROSIS EMBRIOGENESIS ‘SOMATICA LEERY ORGANOGENESIS TEsIDO cALLOSO ORGANOGENESIS EMBRIOGENESIS INDIRECTA SOMATICA way whee BROTES oO ee ADVENTICIOS Figura t Como puede apreciarse, la respuesta de un tejido al cultivo in Principias bsices vitro depende de la interacci6n entre el explante, el medio y las condi- oa ciones de cultivo, Esta respuesta se puede dar como organogénesis ns (formacién de érganos adventicios como rafces y brotes), embriogéne- sis somatica (formacién de embriones a partir de eélulas somaticas), formacién de tejido calloso 0 simplemente desarrollo del tejido. Una respuesta no deseable, pero que suele presentarse, es la necrosis del tejido, la cual es producto de una eleccién errénea del explante y/o del medio de cultivo. 13Introduccién al cultivo de tejidos vegetales EL LABORATORIO DE CTV A pesar de no ser el CTV una técnica que requiera de equipo muy sofisticado, si se debe contar con ciertas facilidades e instalaciones pa- a realizarlo de manera adecuada. Actualmente existen laboratorios de CTY, sobre todo aquellos que se dedican a la micropropagacién co- mercial a gran escala, que cuentan con equipos automatizados para realizar la mayoria de los procesos y trabajar con grandes voltimenes Ge material. Sin embargo, un laboratorio normal no requiere de tales complicaciones. Las necesidades minimas para un laboratorio de CTV podrian séf las siguientes: ‘+ Area general destinada a la preparacién de medios de cultivo, la cual deberé contar con balanzas, agitadores magnéticos y mate- rial de eristalerfa para la elaboraci6n de las diferentes mezclas, ast como refrigerador y congelador para almacenar aquellos compo- nentes que asi lo requieren y sitios para el almacenamiento de reactivos que no requieren de refrigeraciGn. Resulta de gran uti lidad contar con un horno de microondas que permita fundir répidamente los medios de cultivo. «Area para la esterilizacién de medios de cultivo, la cual deberd contar con autoclaves ya sean eléctricas 0 de gas. + Area de lavado de material, tanto de cristaleria como de recipien- tes de cultivo. «Area de transferencia aséptica. Esta deberd contar con al menos tuna campana de flujo laminar y tener los accesos controlados pa ra evitar corrientes de aire y entrada de contaminantes. = Cuarto de cultivo, Deberd contar con repisas dotadas de ilumi- naciény temperatura controlada para la incubacién de los cultivos. Se recomienda la iluminaci6n con lamparas fluorescentes debido ‘al excesivo calor generado por las lamparas incandescentes. «© Bllaboratorio debera contar con suministro de gas, electricidad, agua corriente, agua destilada y agua desionizada. 14 Tae Ls deme hn fms tJ Jot ffm ft emt fame fee ee2. MEDIOS DE CULTIVO Y NUTRICION IN VITRO DE LOS TEJIDOS VEGETALES La eleccidn de un medio de cultivo adecuado para la especie, tipo de explante y respuesta esperada determina en gran medida el éxito 0 fra- caso de los cultivos in vitro, por lo que siempre resulta un punto erftico a ser determinado experimentalmente En teorfa, los requerimientos nutricionales de los tejidos vegeta- les cultivados in vitro deben ser similares a los que se presentan en la planta completa bajo condiciones normales. Sin embargo, existen algu- nas diferencias importantes que deben ser consideradas. Primeramente, - salvo muy raras excepciones, los tejidos vegetales cultivados in vitro no son autétrofos, ya que su tasa fotosintética generalmente se en- z cuentra muy disminuida, Por lo anterior requieren de la adicién de una fuente de carbono organico en el medio para subsistir (Stephan- Sarkissian 1990), Ademis, los tejidos cultivados bajo estas condiciones requieren algunas substancias orgdnicas que en condiciones normales la planta es capaz de producir, como por ejemplo la tiamina. Estos _ compuestos, por lo tanto, deben adicionarse al medio de cultivo. Otra diferencia importante radica en la manera en que los nutrientes son E tomados por el tejido vegetal. En las plantas in vivo, la adquisicién de nutrientes es facilitada por un drgano especializado en ello (ratz), mientras que en los cultivos int vitro, son las células no especializadas expuestas al medio las responsables de tomar y distribuir los nutrien- tes. Ademds, a excepeién de los cultivos celulares en suspensién, el area de absorcién activa de nutrientes en un tejido vegetal cultivado in vitro es mucho menor a la que podria tener una rafz dotada de pe- r los radicales y en algunos casos de micorrizas (Leifert y col. 1995), Ena actualidad, se ha desarrollado una gran cantidad de medios de cultivo diferentes que cumplen con los requerimientos nutriciona- les necesarios para sostener el crecimiento de los tejidos vegetales cultivados in vitro, Algunos de estos medios son especificos y se adaptan a un solo tipo de tejido o a una determinada especie vegetal. Otros me- dios de cultivo son de uso mas general, es decir, pueden ser aplicadosIntroduccién al cultivo de tejidos vegetales al cultivo de una amplia gama de especies y tejidos diferentes. El de- sarrollo de la gran mayoria de estos medios de cultivo ha sido empitico, pasado tnicamente en pruebas de ensayo y error. Esto se debe a que todavia se desconoce mucho acerca de los tequerimientos nutriciona- les precisos de las células vegetales cultivadas ir vitro. Ademés, se tiene evidencia de que los requerimientos nutricionales pueden variar entre diferentes especies vegetales e incluso entre diferentes estados de desa- rrollo de una misma especie (Leifert y col. 1995). ‘Actualmente los medios de cultive mds utilizados son el MS (Murashige y Skoog 1962), el LS (Linsmaier y Skoog 1965) y el medio B5 (Gamborg 1968). Estos medios se usan por lo general cuando el ob- jetivo es la regeneracin in vitro de plantas, Otros medios que también se utilizan frecuentemente con otros objetivos son el NN (Nitsch y Nitsch 1968) y el N6 (Chu 1978). Los medios WPM (Lloyd y McCown 1980) y el DKW (Driver y Kuniyuki 1984) son frecuentemente usados en el cul- tivo de especies lentosas (Gamborg y Phillips 1995). ‘De manera general todos los medios de cultivo estan compuestos por los siguientes grupos de substancias (Endress 1994, Gamborg y Shyluk 1981, Kyte 1987): MACRONUTRIENTES Se trata de los mismos compuestos inorgénicos utilizados por las plantas, en condiciones normales: N, P, K, Ca, Mg y S. Nitrégeno (N). Es un elemento esencial que determina en gran medida la tasa de crecimiento del tejido. La carencia de nitrogeno se caracteri- za por un amarillamiento de las hojas, principalmente las més viejas, y por un crecimiento reducido o nulo del tejido. La mayorfa de los me- dios de cultivo tienen entre 25 y 60 mM de nitrégeno inorganico. Este se suministra en forma de nitrato (NO,) en concentraciones de 25-40 mM y/o de amonio (NH,’) en concentraciones de 2-20 mM. La proporcién entre estas dos formas de nitrégeno es una variable importante a considerar cuando se experimenta con diferentes medios de cultivo, En algunos tejidos, el amonio tiene un efecto benéfico, pero en otros puede resultar nocivo, sobre todo en concentraciones mayores a 8 mM. E] suministro de nitrogeno puede complementarse con alguna fuente de nitrégeno orgdnico, principalmente en forma de aminodcidos. Fésforo (P), Tiene un papel muy importante en el desarrollo de la plan- ta, pues se utiliza en la sintesis de écidos nucleicos y compuestos de alta energia y, ademas, participa en la activacién de diversas enzimas, En el medio de cultivo se suministra en forma de fosfatos de sodio (NaH,PO, H,O) 0 potasio (KH,PO, ), en un rango que va de 1 a3 mM. 16 Ba) agar Fen fn PT pF tf Pee PF a L dul, HU 111s Seal nl ease sad alllTabla 1, Micronutrientes utilizadas en los rmedios de cultivo 2. Medios de cultivo y nutriciém in vitro de los tejidos vegetales Potasio (K). Necesario para la divisién celular normal, sintesis de carbohidratos y clorofila y asimilaciGn de N. Su carencia origina un cre- cimiento débil y anormal. Se suministra en forma de nitrato (KNO,), fosfato (KH,PO, ) 0 cloruro (KCI), dependiendo del medio de cultivo. Se utiliza en concentraciones de 20 a 30 mM. Calcio (Ca). Participa como componente de las paredes celulares en for- ma de pectatos. Desempefia un papel importante en la regulacién de innumerables procesos celulares y en la estabilidad de membranas. Es adicionado en forma de cloruro (CaCl, 2H,O) o de nitrato [Ca(NO, ), 4HO] en concentraciones de 1a 3 mM. ‘Magnesio (Mg). Es el elemento central de las moléculas de clorofila y un importante cofactor enzimético. Es suministrado como sulfato (MgSO, :7H,0) en concentraciones de 1-3 mM. Azufre (S). Presente en las protefnas en forma de aminoécidos azufrados y constituyente de algunas vitaminas. Se adiciona al medio de cultivo como sulfato de magnesio (MgSO, 7H,O) 0 de amonio, en concentracio- nes de 1 a3mM. Los sulfatos de manganeso, zine, cobre y fierro suelen usarse como fuente de micronutrientes. MICRONUTRIENTES Ademéas de los macronutrientes anteriores, tanto las plantas normales como los tejidos cultivados in vitro requieren de otros compuestos in- orgdnicos en concentraciones generalmente mucho menores. Estos acttian basicamente como cofactores enzimaticos y algunosen sistemas de transporte de electrones. Los micronutrientes utilizados en los me- dios de cultivo, asf como sus concentraciones adecuadas, son los que se presentan en la Tabla 1 Delos micronutrientes mencionados, el Fe —,- _suele ser el mas limitante debido a su tenden- Fierro re [1 mM cia a precpitar en los medios de cultivo. Para : | evitar esto se suministra en forma quelada Manganeso 7 [Mn 20907 aM _ con EDTA o bien como citrato 0 tartrato, sin Boro B [25-100 [um embargo estas dos tltimas formas son po- con a co empleadas, ore ae | #M Un fenémeno importante a tomarse en [Molibdeno [Mo {1 iM cuenta con relacién a los macro y micco- + nutrientes, es el hecho de que existen varios [Cobalto co for uM | factores que pueden afectar su grado de Fredo eels GM disponibilidad en el medio de cultivo. En- tre los més importantes estén el tipo y la 7Introduccién al cultivo de tejidos vegetales concentracién del gelificante utilizado, las reacciones quimicas que ‘ocurren en el medio y que pueden causar la precipitacién de algunos nutrientes, los productos de la caramelizacién de los carbohidratos que ‘ocurre durante la esterilizacién, y la presencia de agentes quelantes en el medio. Por otro lado, la adquisicién de los nutrientes por parte de los tejidos cultivados puede verse limitada a causa de una toma insu- ficiente de los mismos a partir del medio o bien por una translocacién inadecuada a través de los explantes (Leifert y col. 1995). FUENTE DE CARBONO Normalmente las plantas utilizan el CO, atmosférico como fuente de carbono para la sintesis de todos sus componentes, esto mediante la fo- tosintesis. Los tejidos vegetales cultivados in vitro tienen una capacidad fotosintética muy reducida o nula, por lo que se les debe proveer de una fuente de carbono organico. La gran mayorfa de los medios de cul- tivo utilizan sacarosa en concentraciones del 2 al 3%, aunque esta concentracién puede ser mayor para algunas especies. Ademés de la sacarosa, se han probado otras fuentes de carbono como la glucosa, fructosa, lactosa, galactosa, rafinosa, maltosa'e incluso almid6n, pero con resultados casi siempre inferiores a la sacarosa. Finalmente, es importante considerar el hecho de que la sacarosa, ademas de servir al tejido como fuente de carbono, tiene un papel muy importante co- mo regulador del potencial osmético del medio de cultivo. Esto debe tomarse en cuenta cuando se altera su concentracién o se prueban fuentes alternas de carbono. VITAMINAS Y OTROS ELEMENTOS ORGANICOS En condiciones normales, las plantas tienen la capacidad de sintetizar todas las vitaminas requeridas para su metabolismo; sin embargo, los tejidos vegetales cultivados in vitro por alguna razén pierden total 0 parcialmente esta capacidad y se vuelven dependientes del suministro externo de estos nutrientes, Todas las oélulas vegetales cultivadas in vitro requieren tiamina y en algunos casos, se ha observado que resul- ta benética la adicién de piridoxina, acido nicotinico, biotina, dcido folico, acido aseérbico, cido pantoténico, riboflavina y écido p-aminobenzoico. Otro elemento organico importante en los medios de cultivo es e! mio-inositol, cuya adicién en concentraciones de 50-5000 mg/l estimula el crecimiento de la mayoria de los tejidos. Se ha pro- J) Jom_t Yon “Jt_Jat_Jo Jo Joi _Joi_JoniTont_JentJond_fd_Jot_fnt_a fant JJ built lang2. Medios de cultivo y nutricionin vitro de los tejidos vegetales bado también el efecto de algunos Acidos orgénicos como el citrato, malato, succinato y fumarato, pero su utilidad real es dudosa. Gene- ralmente, se ha observado un efecto benéfico de la adicién de los acidos orgénicos cuando la fuente de nitrégeno es el amonio. Fuentes de nitrégeno orgdnico. Ademés del nitrégeno inorgénico su- ministrado como nitrato 0 amonio, algunos medios de cultivo utilizan una fuente adicional de nitrégeno orgénico como complemento. Esto se ha visto que resulta benéfico en muchos casos. Como fuentes de nitrégeno orgénico se utilizan basicamente aminoacidos, ya sea en forma de mezclas complejas 0 como substancias individuales. Las mezclas de aminodcidos mas utilizadas son hidrolizados proteinicos, como el de caseina del cual se agregan de 2.a 10 g/l. Los aminodcidos individuales utilizados como fuente de carbono son Ia glutamina (has- ta 100 mg/1), la asparagina (hasta 100 mg/l) y la glicina (2 mg/1). Por iltimo, es importante mencionar que la adicién de algunos ami- nodcidos individuales en concentraciones altas puede tener un efecto inhibitorio en el crecimiento de ciertos tejidos. Complejos orgdnicos. En ocasiones se utilizan mezclas ongénicas comple- jas en los medios de cultivo, ya que se ha visto que éstas en algunos casos estimulan el crecimiento de los tejidos. El efecto de los complejos organicos se debe seguramente a la presencia en ellos de substancias no identificadas pero requeridas por las células. Con este fin se utilizan el agua de coco, el extracto de levadura y de malta, el endospermo de matz, el jugo de tomate, de naranja y pifia, y el extracto de plétano, entre otros. La utilizaci6n de este tipo de productos en el medio de cul- tivo debe tomarse como tiltimo recurso, dado el poco control que se tiene sobre los componentes de los mismos. Reguladores del crecimiento, Estos componentes constituyen sin duda uno de los elementos més importantes del medio de cultivo, ya que deter- minan en gran medida el tipo de respuesta de los tejidos. Sus tipos y aplicaciones seran discutidas mas adelante. Gelificantes. Cuando se trabaja con medio semisélido, debe utilizarse un gelificante para darle la consistencia adecuada. Este debe ser no reac- tivo y no digerible por el tejido vegetal. Los gelificantes mas utiliza- dos son el agar (0.5 -1%) y el Phytagel o Gelrite (marcas comerciales) en concentraciones de 0.2 a 0.3%, Alternativamente, pueden utilizarse puentes de papel filtro o poliuretano para dar soporte al tejido en un medio Ifquido. Es importante considerar que la mayoria de los geli- ficantes que son usados en la preparacién de medios de cultivo, con- tienen cantidades considerables de nutrientes minerales que pueden afectar el desarrollo de los tejidos (Leifert y col. 1995), Otros elementos. Algunos tipos de tejido requieren la presencia en el medio de cultivo de compuestos que adsorban algunas substancias = 19Introducci6n al cultivo de tejidos vegetales inhibidoras que son producidas por las mismas células durante el cultivo, o bien de substancias que impidan la oxidacin de los com- puestos fendlicos excretados. En el primer caso se utilizan el carbén. activado, la polivinilpirrolidona (PVP) y la polivinilpolipirrolidona (PVPP). Dichos compuestos pueden también adsorber en cierto grado algunos reguladores del crecimiento, lo cual debe tomarse en cuenta al utilizarlos. Por otro lado, para impedir la oxidacién de los tejidos vegetales cultivados in vitro, pueden usarse écido cftrico y/o asesrbi- co, cisteina y 8-hidroxiquinoleina. Otro tipo de compuestos utilizados en algunos medios de cultivo son los antibisticos, fungicidas y her- bicidas, ya sea para eliminar organismos contaminantes o para selec cionar tejidos vegetales resistentes a algiin tipo de agente selectivo en experimentos de transformacién genética. ‘Otro factor a tomar en cuenta en el medio de cultivo es el pH, el cual generalmente se fija entre 5.5 y 5.8, ajustdndolo una vez hecha la mezcla de los componentes. El pH se ajusta con KOH, NaOH y HC10.1N. En ocasiones los procesos metabélicos que tienen lugar en el tejido o la adicién de algunos componentes que se hace después del ajuste del pH, pueden causar variaciones en el mismo. Para evitar esto pueden utilizarse en el medio de cultivo estabilizadores de pH como el acido 2-morfolino etanosulfnico (MES 0.5-1.0 g/)). Finalmente, antes de su utilizacién, el medio deberé ser es- terilizado, esto se realiza en autoclave a una temperatura de 121 °C y tuna presion de 1.05 kg/cm* (15-20 Psi). El tiempo de esterilizacién depende del volumen contenido en cada recipiente individual, y aproxi- madamente es el que se muestra en la Tabla 2. Ciertos elementos orgénicos contenidos en el medio de cultivo pueden degradarse durante el proceso de esterilizacién con calor. Los componentes termolabiles deben esterilizarse por filtracién utilizan- do membranas estériles de 0.22 6 0.45 mm (Millipore) y agregarse al medio ya estéril y frio, si se trata de medio Ifquido. En el caso del me- dio semisélido, después de la esterilizaciGn, esperar a que se enfrie a 45-50 °C antes de agregar los componentes termolabiles filtrados. Mez- clar bien y vaciar en los recipientes de cultivo antes de que solidifique. ‘A continuacién se detalla el protocolo de preparacién de los me- dios de cultivo de Murashige y Skoog (MS), de Gamborg (BS) y de Nitsch y Nitsch (NN). Tabla 2 Volumen en ml | Tiempo en min a 121°C hasta 50 15 5 20 500 25 | 1500 35 2000 40 20 ones ee ee ee ee ee2.Medios de cultivo y nutricién in vitro de los tejidos vegetales MEDIO MS (MURASHIGE Y SKOOG 1962) PREPARACION Soluciones concentrad: SOLUCION A. Concentracién: 1 000 X. Volumen: 50 ml Cloruro de calcio CaCl, -2H,0 SOLUCION B, Concentracién: 1000 X. Volumen: 50 ml Yoduro de potasio KI Cloruro de cobalto CoCl, -6H,O SOLUCION C. Concentracién: 400 X. Volumen: 50 ml Fosfato monobisico de potasio KH, PO, Ac. bérico H, BO, Molibdato de sodio NaMoO, SOLUCION D. Concentracién: 400.X. Volumen: 50 ml Sulfato de magnesio ‘MgSO, -7H,0 Sulfato de manganeso Mn$0O, - HO Sulfato de zine ZnSO, -7H,0 Sulfato de cobre CuSO, -5 HO SOLUCION E. Concentracién: 200 X. Volumen: 100 ml Suliato ferroso FeSO, -7H,0 EDTA disédico Na, EDTA 22.000 g 41.50 mg 125 mg, 3.400 g O.124g 0.005 g 7.400 g 0340 g 0.1728 0.50 mg 0557 g 0.745 g Disolver ambos componentes por separado, para lo cual puede requeritse calentar. Agre- gar poco a poco la solucién de Fe a la de EDTA y aforar. Debe de quedar de color amarillo sin precipitados, SOLUCION F. Concentracién 100 X. Volumen: 100 ml Glicina 20.00 mg, Piridoxina HCI 5.00 mg Ac. Nicotinico 5.00 mg Tiamina HCI 1.00 mg, Mio inositol 1.00 g 21Introduccién al cultivo de tejidos vegetales PREPARACION DE 1 LITRO DE MEDIO MS 1. En un vaso de precipitados colocar unos 850 ml de agua destilada. Agregar volumen indicado de las soluciones concentradas. Solucin ‘Volumen (ml) A 1 B 1 Cc 25 D 25 E 5 F 10 2. Pesat, afiadir y agitar hasta disolver, los siguientes compuestos: Sacarosa 30.00 g Nitrato de potasio 1.90g Nitrato de amonio 1.65 g 3, Ajustar el pH del medio a5.7 con NaOH o HCI 0.1 N. Aforar a 1 litro con agua destilada 4, Si se trata de medio semisélido, agregar el gelificante y disolverlo calentando (se reco- mienda por rapidez utilizar horno de microondas). 5, Agregar los reguladores del crecimiento en caso de requerirlos, antes de ajustar el pH del medio de cultivo. 6. Distribuir en los recipientes de cultivo y esterilizar. 22 ere eee eee Jp bem feet Jt Jt fot tat td2. Medios de cultivo y nutricién in vitro de los tefidos vegetales MEDIO B5 (GAMBORG 1968) PREPARACION Soluciones concentradas: SOLUCION DE MICRONUTRIENTES. Concentracién: 1000 X. Volumen: 100 ml Sulfato de manganeso 1.000 mg, Ac. bérico 300 mg. Sulfato de zine 200 mg ‘Molibdato de sodio 25mg Sulfato de cobre 25 mg Cloruro de cobalto 25 mg SOLUCION DE VITAMINAS. Concentracién: 1000 X. Volumen: 100 ml Ac. Nicotinico Tiamina HCI Piridoxina HCl Mio inositol 100 mg, 1000 mg 100 mg 100 g SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO. Concentracién: 1 000 X.Volumen: 100 ml Cloruro de caleio CaCl, -2H,0 15.0 SOLUCION DE YODURO DE POTASIO. Concentraci6n: 1 000 X.Volumen: 100 ml Yoduro de potasio KI 75 mg,Introduccién al cultive de tejidos vegetales PREPARACION DE 1 LITRO DE MEDIO B5 24 ‘Tomar un recipiente adecuado con unos 850 mi de agua destilada y agregar 1 ml de cada una de las soluciones concentradas. Pesar, afadir y agitar hasta disolver, los siguientes compuestos: Sacarosa 20.000 g Nitrato de potasio 2.500 g Sulfato de amonio 0.134.g Sulfato de magnesio 0.2508 Fosfato de sodio 0.150 g EDTA fértico 0.043 g Ajustar el pH del medio a 5.5 con NaOH 6 HCl 0.1 N Si se trata de medio sélido, agregar el gelificante y disolverlo calentando (se recomienda por rapidez utilizar horno de microondas). Agregar los reguladores del crecimiento en caso de requerirlos, antes de ajustar el pH del medio. Distribuir en los recipientes de cultivo y esterilizar. jpm font Ye Jn Jt Jt tlt a tan amt ast tS sa atlanta2. Medios de cultivo y nutricién in vitro de los tejidos vegetales MEDIO NN (NITSCH Y NITSCH 1969) PREPARACION Soluciones concentradas: SOLUCION DE MACRONUTRIENTES, Concentracién: 100 X. Volumen: 1 litro Nitrato de amonio NH,NO, 72.00 g Sulfato de magnesio Mg SO, -7H,O 18.50 g Nitrato de potasio KNO3 95.00 g Fosfato monobasico de potasio KH,PO, 6.80 SOLUCION DE MICRONUTRIENTES, Concentracién: 100. Volumen: 100 ml Ac. bérico. HBO, L00g Sulfato de cobre CuSO, -5HO 2.50 mg, Sulfato de manganeso MnSO, -H,O 250g Molibdato de sodio NaMoO, 25.0 mg, Sulfato de zine ZnSO,-7 H,0 1.00 g SOLUCION Fe-EDTA. Concentracién: 100 X. 1 litro Sulfato ferroso FeSO,-7H,O 278g EDTA disédico Na, EDTA 3.73% SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO, Concentracién: 100. 1 litro Cloruro de calcio CaCl, -2H,O 16.6 g 25Introducci6n al cultivo de tejidos vegetales = PREPARACION DE 1 LITRO DE MEDIO B5 26 2. Pesar, afiadir y agitar hasta disolver 30 g de sacarosa. 4. Ajustar el pH del medio a 5.7 con NaOH 0 HCI 0.1 N. ' 1. Tomar un recipiente adecuado con unos 850 ml de agua destilada y agregar: 10 mi de a solucién de macronutrientes a 1 ml de Ja solucién de micronutrientes - 10 ml de la solucién de Fe-EDTA 10 ml de la solucién de cloruro de calcio En caso de requerirse afiadir una solucién de vitaminas (por ejemplo la de los medios MS 6 BS). 5, Sise trata de medio sélido, agregar el gelificante y disolverlo calentando (se recomienda por rapidez utilizar horno de microondas). 6. Agregar los reguladores del crecimiento en caso de requerirlos, antes de ajustar el pH. 7. Distribuir en los recipientes de cultivo y esterilizar.3. CONTROL HORMONAL DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO IN VITRO El desarrollo de cualquier tejido vegetal es un proceso sumamente complejo en el cual interviene un gran numero de factores externos ¢ internos cuyos mecanismos precisos de accién en muchos casos ain no estan claros. Entre los factores internos que controlan el desarrollo de los diferentes tejidos de una planta destacan los llamados regulado- res del crecimiento vegetal (RCV), también conocidos como hormonas vegetales o fitohormonas. Los RCV son compuestos orginicos sinteti- zados por la propia planta, que en muy pequefias cantidades alteran el crecimiento o los patrones de desarrollo de los tejidos vegetales. Los RCV se clasifican en 5 grupos bésicos dependiendo de su estructura quimica y su efecto fisiolégico: auxinas, citocininas, gi- berelinas, dcido abscisico y etileno. Actualmente se han aislado y estudiado otras substancias fuera de estos grupos, que podrfan ser también consideradas como RCY, como por ejemplo las poliaminas, jasmonatos, acido salicflico y los brassinoesteroides (Davies 1995). Hasta hace pocos atios se tenfa la creencia de que la mayoria de los fendmenos relacionados con el desarrollo de los vegetales podian ser explicados sobre la base de simples cambios en las concentraciones y tipos de estos compuestos presentes en un tejido. Actualmente se sa- be que el papel de la concentraci6n de estos compuestos en un tejido, aunque importante, no es tan determinante como legé a suponerse, pues hay oto tipo de consideraciones a tomar para explicar el proceso del desarrollo en las plantas. A pesar de lo anterior, los RCV tienen atin una gran importancia en campos como la agricultura, donde poseen un buen ntimero de aplicaciones précticas. Otro campo en donde des- tacael uso de los RCV es el Cultivo de Tejidos Vegetales, ya que mediante el manejo de los tipos, concentraciones y combinaciones de estos com- puestos en un medio de cultivo se pueden manipular hasta cierto gra- do los patrones de desarrollo de los tejidos y obtener las respuestas deseadas como la formacién de tejido calloso, brotes, embriones so- maticos y raices. Por lo anterior, el correcto manejo de los RCV en,Introducci6n al cultivo de tefidos vegetales cultivo in vitro de tejidos vegetales suele ser determinante para el éxito 0 fracaso del sistema. ‘Alutilizar los RCV en el cultivo de tejidos, se deben tener en men- te las siguientes consideraciones: * La respuesta de un tejido al cultivo in vitro es el producto de la interacci6n de los reguladores del crecimiento endégenos (pro- ducidos por el propio tejido) y aquellos exdgenos afiadidos al medio. De acuerdo a esto, cada tejido puede responder de mane- ra diferente a una misma concentracién de reguladores del creci- miento a causa de diferencias en el contenido de reguladores endégenos. * La respuesta del tejido a los reguladores exdgenos depende en gran medida del estado fisiolégico particular de dicho tejido, ast como de su origen y tipos celulares presentes en el mismo, Cada tejido tiene una determinada “sensibilidad” ante los reguladores del crecimiento, lo que los hace mas 0 menos capaces de responder ante ellos. La sensibilidad puede definirse como la capacidad de respuesta a los RCV y esté dada por la cantidad de receptores especificos para los reguladores del crecimiento presentes en el tejido. Esto también es causante de la respuesta diferente de cada tipo de tejido ante un mismo tratamiento. + Las concentraciones de RCV que se utilizan normalmente en los medios de cultivo exceden por varias érdenes de magnitud a las concentraciones fisiclégicas de estos compuestos en los tejidos. Esto debe ser tomado en cuenta al intentar explicar las respues- tas de un tejido int vivo mediante observaciones hechas in vitro. La Figura 2 resume los diferentes factores que influyen en la respuesta de un tejido cultivado in vitro a la adicién de RCV ex6genos. Como puede apreciarse, estos factores hacen que la respuesta del teji- doa los RCV exégenos no sea simplemente proporcional a la cantidad que se afiada al medio de cultivo. Los RCV mis utilizados en los cultivos in vitro son los pertene- cientes a los grupos de las auxinas y de las citocininas, ya que son los que regulan en gran medida los procesos de crecimiento y desarrollo organizado en los cultivos de tejidos vegetales. En menor grado se uti- lizan algunos reguladores no pertenecientes a estos grupos como las giberelinas y el Acido abscisico. AUXINAS Las auxinas son un grupo de compuestos derivados comtinmente del triptofano, sintetizados por lo general en los pices, y que estén im- plicados en varios eventos relacionados con el crecimiento y diferenciacién celular. Se sabe que participan en la regulacién de algu- 28 = 4 4 4 4 AENIDOO Figura 2 Reswmen de los diferentes factores que influyen en ta respuesta de un tejido cultivado in vitro ala adicién de RCV exégenos. CANTIDAD DE RCV ‘SUMINISTRADOS AL CULTIVO IN VITRO CANTIDAD REAL DE RCV PRESENTES EN EL CULTIVO IN VITRO ‘ACTIVIDADES DE LOS RCV EN EL SITIO DE ACCION ~ FACTORES GENETICOS CELULAS BLANCO) RESPUESTAS DEL TEJIDO 3. Control hormonal del crecimiento y desarrolioin vitro DEPENDE DE: ~ EXPERIENCIA PREVIA ~ EXPERIENCIA CON ESPECIES SIMILARES ~ EXPERIMENTACION DEPENDE DE: = CANTIDAD DE RCV ENDOGENOS - ERRORES DE MEDICION ~ HABILIDAD DURANTE LA ESTERILIZACION ~ TASA DE ABSORCION POR EL TEJIDO ~ DISTRIBUCION DENTRO DEL TEJIDO ~ METABOLISMO Y DEGRADACION DEPENDE DE: ~ SENSIBILIDAD DE LAS CELULAS AL RCV ~ INTERACCION CON OTROS RCV TANTO EXOGENOS COMO ENDOGENOS ~ HABITUACION DEL TEJIDO nos procesos que ocurren en los tejidos vegetales como el crecimiento celular, la acidificacién de la pared celular, el inicio de la division ce- lular, la formacién de tejidos no diferenciados (tejido calloso), la diferenciacién del tejido vascular y la formacién de érganos (raices). En las plantas completas las auxinas tienen que ver con la dominancia apical, afectan la senescencia y abscisi6n de las hojas y coordinan algu- nas respuestas trépicas. La auxina natural mas comiin es el écido indolacético (AIA) (Figura 3), pero dependiendo de la especie, edad de la planta, estacién del afto y condiciones de crecimiento pueden apare- cer otras auxinas naturales en los tejidos, como por ejemplo el Acido 4-cloroindol-3-acético, el Acido indol-3-acrilico 0 el Acido indolbutirico (AIB) (Figura 3). Ademés, algunos precursores de las rutas biosintéti- cas de las auxinas pueden tener actividad propia como auxinas y subs- tituir asf al AA (Gaspar y col. 1996). Las auxinas naturales puedenIntroducci6n al cultivo de tejidos vegetales ‘OCH,-COOH Acido indolacético (AIA) Acido 2,4-diclorofenoxiacético (2.4-D) a a Acido naftalenacéico (ANA) Acido 4-amino-3 5 ricloropiridin 2- carboxilico (Picloram) Acido indolbutitico (AIB) encontrarse con frecuencia conjugadas con otros compuestos como Figura 3. alcoholes, aminodcidos y azticares. Esto parece ser un mecanismo de al- Estructura macenamiento temporal y estabilizacién de la concentracién de auxinas tele activas. El AIA y el AIB se utilizan frecuentemente en los medios de soon urine cultivo. Por ser compuestos que se encuentran naturalmente en la es planta, tienden a ser metabolizados por los tejidos; ademés, éstos se desnaturalizan con relativa rapidez en el medio. Esto hace que la 30 age atee eee ee ee 3. Control hormonal del crecimiento y desarrolioin vitro rates one de : 3 Nombre | Nombre] ayy | Gatje | soveme | Mode de duis me comin | ®M | tabi evilzadin| wade . culo tt ‘do mia pen NaoH | Taare ves indolacético (IAA) 47521)10.01-3.0 1N — filtracién acido ANA NaOH naftalenacético (NAA) ace-2 |r 1N Bieta acido AIB NaOH | -autoclave | indolbutirico (IBA) FB 2 | Ono, 1N ~ filtracién ‘do 2e Sor Sil 2a [rao] oorso | MIN | ~autcove teowacien eTANOL Neon] ~ouodave [sotcnimeo vas2 | oano | AQ [ext Taio : NOH fede | non [waz] orano | SO | —ocave tide paa | 1362 | 01-500 | sano | ~ autoclave tectico ; “econ feel Pciars CPA | 186.6 | 0.1-10.0 | ETANOL | - autoclave tence adcido 2,4,5- rio aast [sss] oxo | rranot | ~auodave fenoxiacético coe PICLOR cinoticlo aais| o100 | pvso | -sunive ; aa | |i edo : NaoH | ~astoave indolpropiénico | TA | 1892 | 01-100 IN | ~filteacion disponibilidad real de estas auxinas en el medio de cultivo disminuya paulatinamente, lo cual resulta titil en aquellos procesos que requieren altas concentraciones de auxinas sélo para la induccién inicial de los mismos (por ejemplo el enraizamiento) (Gaspar y col. 1996). Actual- mente se conocen y utilizan varios compuestos sintéticos que tienen una fuerte actividad de auxinas, como los dcidos fenoxiacéticos, que son utilizados como herbicidas en altas concentraciones. Estos com- puestos artificiales suelen ser mas activos, ya que las células vegetales carecen en muchos casos de sistemas enzimaticos para degradarlos. Fjemplos de auxinas attificiales son el écido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), el acido naftalenacético (ANA) y el acido 4~amino-3,5,6- tricloropiridin-2-carboxflico (Picloram) (Figura 3).Introducci6n al cultivo de tejidos vegetales CITOCININAS Las citocininas generalmente son derivados de la adenina y son sintetizadas en tejidos jévenes y raices. Posen dos propiedades que as hacen muy titiles para el cultivo in vitro de tejidos vegetales; por un lado estimulan la divisién celular y por otro rompen Ia latencia de las yemas axilares haciéndolas brotar. Ea las plantas completas, las ‘Gtocininas promueven la brotacién de yemas axilares, estimulan la ex: pansién de las hojas y retardan la senescencia. Junto con las auxinas, las Etocininas regulan la divisién celular. Debido a lo anterior, el balance entre auxinas y citocininas en un cultivo in vitro suele ser determinante para el patron de desarrollo que siga el teido, Las respuestas que puc- Hen esperarse del tejido ante el balance auxinas/ citocininas se muestran en la Figura 4, pero pueden presentarse variaciones notables entre es- pecies y tejidos. Figura 4. Respuestas ‘generadas en los ‘ultioos in vitro por las auxinas y citocininas. CONCENTRACION ‘CONCENTRACION DE AUXINAS DE CITOCININAS _ RESPUESTA PRODUCCION DE RAICES EMBRIOGENESIS TEJIDO CALLOSO ~ BROTES ADVENTICIOS ~. PROLIFERACION DE YEMAS Las citocininas naturales mas comunes son a zeatina, Ia iso- pentiladenina (2iP) y el ribésido de zeatina (Figura 5). Estas citocininas Raturales se caracterizan por poseer un esqueleto de adenina con una cadena lateral isoprenoide (Gaspar y col. 1996). Las citocininas sintéti- cas benciladenina (BA) y cinetina son las mas utilizadas en el cultivo in bitvo de tejidos vegetales. Algunos herbicidas sintéticos como las fe- hilureas tienen actividad de citocinina en bajas concentraciones. Un ejemplo de esto ultimo es el N-fenil-N’-1,2,3-tidiazolil-S-urea (Tidiazurén) (Figura 5). 32} ) ye Je} — bee RRR eR 3. Control hormonal del crecimiento y desarrolioin vitro , LL Isopentiladenina (21P) Ribésido de oe Benciladenina (BA) Zeatina f NN N-fenil-N“-1,2,3-tidiazolil-5- Cinetina urea (Tidiazurén) Figura 5. Estructura ‘qutmicn de algunas Citocininas naturales y sintéticasIntroducci6n al cultivo de tejidos vegetales ‘Tabla 4. Citocininas Cone. de i, | mds utilizadas Nombre [Nombre] pm | trabajo | Solvente Miao | en el Cultivo de (mg/D ee | ‘Tejdos Vegetales. r | . NaOH | — autoclave Tpenciladenina | BA [2253] 01-100) “3x" | — filtracion \ 5. NaOH | - autoclave cinetina can }2132| o1-t00 | NIN" | 7 ftteacién — = | Neon [= eutodave | adenina ae 203.2 | 1.0-30.0 IN = filtracién, adenina x35.1| 50-250 | HCIIN | - autoclave hemisulfato 184.2] 50-250 AGUA | - autoclave de adenina TIDIA- fentiaiazot | Zuxdw | 2202| o0or-01} DMSO | ~ Fite urea 12) ~ filtracion NaOH | — autoclave zeatina zea |n92| 0050 | NIQ | > fitracion difenilurea ppu | 2123] 0.1-10 DMsO | - filtracin ]eoropicin | gcepu [24727 oo0t-1.0} DMSO | - filteacion ‘Ademés de las auxinas y itocininas que son con mucho los RCV més utilizados en los cultivos int vitro, el Acido giberélico ¥ el Acido abscfsico (Figura 6) tienen algunas aplicaciones en procesos fisiolégicos ten los tejidos. El 4cido giberélico puede utilizarse en algunos casos pa- Figuaé. — ta la elongacion de estructuras como brotes, asi como para acelerar la Estructura brotacidn en ciertos tipos de yerias y meristemos. Por su parte el Acido qutmica del — aenisico ae utiliza en raras ocasiones para inkibir la germinacién de Acido giberdico embriones somaticos o para completar el proceso de maduracién de los ee ydel — Acido abslsica. mismos. Acido giberdlico3. control hormonal del crecimiento y desarrollo vitro A Nombre] pap | Comet Método de (ts eure Al Nombre |"man | P| table | Sst | ce sn| Genny j substancias afines ~ . NaOH | = autoclave utilizadas en el Scido abscisico | ABA [2643] 01100 | an | — filtracion Cultivo de Teidos Vegetales. iado3e . ‘ctv eign | 210 01-100 | eTANOL | ~stacn e| autoclave | | cain gies | on, [ma] ome [eranor | ~peeeee ry ‘ 5 oul. | sido meni 2103} 89% Petawor | vac : wor FY Sedo maleic rian foorsao | SCH | stacgn | hasta = autoclave Mrogcnl vasa] fs | acua | ~awodee Teoronett | GLO! ne re ~ (slicina SATO e 1N ane Algunas recomendaciones generales para él uso de los RCV en el | CTV son las siguientes: + Cuando se ignora la concentraci6n a utilizar de algin RCV para 5 inducir una respuesta deseada en el tejido, puede realizarse un experimento preliminar tomando los limites inferior y superior = del rango de concentraciones recomendado, asf como el valor intermedio. Con el resultado obtenido podrd montarse un expe- rimento mds fino para determinar la concentracién més apropiada ‘+ Para preparar una solucién concentrada de cualquier regulador del crecimiento, debe pesarse la cantidad indicada y disolverse en el menor volumen posible del solvente, lo cual puede tomar tiempo. Una vez disuelto se afora al volumen final con agua + Aquellos reguladores en que se indican tanto el autoclave como la filtracién como métodos de esterilizacién, pueden perder una parte de su actividad si se esterilizan con calor. Para experimen- tos eriticos se recomienda esterilizarlos por filtracién a través de membranas Millipore. Esta pérdida de actividad también pue- de compensarse incrementando un poco la concentracién del RCV.|. PROBLEMAS ASOCIADOS AL CTV Y FORMAS DE COMBATIRLOS CONTAMINACION Una de las condiciones bésicas que se requieren para el CTV es la asép- sia, es decir, la ausencia en el sistema de cualquier organismo conta- minante que pudiera afectar los resultados o incluso matar al tejido vegetal cultivado, Por desgracia la contaminacién de los cultivos es un fenémeno frecuente, que se ve facilitado por el hecho de que se utili- zan medios muy ricos, en los cuales prospera una muy amplia gama de microorganismos. Los contaminantes presentes en los cultivos de teji- dos vegetales pueden ser hongos, incluyendo levaduras o bacterias, aunque los tejicos pueden ademas contener virus, viroides o micoplas- mas, Entre los hongos, los que suelen aparecer con mayor frecuencia como contaminantes en los cultivos pertenecen alos géneros Penicillium, Candida, Cladosporium, Aspergillus, Botrytis, Alternaria y Fusarium, En cuanto a las bacterias, suele presentarse contaminacién tanto por Gram positivas como negativas. Entre las primeras destacan los géneros Actinomyces, Bacillus, Bordetella, Lactobacillus, Staphylococcus, Micrococcus y Streptomyces, mientras que entre las Gram negativas son frecuentes Acinetobacter, Agrobacteriuin radiobacter, Erwinia, Klebsiella, Pseudomonas y Xanthomonas (Cassells 1991, Leifert y col. 1994), La mayoria de los microorganismos contaminantes crecen muy répidamente bajo las condiciones en que se cultivan los tejidos vegeta- les, por lo que su presencia se hace claramente visible a los pocos dias de iniciado el cultivo. Sin embargo, existe una minorfa de microorga- nismos para los cuales el medio no resulta apropiado, por lo que su crecimiento es sumamente lento y no son facilmente detectables en el cultivo. A estos contaminantes sé les denomina eripticos 0 sublimina- les y son los responsables en la mayoria de los casos del llamado efecto de halo alrededor de los explantes. La detecci6n de este tipo de conta- minantes puede realizarse ya sea colocando segmentos del tejido enIntroduccién al cultive de tejidos vegetales medios apropiados para estos organismos y observando si se presenta crecimiento de los mismos o bien por pruebas seroldgicas. Existen dos fuentes probables de contaminacién para los culti- vos; primeramente, aquélla que proviene de los instrumentos utilizados y las condiciones en que se manipulan los mismos y, segundo, aquélla {que proviene del explante mismo. Para combatir la contaminaci6n derivada de la manipulacién del cultivo, deben tomarse las siguientes precauciones: ‘© Realizar todas las manipulaciones que impliquen la exposicién de los tejidos o del medio de cultivo en area axénica, siendo lo ideal trabajar en una campana de flujo laminar. ‘+ Esterilizar todos los implementos utilizados para la manipulacion de los tejidos antes de hacer uso de ellos. Los instrumentos me- télicos como pinzas, bisturies y espétulas pueden mantenerse en etanol al 70% y flamearlas cada vez que se usen; sin embargo, de- ben entfriarse en agua destilada estéril antes de ponerlosen contac- to con el tejido. + Los frascos o recipientes de cultivo deben permanecer sellados en un ambiente libre de polvo y de corrientes de aire durante el pe~ riodo de incubacién. Sin embargo, existen especies que requieren intercambio gaseoso con el ambiente externo para su correcto desarrollo, En este caso, los recipientes de cultivo deben incubar- se tapados, pero no sellados, o bien, pueden utilizarse tapas que contengan un area cubierta por una membrana muy fina. Estas tapas permiten el intercambio gaseoso, pero impiden la entrada de contaminantes. El segundo tipo de contaminacién es la que se deriva del explante mismo, siendo ésta mas diffcil de controlar. Las superficies vegetales son el habitat natural de un gran ntimero de microorganismos poten- cialmente contaminantes, que deben de eliminarse antes de iniciar el cultivo iit vitro. Por otro lado, existe un grupo importante de microor- ganismos llamados endotiticos, cuyo habitat se encuentra dentro de los tejidos vegetales, ya sea en espacios intercelulares o incluso dentro de las células. Los microorganismos que pertenecen a este segundo grupo son précticamente imposibles de eliminarse por métodos convencio- nales, por lo que al presentarse dificultan enormemente el estable- cimiento de los cultivos. Para la eliminacién de los microorganismos superficiales existen varios métodos de esterilizacién del tejido, que se- ran discutidos més adelante. Para Ia eliminacién de los microorganis~ mos endofiticos, existen dos métodos; el primero de ellos es el uso de antibisticos, lo cual desde Iuego no es efectivo contra virus y viroides. Las desventajas de este método son el efecto que los antibiéticos pueden tener sobre las células vegetales, y el hecho de que estos compuestos suelen detener la multiplicacién de los microorganismos, pero no necesariamente los matan a todos. Los microorganismos que se mantie- nen vivos de esa manera pueden reanudar su multiplicacién al degra- darse el antibidtico o al subcultivar los tejidos en un medio que carezca del mismo. El segundo método es el aislamiento y cultive demeristemos 38 ell hoe da4. Problemas asociados al CIV y formas de combatirios combinado con quimioterapia o termoterapia para eliminar pat6genos Este método suele dar buenos resultados, pero resulta complicado. Laesterilizaci6n superficial de los tejidos vegetales se realiza ba- sicamente mediante el empleo de compuestos quimicos capaces de eliminar a los microorganismos. Para ello, debe considerarse el hecho de que cualquier agente quimico que mate microorganismos también causaré dato al tejido vegetal, por lo que la Tabla 6. Agentes quimicos ‘mds utilizados Inesterilizacion ie tejidos vegetales a Tiempo | Principal limitante en este punto es encon- Agente | Concentracién | min) | trar un sistema que mate a la inmenga ma- 2 e yoria de los microorganismos causando el Beasties 05-5% 5-30 menor dafio posible a las células vegetales, = s ‘Tomando en cuenta lo anterior, es suma- oe Hipodlorite de none 5.39 | mente dificil obtener un porcentaje de calcio contaminacién de cero, por lo que siempre debe considerarse un margen de pérdidas i Nitrato de plata 1% 5-30 por contaminacién al iniciar un cultivo. El #n método general para la esterilizacién su- Cloruro de 01-1% 2410 perficial de tejidos vegetales consta de un _ hasntnoemed lavado previo de los mismos con agua co- 4 in nee. as rriente y un detergente suave, seguido de un tratamiento con el agente quimico esterili- zante y, el enjuague de los tejidos con agua ti Isopropanol 70% 053 destilada estéril en un ambiente aséptico. En = la Tabla 6 se presentan los agentes quimicos Perdxido de 3-12% 515 més utilizados para la esterilizacién de oe hidrsgeno tejidos vegetales asf como su concentracién Zephiran (orure | 991-01 % ei y tiempo de exposicién recomendable. de benzalkonio) La esterilizacién exitosa del explante suele ser un paso critico para el estable- cimiento de un cultivo in vitro. Por desgra- cia este proceso puede ser sumamente dificil Antibisticos 40-500 mg/1 | 30-90 * Los blanquesdores comerciales contienen aproximadament® tun 5% de hipoclonto de sodio, por lo que pueden ser utli- zados en concentaciones del 10 al 100% ‘Su uso es poco recomentable debido a su alta toxicdad, en algunos casos por lo que deben hacerse modificaciones adaptaciones a los mé- todos usuales, para lo cual pueden tomarse en cuenta las siguientes recomendaciones + Laprobabilidad de que un explante lleve contaminantes aun des- pués de esterilizado es directamente proporcional al tamafio del mismo, por lo que entre més pequefio sea el explante, menor es, la probabilidad de que leve contaminantes. Sin embargo, los ex- plantes de tamafio pequefio tienen una menor probabilidad de sobrevivir y establecerse; ademas entre mayor sea la proporcién de superficie herida en relacién con el tamafio total del explante, mayor serd la probabilidad de necrosis causada por fenémenos como la oxidacién, ‘+ Aquellos explantes con una superficie irregular 0 cubierta de ce- ras, vellosidades o tricomas, dificultan la penetracién del agente esterilizante por lo que requieren un mayor tiempo de exposicion al mismo. Desgraciadamente, un mayor tiempo de tratamiento ~ 3940 Introduccién al cultivo de tejidos vegetales resulta casi siempre nocivo para el tejido, de ahi que sea reco- mendable facilitar de algtin modo la penetraci6n del esterilizante en lugar de incrementar el tiempo de exposicién. Esto puede lo- grarse ya sea aplicando vacio por un corto tiempo al utilizar al agente esterilizante y/o agtegdndole al mismo algtin detergente suave como el Tween 20 para disminuir la tensi6n superficial y facilitar su penetracion. Una combinacién en serie de varios de los agentes mencionados suele resultar mejor y menos nocivo para el tejido que el incre- mentar el tiempo de exposicién a uno solo de ellos. Por ejemplo, el utilizar etanol al 70% por 40 seg seguido de blanqueador co- mercial al 15-20% por 15 min suele dar muy buenos resultados con ciertos tipos de explante. Sin embargo, es conveniente recal- car que los tratamientos deben ser aplicados uno después de otro y no mezclando los agentes esterilizantes. En ocasiones, los lavados previos del explante pueden resultar tan importantes como la esterilizacién misma, Es recomendable, pues, extender lo mas posible estos lavados con el fin de utilizar tratamientos de esterilizacién menos drasticos, En casos extremos, pueden lavarse los explantes toda la noche colocandolos en abun- dante agua con un detergente suave y bajo agitaci6n, para dar al dia siguiente varios enjuagues y proceder luego a la esterilizacién. Una alternativa a la esterilizacién de los explantes es la utiliza- cidn de cultivos axénicos que sirvan como fuente de tejidos u 6x- ‘ganos, Para esto, se deben esterilizar semillas y germinarlas bajo Condiciones asépticas para obtener pléntulas, cuyas partes pue- den ser utilizadas como explante sin necesidad de esterilizarlas, Una de las ventajas de esta alternativa es que las semillas son mu- cho ms resistentes al tratamiento con agentes esterilizantes, lo {que permite una mayor exposicién a los mismos elimindndose ast una mayor proporcisn de contaminants. Cuando se tiene fic acceso a las plantas madre de donde se toma- rin los explantes, suele resultar muy util para reducir la con- taminacién, un pretratamiento con fungicidas y el colocarlas en ‘un ambiente lo mds limpio posible unas semanas antes de tomar los explantes. Los explantes susceptibles a la contaminacién deben inocularse con una densidad lo més baja posible, de preferencia uno por re- cipiente de cultivo. De esta manera el hecho de que un explante se contamine no repercutiré en la pérdida de otros Finalmente, en ocasiones a pesar de que se tomen todas las precauciones mencionadas, los porcentajes de contaminacién se mantienen muy altos, (hasta en un 90%). Esto se debe a las condiciones de la planta madre y resulta practicamente imposi- ble reducir 1a contaminacién sin dafar el tejido. En este caso, queda la opcién de trabajar inicialmente con un ntimero muy al~ to de explantes, esperando que aun después de las pérdidas por contaminacién queden suficientes para iniciar el cultivo. Jp jot jm jojo ja ftom jot fom4, Problemas asociados al CIV y formas de combatirios Como se ha mencionado, aun con todas las precauciones antes citadas, es relativamente comiin el hecho de que se presente con- taminacién en los cultivos. Esta contaminacién puede aparecer al momento de iniciar el cultivo, durante la incubacién o durante los subcultivos. En muchos casos es dificil encontrar la causa o la fuente de la contaminaci6n, por lo cual también resulta dificil evitarla. En la Tabla 7 se resumen algunas posibles causas de contaminacién en di- ferentes etapas del cultivo asf como la forma de evitarlas o disminuirlas. Forma de evitar Btapa Causa de contaminacién A ons 1. Presencia de patogenos. 1. No utilizar plantas con sintomas fitopatolégicos como fuente de explantes. 2. Plantas ereciendo en 2. Pretratamientos para sanear ambientes muy contaminados. | las plantas 15-30 dias antes de tomar los explantes. Seleccién de plantas madre 3. Método de esterilizacion | 3. Probar otros métodos y inadecuado. agentes esterilizantes, 4. Falta de penetracién del 4. Utilizar vacio 0 detergentes Esterilizacion de los explantes | Ne rehisante, 5. Baja concentracin de cloro | 5. Usilizar soluciones nuevas. activo en el esterlizante, No dejarlas destapadas, 6. Poco tiempo de 6. Revisar el autoclave, esterilizacién o temperatura _| incrementar el tiempo de inadecuada, esterilizacién. Preparacion del medio de |. Almacenamiento inadecuado } 7. Almacenar en un ambiente cultivo del medio. limpio los recipientes con medio de cultivo, cerrados herméticamente y sellados con plastico. 8. Contaminacién proveniente | 8. Verificar el funcionamiento del aire. de la campana de flujo laminar (prefiltro, filtros y potencia del motor, posibles fugas de aire) Verificar la técnica utilizada por el operador. 9. Instrumentos y accesorios _| 9. Flamear frecuentemente Subcultivos utilizados en la manipulacién | pinzas, espatulas y bisyyries. del cultivo. Verificar esterilidad del agua y las cajas de petri utilizadas. 10. Cultivos utilizados como _| 10. Verificar el estado de los fuente de inéculo con cultivos antes de subcultivar. contaminacién criptica UL. Verificar las tapas y sellos U1. Contaminacién durante et | de los recipientes, sanear el perfodo de incubacién. ambiente de incubacion. Tabla 7. Causas mds frecuentes de contaminacign en el establecimiento y mantenimiento de cultivos in vitro. - a a| Introduccién al cultivo de tejidos vegetales VITRIFICACION Frecuentemente, sobre todo en algunas especies, los tejidos cultivados in vitro toman un aspecto vitreo y presentar: deformaciones evidentes. Esto se debe a toda una serie de desdrdenes anatémicos, morfolégicos y fisiol6gicos causados al parecer por las condiciones en que se realiza el cultivo. A este fenémeno se le aplica el nombre de vitrificacién. Las condiciones que se cree favorecen la vitrificacién de los tejidos son el exceso de nutrientes, el exceso de carbohidratos, los altos niveles de reguladores del crecimiento, la baja intensidad luminosa y, sobre todo, Ja alta humedad relativa y la alta disponibilidad de agua en el medio (Ziv 1991). Hastala fecha, se conoce muy poco acerca de este fendmeno, pero se sabe que el aspecto vitreo y las deformaciones son tinicamen- te el producto final de toda una serie de eventos que comienzan mucho antes de que se presente un sintoma visible. Algunas de las caracteris- ticas que se han encontrado en los tejidos vitrificados son: hiperhidra- tacion, con una pérdida aparente del control de las relaciones hidricas del tejido, paredes celulares delgadas y poco lignificadas, grandes espacios intercelulares llenos de agua, deformaciones en la cuticula e incluso atrofia de los estomas. Las plantas vitrificadas, aunque en ocasiones son capaces de prosperar int vitro, no tienen ninguna posibilidad de adaptarse exito- samente a las condiciones externas. Algunas plantas como el clavel, la gerbera, algunos frutales y las cactéceas, son especialmente suscepti- bles a la vitrificacién, Aun cuando el fendmeno de vitrificacién no esta bien entendido, se sabe que se puede evitar en cierta medida utilizan- do altas concentraciones de agar en el medio (0.8-1.2%), afladiendo polietilenglicol, reduciendo la concentracién de reguladores del cre- Gimiento y utilizando algunos compuestos como el floroglucinol. OXIDACION La obtencién de un explante para iniciar un cultivo in vitro implica casi invariablemente la necesidad de causar heridas en el tejido vegetal; de hecho, estas heridas facilitan la respuesta del tejido al permitir la entrada de nutrientes y RCV, por ejemplo en la organogénesis. Sin embargo, cualquier tejido vegetal que es herido excreta una gran cantidad de compuestos que intervienen en el proceso de cicatrizacion y defensa contra patégenos, la mayorfa de los cuales pertenecen al gru- po de los compuestos fendlicos. Estos compuestos, al contacto con la atmésfera tienden a ser oxidados causando un oscurecimiento del teji- do. Esta oxidacién conlleva la generaci6n de radicales como las quinonas que resultan altamente t6xicos para los tejidos vegetales. En muchas a2 ‘ye Jj jj jt Joo tte4, Problemas asociados al CTV y formas de combatirlos plantas, sobre todo lertosas, este oscurecimiento debido a la oxidacién llega a ser tan intenso que causa la necrosis completa del explante con la consecuente pérdida del cultivo. Este fendmeno, aunado ala conta- minacién, hace sumamente dificil el establecimiento de cultivos de lefiosas, sobre todo cuando se parte de explantes tomados de plantas adultas. Algunas de las maneras de evitar 0 al menos reducir este fenémeno son: Cortar los explantes en un recipiente con agua abundante (por supuesto estéril), cambiéndola frecuentemente-(esto para elimi- nar los compuestos que estén siendo excretados). Se pueden afiadir a dicha agua compuestos antioxidantes; por ejemplo, uha mezcla de dcido citrico 100 mg/1y acido ascérbico 150 mg/I, Ios cuales deben esterilizarse por filtracién. Agregar antioxidantes al medio de cultivo, como los mencionados arriba u otros como cisteina, ditiotreitol y metabisulfito de sodio, aunque éstos pueden resultar t6xicos al tejido en ciertas con- centraciones, Utilizar en el medio de cultivo agentes que adsorban los com- Puestos fendlicos excretados, como el carbén activade, ficol, la PYP y la PVPP (2-5 g/D. Debe tenerse en cuenta que estos pueden absorber también ciertos componentes del medio, como por ejem- plo los RCV. Subcultivar muy frecuentemente, (por ejemplo cada 24-48 hrs), hasta que cese la excrecién de los compuestos fendlicos. Suele ser muy itil también incubar a bajas temperaturas los tejidos los primeros das. Si se les da un pretratamiento con frfo a los explantes antes de la inoculacién, suele reducirse un poco la excrecién de compuestos fendlicos al medio de cultivo.Se le denomina tejido calloso a una masa amorfa de células vegetales poco diferenciadas y de répida proliferacién. En condiciones naturales este tejido aparece como un mecanismo de cicatrizacién cuando se pre- sentan heridas o bien en tumores ("agallas”) inducidos por algunos organismos fitopatégenos como la bacteria Agrobacterium tumefaciens (Foto 1a). La aparicidn natural de tejido calloso se da como consecuen- cia de un cambio en los niveles enddgenos de reguladores del cre- cimiento, basicamente auxinas y citocininas. Este tipo de tejido puede también obtenerse y mantenerse in vitro con relativa facilidad cuando se manejan apropiadamente las concentraciones de los reguladores del crecimiento mencionados (Fotos 1b y 10). El tejido calloso esta compuesto por células que muestran carac- terfsticas similares a las del parénquima, aunque los estudios citol6gicos demuestran que es un tejido heterogéneo en cuanto a su composicién celular. Las caracteristicas del tejido calloso cultivado in vitro depen- den de los reguladores del crecimiento utilizados, de la especie y organo de que fue tomado el explante inicial, y de las condiciones fisicas de in- cubacién. Una de las propiedades més importantes del tejido calloso es la llamada friabilidad. Esta puede ser definida como la tendencia de las células a separarse unas de otras, por lo que un tejido calloso friable es aquel que se disgrega facilmente. Por lo general las altas concen- traciones de auxinas en el medio de cultivo favorecen la friabilidad del tejido, mientras que la presencia de citocininas tiende a producir teji- dos de consistencia mas dura. La friabilidad es una propiedad desea- ble cuando se pretende utilizar el tejido calloso para iniciar cultivos de células en suspensién.Introduccién al cultivo de tefidos vegetales Foto a, ‘Tejido callso, Tumores inducides por Ia infeccion de Kalanchoe tubiflora con Agrobacterium tumefaciens de la cepa silvestre C58, Se trata de un tfido calloso natural que se produce a causa de Ia sobreproduccién de auxinas y citociinas inducida por la infeccién Foto 1b ‘Tejidocalloso de Pinus strobiformis inducido y cultivado in vitro en un meat con 1 mgll de 24D y 0.5 mgll de cinetina Foto tc Taj calloso de Allium tuberosum inducido 1 cultivndo in vitro en un medio con 2 mgll de 24-Dy L ml de cinetina 46 epee a a a aAs i ie bi A Ae A 1 4d - yt jt ft ft ft ft tf 5. TeJldo calloso: Induccién, mantenimiento y usos INDUCCION DEL TEJIDO CALLOSO Con un medio de cultivo adecuado, casi cualquier tejido vegetal que contenga un alto ntimero de células viables es capaz de producir tejido calloso. Se sabe que son sélo unas pocas células del explante inicial las que dan lugar a este tejido; usualmente éstas son las localizadas en la superficie del inéculo o adyacentes a las heridas producidas al tomar elexplante. Para la induccién de tejido calloso se requiere un medio de cultivo rico (como el MS o el B5), generalmente sdlido, y con una concentracién adecuada de auxinas y citocininas. La inducci6n de teji- do calloso se produce cuando la proporcién de auxinas es superior a la de las citocininas. Se ha observado que son en realidad las primeras las responsables de la aparicién de este tipo de tejido, mientras que las citocininas sélo favorecen su proliferacién. En ciertas especies, la induccion de tejido calloso puede lograrse agregando tinicamente auxinas al medio de cultivo, Las auxinas mas utilizadas para a induccién de tejido calloso son el 2,4-D, el AIA y el ANA, mientras que las cito- cininas que mas se utilizan son la cinetina y la BA. MANTENIMIENTO DEL TEJIDO CALLOSO Dada la alta tasa de proliferacién que muestra este tipo de tejido se requieren subcultivos cada 3-8 semanas (dependiendo de la especie), pata mantenerlo en un estado adecuado. Si los subcultivos no se reali- zan con la frecuencia apropiada se presenta el agotamiento de los nu- trientes y la desecacién del medio, asf como la acumulacidn de desechos metabdiicos potencialmente téxicos que pueden causar la necrosis del tejido. Para el subcultivo deben tomarse sélo aquellos fragmentos de aspecto sano que no muestren sefiales de deshidratacién, obscure- cimiento o necrosis, y transferirlos a un medio de cultivo fresco. Este medio suele ser el mismo en que se dio la induccién del tejido, aunque en algunos casos puede reducirse la concentracién de auxinas y atia- dir suplementos como el hidrolizado de caseina y extracto de malta, que en algunas especies ayudan a mantener al tejido en crecimiento continuo. En cuanto ala adicién de citocininas, hay algunos tejidos que las requieren para mantener la proliferacién de los mismos, mientras que para otros, aparentemente no son nécesarias. Lo que sucede en rea- lidad es que ciertos tejidos tienen niveles endégenos de citocininas suficientes para mantener su proliferacién, por lo que no requieren de una fuente exégena de las mismas. Para tener datos més precisos acerca del crecimiento del tejido calloso cultivado in vitro y, por lo tanto, para conocer el efecto de los reguladores del crecimiento u otros tratamientos aplicados, debe deter- 47Introduccién al cultivo de tejidos vegetales minarse la tasa de crecimiento del mismo. El método mas sencillo para hacer la determinacién es mediante la medicién del peso fresco del teji- do al momento de la inoculacién y luego al final de cada subcultivo. Este método tiene la ventaja de no dafar el tejido; sin embargo, se pue- de ver influido por el estado de hidratacién del mismo, por lo que no aporta un dato preciso sobre la ganancia real de biomasa. Alternati- vamente se puede utilizar la ganancia en peso seco como medida més precisa de la ganancia en biomasa del tejido, pero la desventaja obvia de este método es la pérdida del tejido al hacer la determinacién. Algu- nos otras métodos para determinar la tasa de proliferacién del tejido son la determinacién del ntimero de células por unidad de peso, el fn- dice mitético y 1a tasa de respiracidn. El tejido calloso puede mante- nerse por tiempo indefinido cuando se hacen los subcultivos apropiados; sin embargo, aqui hay un punto muy importante a considerar. Las con- diciones en que se mantiene el tejido calloso favorecen de una manera atin no comprendida del todo, la aparicién de cambios genéticos y epi- genéticos como son las aberraciones cromosémicas, mutaciones y diferentes tipos de ploidias que en conjunto causan una gran variabili- dad genética en estas células. Estos cambios generalmente causan una pérdida progresiva de la capacidad morfogénica de los tejidos. Esta capacidad es la que les permitiria regenerar érganos o plantas comple- tas, Esto debe tomarse en cuenta cuando se utiliza el tejido calloso para estudios genéticos o cuando se pretende la regeneracién de plantas a partir del mismo, USOS DEL TEJIDO CALLOSO El tejido calloso tiene varias aplicaciones en el CTV. Primeramente, por su facil mantenimiento en condiciones controladas y su répida pro- liferacién, resulta un modelo apropiado para.estudios sobre el metabolismo celular, produceién de compuestos secundarios, fitotoxicologia y ultraestructura celular. También es muy itil para el estudio de los mecanismos celulares de respuesta a diferentes tipos de es- trés como deficit hidrico, salinidad, temperaturas extremas y ataque de patégenos, entre otros. Por otro lado, los cultivos de células en sus- pensién, que tienen también varias aplicaciones, usualmente se inician a partir de tejido calloso. Por tiltimo, el tejido calloso puede ser un pa- so intermedio para la regeneracién de plantas por las vias de organo- génesis y/o embriogénesis somética. En el primer caso, en el explante original se induce la aparici6n de tejido calloso organogénico a partir del cual se da la formacién de brotes adventicios. A este proceso se le conoce también como organogénesis indirecta. En el segundo caso, a partir del explante original (que en muchos casos es un embrién cig6- tico), se induce la aparicién de un tejido calloso embriogénico el cual es 48 SRP pe pee peer ree pps fe jer kta itt ett5. Tejido calloso; Induccién, mantenimiento y usos mantenido en un medio rico en auxinas. La aparicién de embriones somaticos a partir de este tejido se da al reducirse o eliminarse las auxi- nas. No todo el tejido calloso tiene potencial organogénico 0 embrio- génico, por lo que la regeneracién de plantas a partir de este tejido no siempre es posible. Debido a las variaciones genéticas y epigenéticas que aparecen en las eélulas del tejido calloso, es posible regenerar plantas fenoti- picamente diferentes a la planta original que fue utilizada como fuente del tejido. Este hecho hace que el tejido calloso sea titil en programas de mejoramiento genético en los que la variabilidad genética natural de alguin cultivo importante esté muy reducida. Siempre se debe tener una fuente de variacién genética de la cual se pueda partir para seleccionar individuos con caracteristicas agronémicas deseables. 496. ORGANOGENESIS IN VITRO Sin duda, una delas mayores ventajas que ofrece el cultivo de tejidos es, la posibilidad de regenerar plantas completas a partir de pequenios fragmentos de tejido vegetal incubados en un medio artificial apro- piado, Esto tiene aplicaciones inmediatas en campos como la propagacién masiva de plantas de alto valor y es un paso obligado y fundamental para técnicas mds sofisticadas, como la obtencisn de plantas transgénicas. Existen tres vias diferentes para la regeneracién de plantas in vi- tro: la brotacién y proliferacién de yemas, la embriogénesis somitica y la organogénesis. En el primer caso se parte de meristemos ya forma- dos para la obtencién a partir de ellos de una o varias plantas comple- tas, mientras que en la embriogénesis somatica y la organogénesis se parte de tejidos no meristematticos y se requiere tn proceso de desdife- Tenciacion y rediferenciacién de los tejidos para dar lugar a embriones somiticos 0 brotes adventicios. Otra diferencia basica es que en el primer sistema, las nuevas plantas se originan a partir de estructuras multi- celulares, mientras que en los sistemas de embriogénesis somatica y organogenesis las nuevas plantas se originan al parecer a partir de una sola célula. El término organogénesis aplicado al cultivo int vitro de tejidos vegetales se refiere a la formacién de novo de 6rganos en los explantes cultivados. Entre los érganos que se pueden formar estan las rafces 0 Ios llamados brotes adventicios, los cuales son estructuras muy simila- res a una yema y tienen la capacidad de originar una nueva planta después de elongarse y formar rafces (Foto 2), El fenémeno de la organogénesis int vitro se basa en la llamada totipotencialidad celular, es decir, cada célula pose toda la informa- cién genética necesaria para constituir una planta completa o desem- pefiar las funciones de cualquier érgano o tejido vegetal. Sin embargo, en condiciones normales este potencial no se expresa, y se requieren condiciones extraordinarias como las que pueden derivarse del cultivoFoto 2a Organagénesis en Pinus maximartinezi “Aparicion de brotes ‘adventicias alo largo de tn cotiledén procedente de un emibrign maduro tratado com alts concentraciones de BA (10 mgll por 12 dias) Foto 2b. Organogéuesis er lini mexicano (Citrus aurantifolia) ‘Aparicion de brotes ‘adenticis sobre heridas practicadas en un Segment internodal de fallo. Se utili26 un medio ie cultivo con una alta concentracién de BA (7.5:mgil) combinada com wna bajt concentracién de ‘ANA (1 g/D. Foto 2c. Organogénesis en guayabo Brotes adventicios generados sobre Ia neroadura central de wna hoja cultioada en (05 mgil) y ANA (0.5 mall brotes adventicios bien diferenciados del lado iquierdoy de brotes en sus primenas etmpas de aiferenc fn del lado derecho. Introduccién al cultivo de tejides vegetales (Psidium guajaval. resencia de TDZ. 1), Natese Ia presencia de6. Organogénesisin vitro in vitro para que una célula exprese su potencial y pueda originar un 6rgano 0 una planta completa. Por otro lado, aun cuando en teorfa cualquier célula viva que posea micleo es totipotente, se ha visto que en la realidad no todos los tipos celulares son capaces de desencade- nar el proceso de organogénesis, y la probabilidad de que esto suceda decrece conforme se incrementa el grado de diferenciacién de una cé- lula, Seguin Halperin (1986), esta incapacidad para manifestar la totipotencialidad celular se debe a bloqueos que pueden actuar en tres niveles diferentes: 1. Bloqueo genético. En este caso no existe la totipotencialidad celular real o bien se carece de algtin factor genético indispensable para que ésta se manifieste, aun cuando las sefiales externas (hormonales y de otro tipo) sean las requeridas para desencadenar el proceso de orga- nogénesis 2. Bloqueo epigenético. En ocasiones puede existir un bloqueo estable, pero reversible, en la expresin de aquellos genes responsables del proceso de organogénesis. De esta forma, aun cuando las seftales externas que desencadenan la organogénesis estén presentes, las célu- las son incapaces de responder a ellas. 3. Bloquco fisiol6gico. Es el mas sencillo de superar y se debe ala falta de las sefiales apropiadas (hormonas, luz, etc.) para desencadenar el pro- ceso de organogénesis. Al darse estas seftales se dard la manifestacién de la totipotencialidad celular. La organogénesis puede ser directa, cuando tiene lugar en el explante original, o bien indirecta cuando primeramente se origina teji- do calloso y luego.se originan los érganos a partir de éste. Aun cuando Ja organogenesis int vitro es un proceso muy utilizado en fa actualidad, incluso con fines comerciales para la propagacién de plantas, es muy poco lo que se sabe acerca de los fendmenos fisiolégicos, bioquimicos y genéticos que la hacen posible. De manera general, se sabe que bajo las condiciones adecuadas, ciertas células dentro de un explante co- mienzan a dividirse cambiando su estado de diferenciacién y dando lugar a regiones llamadas meristemoides. Los meristemoides estén compuestos por células pequefas, isodiamétricas, de pared celular delgada, varias vacuolas periféricas pequeftas y un nticleo grande en posicién central, lo cual corresponde a las caracteristicas de las células meristeméticas comunes. Cada uno de estos meristemoides es capaz de desarrollarse para dar lugar a uno o varios brotes adventicios. El pun- to critico en este proceso es el momento en que una célula dentro del explante, usualmente parenquimatosa y vacuolada, comienza a dividir- se para dar lugar al grupo de células que componen el meristemoide. ‘Aeste proceso en concreto se le da el nombre de induccién. Existen dos visiones basicas acerca del proceso de induccidn, la primera de ellas, propone que en un momento dado ciertas células dentro del explante 53Introduccién al cultivo de tejidos vegetales sufren un aislamiento fisico y/o fisiolégico con respecto al resto del tejido, lo cual acarrea una pérdida de los controles externos y permite que las células aisladas expresen su potencial de desarrollo dividién- dose y formando los llamados meristemoides. Una segunda visién, propone que son los cambios cuantitativos en la disponibilidad de nu- trientes y reguladores del crecimiento en una célula en particular, lo que induce a ésta a dividirse y formar el meristemoide (Hicks 1994). En la mayoria de los casos estudiados, los brotes adventicios se originan a corta distancia del medio de cultivo, o bien del tejido vascular, lo cual parece indicar que los gradientes fisioldgicos que se dan dentro del explante tienen mucho que ver con el desarrollo de los meristemoides. De acuerdo alos conocimientos actuales, esta segunda visién puede ser la més acertada. Entre los factores que contribuyen a la induccién de los brotes adventicios destacan los reguladores del crecimiento, en particular, las, citocininas y las auxinas. En la mayorfa de los casos, pero no en todos, se ha visto que la organogénesis suele darse en presencia de propor- ciones elevadas de citocinina/auxina. Actualmente se trabaja en el es- tudio de los genes asociados al proceso de organogénesis, ast como de los mecanismos moleculares de aceién de las auxinas y citocininas, lo cual seguramente permitiré en un futuro comprender y manipular de mejor manera el proceso de la organogénesis. Ademas del menciona- do papel de los reguladores del crecimiento, hay un gran niimero de factores que afectan el proceso de la organogénesis, los cuales se co- mentan a continuacién. Factores que dependen del explante: + Genotipo + Estado general de la planta donadora del explante + Organo de donde se toma el explante ‘+ Tejidos y tipos celulares presentes en el explante + Tamafo del explante + Edad fisioldgica y ontogénica del tejido de donde proviene el explante + Posicién del explante dentro de la planta donadora + Estacién del afio en que se toma el explante + Pretratamientos aplicados al explante o a la planta donadora + Posicién y orientacién en que se inocula el explante + Densidad de inoculacién Factores que dependen del medio de cultivo: + Reguladores del crecimiento (tipo, concentracién y proporcin de uno con respecto a otro) Macro y micronutrientes Vitaminas: Nitrégeno orgénico Fuente de carbono Suplementos nutritivos 54 ileernettiieieneonil6. Organogénesis in vitro + Consistencia del medio (liquido o sélido ) Tipo y concentraci6n del gelificante en el caso de medio solido ‘Otros componentes ( antioxidantes, carbén activado, ete. ) Factores relacionados con el ambiente de incubacién: + Luz, obscuridad o fotoperiodo + Tipo de luz © Temperatura ‘Como se puede ver, el ntimero de factores implicados en el proceso de organogenesis es muy grande, y el fendmeno en sf atin no se com- prende lo suficiente como para manipularlo a partir de una base solida de conocimientos. A pesar de ello, la organogénesis puede llevarse a cabo en muchas especies vegetales de una forma relativamente senci- lla; sin embargo, los conocimientos practicos que se tienen hasta la fecha provienen en su inmensa mayorfa de experimentos de ensayo y error. Debido a esto, al trabajar con una especie por primera vez deberdn ‘montarse experimentos que nos permitan desarrollar ef mejor sistema para regenerar drganos a partir de ese material vegetal. Algunas consi- deraciones para el montaje de estos experimentos son las siguientes: * Aun cuando la respuesta de cada especie e incluso de cada varie- dad vegetal a los sistemas de cultivo in vitro suele ser propia y diferente a las demés, siempre es conveniente buscar en la litera- tura trabajos sobre especies o variedades relacionadas con la de interés, ya que éstos pueden servir como base para el montaje de los experimentos adecuados para el desarrollo del sistema de regeneracién mediante organogenesis. + Usualmente las primeras variables a probar son el tipo de explan- te y los reguladores del crecimiento. El tipo de explante depende de la especie, pero los mas utilizados son segmentos de hoja, co- tiledén, hipocotilo o tallos jévenes. En cuanto a los reguladores del crecimiento, generalmente se plantean experimentos donde se prueba el efecto de varias concentraciones de una citocinina combinada con varias concentraciones también de una auxina. Las citocininas mas frecuentemente utilizadas son BA, CIN, ZEA y ‘TDZ, mientras que como auxinas suelen utilizarse AIA, ANA yen menor medida 2,4-D. Como medio base se recomienda uno de uuso general como el MS o el BS. Se recomienda realizar expe- rimentos de manera secuencial y tomar en cuenta los resultados de un experimento para el disetio del siguiente, ya que de lo contra- rio el ntimero de variables a probar puede ser demasiado grande ‘© Una vez conocida la respuesta de los diferentes tipos de explante alos reguladores del crecimiento pueden tomarse tinicamente los mejores tratamientos y probar otras variables como macro y mi- cronutrientes, compuestos orgdnicos y condiciones de incubacién, con el fin de optimizar el sistema. ‘+ Para determinar la eficiencia de un sistema se oman como para- metros el ntimero promedio de brotes por explante asf cOmo el 55Introduccién al cultivo de tejidos vegetales porcentaje de explantes que presentan brotes. Con el fin de ma nojar un solo valor es aconsejable utilizar como pardmetro la CFB (Capacidad de Formacién de Brotes; Pulido y col. 1992), la cual se deriva de la siguiente expresién: .OTES) (PROMEDIO DE BROTES POR EXPLANTE) (Mf DE EXPLANTES oa ~ 100 ‘Aunque en la mayorfa de los casos se determina la eficiencia de ‘unsistema en funcién del nimero de brotes producidos, es muy impor tante considerar también el grado de diferenciacién de los mismos. Los brotes poco diferenciados tienen una menor probabilidad de producir tuna planta completa y pueden requerir un mayor ntimero de subculti- vos para que esto suceda. Por tiltimo, es aconsejable diseftar los experimentos de tal forma que los resultados puedan ser sometidos a un anilisis estadistico que hos facilite la eleccién de los mejores tratamientos. Para esto suele utili- zarse, aunque no siempre, un disefio completamente al azar 0 de bloques al azar, para practicar luego un andlisis de varianza seguido de una prueba de Duncan, de Tukey o de diferencia minima significativa (DMS),7. EMBRIOGENESIS SOMATICA Una de las caracteristicas mas notables del cultivo de tejidos vegetales es que ciertas células, y bajo ciertas condiciones de cultivo in vitro, tie- nen la capacidad de formar embriones mediante un proceso muy si- milar a la embriogénesis cigética. A este proceso se le denomina embriogénesis somatica y es una de las pruebas més notables de la totipotencia celular. Los embriones somaticos tienen, al igual que los cig6ticos, la capacidad de formar una nueva planta después de un proceso de germinacién, con la diferencia de que la embriogénesis, somdtica es un proceso asexual por lo que la nueva planta sera exactamente igual a la donadora de la célula inicial. La embriogénesis somatica no es un proceso que suceda tinicamente en cultivos in vi- tro, de hecho es relativamente comtin en algunas familias de plantas y se conoce como apomixis (Kiran y Thorpe 1995). Para que una célula vegetal lleve a cabo el proceso de embriogé- nesis somitica debe estar “determinada” o “inducida”. Por lo anterior, las células capaces de formar embriones somsticos reciben el nombre de células embriogénicas determinadas (CED 0 EDC por sus iniciales en inglés) 0 células proembriogénicas. Este proceso de induccién atin no se conoce con exactitud pero se sabe que implica un cambio drastico en los patrones de expresion genética mediante el cual las eélulas pa- san del patrén normal a uno embriogénico. Existen dos tipos de embriogénesis somatica int vitro, la directa (ESD) y la indirecta (ESI). En la embriogénesis somatica directa, los embriones aparecen directamente sobre el explante original. Un ejem- plo esla aparicién de embriones somaticos en tejidos nucleares de citri- cos y otras especies. Por otro lado, en la embriogénesis somstica indirecta, en un primer paso es indispensable obtener un tejido calloso obien una suspensidn celular embriogénica a partir de la cual se obten- dré la diferenciacién de los embriones somticos en un segundo paso. Este es un proceso mucho més complejo que la ESD. Se supone que la ESD se da cuando en el explante original existen ya célulasIntroduccién al cultivo de tejidos vegetales proembriogénicas, por lo que no es necesario el proceso de induccién y sélo se requiere proporcionar al tejido las condiciones adecuadas pa- ra que suceda la diferenciacién de los embriones somaticos. En la ESI, el explante original no tiene células proembriogénicas, por lo que se requiere primero darle al tejido las condiciones para que ocurra lainduc- cién y luego cambiarlo a otras que sean propicias para la diferenciacién de los embriones. Las células de tejidos muy jévenes, como por ejemplo los embriones cigéticos inmaduros, son ya en una buena proporcién células proembriogénicas, o si no, son facilmente inducibles para que lo sean. Por el contrario las células més diferenciadas 0 de tejidos adul- tos muy diffcilmente o casi nunca se llegan a convertir en proembriogé- nicas. Esto explica por qué la embriogénesis somdtica resulta sencilla en algunos tejidos y précticamente imposible en otros. El proceso de embriogénesis somética consta de varias etapas (Fi- gura 7 y Foto 3), en cada una de las cuales se requieren diferentes estimulos y ocurren fenémenos diferentes (Merkle ef al. 1995). A con- tinuacién Se detallan estas etapas. INDUCCION Es el proceso de conversion de una célula somética a una ¢élula proem- briogénica. Se considera que los factores determinantes para que suceda el proceso de induccién son: 1. Genotipo. Se sabe que diferentes genotipos aun de una misma es- pecie muestran diferencias notables en la capacidad para activar los elementos clave que se requieren para iniciar el proceso de embriogénesis somatica. Lo anterior hace que ciertos genotipos sean mds propensos a la embriogénesis somatica, mientras que en otros esta via de regeneraci6n sea prdcticamente imposible. 2. Grado de diferenciacién de las células del explante. Como ya se mencioné, la embriogénesis somédtica es mucho més factible en tejidos jévenes muy poco diferenciados, y précticamente imposi- ble en tejidos maduros completamente diferenciados. 3. Auxinas. La presencia de auxinas es un factor determinante para que ocurra el fenémeno de induccién. Se sabe que la presencia de este tipo de reguladores del crecimiento estimula entre otras co- sas la metilacion del ADN, lo cual puede favorecer el cambio del patrén de expresion genética que se requiere para que ocurra la induccidn. Entre las auxinas mas efectivas para la induccién de la embriogénesis somitica se encuentran las sintéticas, como por ejemplo los dcidos fenoxiacéticos (2,4-D, ac. clorofenoxiacético y 2,4,5-T). Esto se debe a que Las células vegetales son incapaces de degradar o inactivar eficientemente las auxinas sintéticas como lo7, Embriogénesis somatica ———+ TEJIDO CALLOSO INDUCCION +AUXINAS | —+ MASAS DE CELULAS: PROEMBIONICAS EMBRIONES EN ESTADIO GLOBULAR Histo. | + EMBRIONES EN DIFERENCIACION | ESTADIO DE CORAZON : - AUXINAS + EMBRIONES EN ESTADIO DE TORPEDO | |__DESECACION o PLANTULAS GERMINACION Figura?, Proceso de la embriogénesis somatica indivecta ‘+ EMBRIONES EN ESTADO MADURACION COTILEDONARIO eae - 59Introducci6n al cultivo de tejidos vegetales hacen con las auxinas naturales, por lo que sus efectos son mas intensos y duraderos. 4. Aislamiento celular, Se sabe que el aislamiento de una célula o de tun grupo de eélulas con respecto al resto del tejido estimula también la inducci6n o conversi6n de una célula somatica en pro- embriogénica. Este aislamiento sucede cuando hay necrosis en el | tejido adyacente o bien cuando se aplican tratamientos fisicos pa- ra separar las células, La presencia de auxinas puede contribuir también a este aislamiento celular al promover la friabilidad del tejido. HISTODIFERENCIACION Ent esta. etapa las masas de células proembriogénicas se diferencian formando embriones somaticos, mediante una divisién y diferencia- cién celular simulténeas. Para que estas células cesen su multiplicacién y pasen a una fase de diferenciacién se requiere la eliminacién de las auxinas exdgenas. Uno de los fenémenos iniciales en esta etapa es el establecimiento de una polaridad en las masas de células proembrio- génicas. Esta polaridad se mantendré durante todo el desarrollo del embrién. Durante la etapa de histodiferenciacién, los embriones so- miticos pasan por una serie de estadios intermedios muy similares a Jos que ocurren en la embriogénesis cigética. En las dicotiledéneas estos estadios son: globular, de coraziin y de torpedo, mientras que en las monocotiledoneas son: globular, coleoptilar y escutelar. MADURACION Normalmente un embrién somatico en estadio de torpedo atin no tie- ne la capacidad de germinar. Para que se adquiera esta capacidad se requiere una fase de maduracién durante la cual ocurre bisicamente una elongacién celular ya sin division. Para la mayoria de las especies se sabe que los estimulds que hacen posible la maduracién son el écido abscisico y la desecaciGn. En el caso de las dicotiledéneas, al embiién somatico maduro se le da el nombre de estadio cotiledonario.7. Embriogénesis somatica Foto 3a Embriogénesis somtica, Cultivo embriogénico de Acacia farnesiana. Nitese la presencia de c las grandes de forma alargada no embriogénicas, y de células pequerias de forma esférica que forman masas proembriogénicas en la suspensién celular Foto 3b, Embriogénesis somitica Diferentes etapas del desarrollo de embriones ssomiticos de Acacia farnesiana 61Introduccién al cultivo de tejidos vegetales GERMINACION Es el proceso de elongacién y reactivacién metabélica de un embrién somético maduro para convertirse en una pléntula. Para que esto su- ceda se requieren estimulos como la luz, el dcido giberslico o citoci- ninas. Obviamente, los embriones somaticos carecen de tejidos de reserva por lo que su germinacién s6lo ocurre int vitro en donde el me- dio de cultivo aporta los nutrientes, o bien, cuando se les proporcionan depésitos artificiales de nutrientes (semillas artificiales). La embriogénesis somética se ha conseguido con éxito en un menor nuimero de especies que la organogénesis, debido a que es un fenéme- no en apariencia mas complicado. Sin embargo, cuando ésta es posible, su productividad en cuanto al ntimero de plantas que se pueden ge- nerar es mayor. Debido al origen presuntamente unicelular de los embriones somaticos, ésta es una via de regeneracién aplicable a la transformacién genética. Por otro lado, la embriogénesis somitica sit- ve como base para la produccién de semillas artificiales, que no son mas que embriones somaticos encapsulados en una matriz. que contie- ne nutrientes que hace las veces de tejido de reserva, y en algunos casos inhibidores como el dcido abscisico que detiene la germinacién prematura. Para el montaje de un sistema de embriogénesis somatica, las variables principales a manejar son el tipo de explante, y el tipo y con- centracion de auxinas a utilizar para la induccién del tejido proem- briogénico. Los explantes més utilizados suelen ser embriones sextiales con diferentes estadios de maduracién, y en menor medida, cualquier tejicto somatico de la planta. Por tiltimo, existen algunas diferencias basicas entre los embriones somiticos y los brotes adventicios, las cuales nos permiten identificar el tipo de sistema de regeneracidn en los casos en que existan dudas al respecto, A continuacién se mencionan estas diferencias * Los embriones somaticos son estructuras polares, en las cuales siempre son visibles un épice y una radfcula, mientras que en la organogénesis las estructuras formadas son unipolares, conte- niendo solo un pice (brote adventicio) 0 raiz. ‘+ Los embriones sométicos no tienen una conexién vascular con el explante original, por lo que son estructuras relativamente inde- pendientes al mismo. Por su parte, los brotes adventicios conservan tusualmente su conexidn con el sistema vascular del explante inicial. + Enlos embriones somaticos, las primeras hojas tienen la morfologia aproximada de los cotiledones, lo cual no sucede con los brotes adventicios.7. Embriogénesis somatica + Anivel molecular, los embriones somsticos expresan una serie de proteinas propias del proceso de embriogénesis cigética, las cuales nunca aparecen en los brotes adventicios. A estas protefnas seles considera como marcadores moleculares del proceso de em- briogénesis.8. CULTIVO DE MERISTEMOS, YEMAS Y APICES ‘A pesar de que las plantas tienen la capacidad de crecer continuamen- te, no todas sus células se dividen bajo condiciones normales, por lo que el crecimiento de tna planta se debe ala presencia de un tipo espe- cial de tejido que conserva siempre la capacidad de dividirse. A este tipo de tejido se le da el nombre de meristemo 0 tejido meristematico y esta constituido por células pequefias, no diferenciadas, con una alta relacién nticleo/citoplasma, vacuolas muy pequefas, paredes celula- res delgadas y plastidios no diferenciados (proplastidios). Los meris- temos se localizan tinicamente en ciertas zonas 0 puntos de crecimiento dela planta como los épices, axilas, épices de la rafz, zona del cambium y felogeno. Los meristemos apicales y axilares (contenidos dentro de las lamadas yemas), al ser de manera natural los puntos de crecimiento en los vegetales tienen la capacidad de formar nuevos brotes. Esa capacidad natural la mantienen cuando se establecen y cultivan in vi- tro. Debido a lo anterior, el cultivo de yemas apicales 6 axilares es una manera sencilla de obtener nuevos brotes, los cuales pueden enraizar- se y producir asf nuevas plantas. Este sistema de propagacién se basa, por lo tanto, en Ia formacién de nuevos brotes a partir de meristemos preexistentes, por lo que no implica fendmenos de desdiferenciacién y rediferenciacién celular como los que ocurren en la organogénesis y embriogénesis somatica. La propagacion por cultivo de meristemos y yemas es un sistema de regeneracién menos complejo que cuando esto se hace por medio de organogénesis 0 embriogénesis somitica A continuacién se mencionan algunas caracteristicas del mismo y algunas de sus ventajas y desventajas: + Es un sistema ideal para la propagacién clonal, ya que ofrece la maxima estabilidad genética, lo cual no sucede siempre en la or- ganogénesis y embriogénesis somatica. © Elsistema es relativamente sencillo, y es muy similar en todas las especies, por lo que no requiere de demasiada experimentacién | | | | |T Introduccién al cultivo de tejidos vegetales para encontrar las condiciones adecuadas. Sin embargo, la propagacién por yemas en general es mas lenta y menos produc- tiva que la organogénesis y la embriogénesis somtica. ‘+ Elssistema de cultivo de meristemos, solo o combinado con termo- terapia o quimioterapia, nos permite la obtencién rapida de plantas libres de patégenos, incluso de virus y viroides. Esto tiene una enorme importancia sobre todo en cultivos que se propagan vege- tativamente, ya que es la tinica forma de obtener material sano, Esta metodologia se ha aplicado con mucho éxito en la produc- cidn de plantas de clavel, papa y cftricos libres de virus. + Este sistema de propagacidn es el ideal para ser utilizado en la conservacién int vitro de germoplasma, ya sea mediante creci- miento retardado 0 criopreservacién. El cultivo de yemas o me- ristemos facilita el transporte de material vegetal sin el acarreo de problemas fitosanitarios. + Entre las desventajas mas importantes de la propagacién median- te el cultivo de meristemos o yemas se puede mencionar la alta sensibilidad de los tejidos a los métodos de esterilizacién su- perficial, por lo que esto se debe hacer con mucho cuidado. Otra dificultad la presentan las plantas leftosas que producen altas cantidades de compuestos fendlicos. Por tiltimo, este sistema de propagacién es propicio para que se presente la vitrificacién en. algunas especies. + Debido al origen multicelular de los nuevos brotes, este sistema no es recomendable para la obtencién de plantas transformadas genéticamente por los métodos convencionales; sin embargo, tiltimamente han aparecido trabajos de transformacién genética basados en la inoculacién de meristemos apicales con Agrobacte- rims tumefaciens, los cuales se dejan crecer y producit estructuras reproductivas. En la progenie de estas plantas ha sido posible la selecci6n de transformantes. De acuerdo al tipo de explante utilizado, el cultivo de tejidos meristematicos se puede dividir en tres tipos basicos. CULTIVO DE MERISTEMOS En este caso deben aislarse los meristemos mediante diseccién con ayuda de un microscopio. El explante aislado es muy pequefto, usual- mente de menos de I mm de didmetro, y consta del domo apical del meristemo con un pequefio ntimero de primordios foliares. Se exclu- ye el tejido vascular diferenciado. El aislar y trabajar con explantes tan pequerios implica una cierta dificultad; ademas, el mismo tamafo del explante reduce la probabilidad de que se establezca y prospere in vi-8. Cultivo de meristemos, yemas y pices tro, y se requiere generalmente un medio de cultivo més complejo. Sin embargo, a medida en que el explante es de menos tamafo, tiene una mayor probabilidad de estar libre de patogenos. El principal. uso de este tipo de cultivo es la produccién de plantas libres de virus y de cual- quier otro agente patégeno (Grout 1990). Para asegurar esta liberacién de patégenos, el método puede combinarse con algiin tipo de quimio- terapia, o en el caso de virus, con termoterapia. Esta iltima consiste en incubar la planta completa o fragmentos de ella a altas temperaturas antes de aislar el meristemo. Usualmente estos tratamientos son 7-9 dias a 40°C 0 de 16-168 dias a 32 °C. Una vez obtenidas las plantas me- diante el proceso anterior, éstas deben analizarse mediante métodos serolégicos o moleculates para confirmar la ausencia de patégenos espectiicos. CULTIVO DE YEMAS AXILARES En este sistema, el tamafo del explante no es determinante ya que s6- lo se requiere que éste lleve una o mas yemas axilares, a partir de las cuales se dard la produccién de brotes. Este es el método més sencillo para la micropropagacién de plantas, y puede ser acoplado a otros sistemas cuando se requiere incrementar de manera segura el mate- rial. Por ejemplo, una vez obtenida una planta libre de patégenos, ésta puede propagarse por yemas y después de varios ciclos incrementar exponencialmente el ntimero de individuos (Evans 1990) (Foto 4). CULTIVO DE APICES Para el cultivo de pices, se toman explantes apicales de 4-10 mm de longitud, los cuales contienen ademas del meristemo, varios primor- dios foliares asf como tejido vascular diferenciado. Este método es més sencillo que el anterior debido ala manipulaci6n de explantes més gran- des y ala mayor probabilidad de supervivencia de los mismos. Sin em- bargo, este método no es aplicable cuando se pretende obtener plantas libres de patogenos. En cuanto al medio de cultivo requerido para este tipo de pro- pagacidn, éste suele ser sencillo (excepto para el cultivo de meristemos en algunas especies), pudiéndose utilizar el medio MS 0 BS sélido 0 liquido. La adicién de citocininas (0.5-10 mg/1), puede favorecer la brotacién muiltiple, es decir, que de una yema se obtengan varios bro- tes. Una recomendacién importante es el asegurarse de que al inocular 67Foto da. ‘Micropropagacién por cultivo de yemas axilares. Produccién de brotes amuiltiples en Mammillaria candida a través del cultivo de explantes conteniendo yemas axilares (areolas ‘omamilas en el caso de las cacticeas), Foto 4b. Micropropagacién por cultivo de yemas ancilares. Produceié in vitro de brotes multiples a partir de yeras tomadas de tun dro adulto de Taxodium mucronatum. cl explante, la yema quede en contacto con el medio, ya que de esta forma se acelera la respuesta. Por tiltimo, existe una variante mds aparte del cultivo de meristemos y yemas, y es el microinjerto in vitro. En este caso, el meristemo aislado no se cultiva sobre un medio artificial sino que se injerta sobre un pequefio patron int vitro; de esta manera se obtienen plantas ya injertadas al sacarlas a suelo. El microinjerto se utiliza por ejemplo para la produccién de cftricos libres de patégenos (Parkinson y col. 1990). 688, Cultivo de meristemos, yemas y apices La Figura 8 resume el sistema de propagacién por cultivo de me- ristemos o yemas. PLANTA EN SUELO o MERISTEMO ESTERILIZACION Y ESTABLECIMIENTO INVITRO BROTACION Y MULTIPLICACION IN VITRO PS ge a CICLOS DE MULTIPLICACION 9 ENRAIZAMIENTO BROTES: OBTENCION IN VITRO GENERADOS DE NUEVAS OIN VIVO IN VITRO YEMAS Y APICES Figura 8 Sistema de propagacién por cultivo de meristemos © yeas 699, MICROPROPAGACION Se le llama micropropagacion a la propagacién asexual de plantas utilizando las técnicas de cultivo de tejidos in vitro. Esta es una de las aplicaciones mas utilizadas de entre todas las técnicas que componen Ja llamada biotecnologia vegetal, ello se debe a su enorme producti- vidad al compararsele con las técnicas tradicionales de propagacion de plantas. Las principales ventajas que ofrece la micropropagacién son las siguientes: Se trata de un sistema de propagacisn clonal, es decir que man- tiene todas las caracterfsticas genotfpicas del material inicial seleccionado, Debido a esto es un sistema ideal para la multipli- cacién masiva de plantas 0 variedades con caracteristicas sobre- salientes. Debido a que se realiza todo el proceso en un laboratorio bajo ambientes controlados, se trata de un sistema totalmente indepen- diente de las condiciones externas por lo que no se ve afectado por las estaciones del afto, sequias, heladas, altas temperaturas u otros factores ambientales, El nuimero de plantas que se puede obtener mediante micropro- pagacién es por su naturaleza practicamente ilimitado. El tinico limite que se puede tener es la capacidad misma del laboratorio en que se realiza el proceso. El espacio que se requiere es minimo y el tiempo en que puede realizarse el proceso es relativamente corto. Las plantas que se obtienen estan libres de bacterias, hongos y ne- matodos fitopatégenos, y con técnicas mas especificas se pueden liberar incluso de virus y viroides. Por este motivo, las pléntulas producidas mediante sistemas de micropropagacién presentan luna mayor calidad si se les compara con las obtenidas por méto- dos tradicionales. Ademds, se tiene la ventaja de que estas plan- tas pueden enviarse mas fécilmente a otros paises debido a que hay menos impedimentos fitosanitarios.Introduccién al cultivo de tejidos vegetales Las principales desventajas que tiene la micropropagacién son el costo inicial del laboratorio y los requerimientos de personal con un ni- vel alto de capacitacidn, el cual no siempre esté disponible. En cuanto a los costos de produccidn, éstos no son realmente tan elevados como podria parecer y pueden obtenerse precios bastante competitivos so- bre todo en especies de alto valor o de aquéllas que son de diffeil propagacién por métodos tradicionales, como por ejemplo las orna- Inentales, frutales y forestales. En cuanto al problema de la capacitacién del personal, esto se resolveré en la medida en que las técnicas se in- corporen a los programas de estudio de las carreras téenicas y pro- fesionales del area agricola y biolégica La mieropropagacién de cualquier especié vegetal consta de cinco etapas basicas, cada una de ellas fundamental para el éxito del sistema. ETAPA 0. SELECCION DE LAS PLANTAS MADRE Se trata de una etapa preparativa, en la cual se seleccionan y acondi- Gionan las plantas madre que serdn utilizadas para iniciar los cultivos in vitro. Aunque en muchas ocasiones es subestimada, se trata de una parte fundamental para el éxito de la micropropagaci6n. Debe re- fordarse que se trata de un sistema de propagacién clonal, por lo que todas las plantas generadas tendrn las caracteristicas genotipicas de la planta madre. Si se parte de una planta élite con caracterfsticas deseables superiores al promedio, las plantas generadas tendrdn un alto valor. En algunas ocasiones, no basta con elegir correctamente el material inicial, sino que se requieren ciertos pretratamientos del mis- mo. El primer tipo de pretratamientos esta encaminado a disminuir a probabilidad de contaminacién microbiana en la Etapa 1 (inicio del Cultivo axénico), y consiste en sanear a las plantas madre antes de la toma de los explantes, Esto se logra transladéndolas a un ambiente higiénico (invernadero, por ejemplo) y tratando periédicamente con fungicidas por 1-4 meses. En caso de que persista el alto indice de con- taminacidn, una alternativa es realizar una poda severa de la planta permitiendo que los nuevos brotes se originen en un ambiente menos vontaminado, Existe un segundo tipo de pretratamientos encamina- Gos a cambiar el estado fisiol6gico de la planta y de esta manera favo- recor el establecimiento de los cultivos in vitro. Para ello se utilizan cambios en la temperatura, iluminacién, fotoperiodo, fertilizacion, aplicacién de reguladores del crecimiento © podas severas para rejuc venecimiento. 72 OOOO ee eee9. Micropropagacién ETAPA 1. ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS AXENICOS Esta etapa consiste basicamente en la eleccién del explante y la esterilizacién del mismo para iniciar un cultivo axénico. La eleccién del explante depende mucho de la especie y del sistema de proliferacién que se aplique en la Etapa 2. Para los sistemas de propagacién por ye- mas © meristemos, los explantes iniciales generalmente se toman de individuos adultos. Por otra parte, para la organogénesis el tipo de ex- plante es variable, pudiendo ser segmentos de hoja, tallo o tejidos ju- veniles tomados de plintulas. En el caso de la embriogénesis somética, los explantes suelen ser tejidos nucelares y embriones sexuales inmaduros. Los métodos para la esterilizacién de los explantes inicia- les se mencionaron anteriormente. Por ultimo, casi siempre es de espe- rarse un bajo porcentaje de establecimiento exitoso de los tejidos ir vitro debido a los problemas de adaptacidn y contaminacién; sin embargo, no se requiere mucho material para iniciar la Etapa 2, ya que es en ésta en donde se dard la proliferacién, ETAPA 2. MULTIPLICACION DEL TEJIDO Es enesta etapa donde se realiza verdaderamente la micropropagacién, obteniéndose un gran niimero de nuevos brotes a partir de cantidades minimas de tejido. Existen tres vias para la multiplicacién in vitro: la organogénesis, la embriogénesis somética y la multiplicacién por ye- mas, dpices 0 meristemos. Las caracteristicas y ventajas de cada una de ellas se han mencionado anteriormente. Cabe recalear que los sistemas de organogénesis y de embriogénesis somstica, aunque pueden ser més rapidos y/o productivos que la propagacin por yemas, dpices 0 meristemos, son més susceptibles a la generacién de variantes en las plantas obtenidas, 1o cual puede ser negativo en un esquema de propagacién clonal ETAPA 3, ELONGACION Y ENRAIZAMIENTO Por lo general, lo que se obtiene en la Etapa 2 son pequeiios brotes, en. la mayoria de los casos carentes de raiz y con poca probabilidad de adaptarse con éxito a las condiciones ambientales externas. En la Eta- pa 3 lo que se pretende es que los brotes formen su sistema radical al mismo tiempo que se elonguen para facilitar su manipulacién y ha- cer més probable su adaptacion a las condiciones ambientales externas. 73Introduccién al cultivo de tefidos vegetales El enraizamiento se puede lograr separando los brotes y transfirién- dolos a un medio de cultivo apropiado. La formacién de raices se favorece en medios diluidos conteniendo auxinas (¢j. AIB 0.1-1.0 mg/l) © carbon activado (3-5 g/D. Alternativamente, se puede intentar el en- raizamiento in vivo, transfiriendo los brotes generados en la Etapa 2 directamente al substrato previa aplicacin de un enraizador co- mercial, y manteniendo el ambiente con alta humedad relativa. En este caso se incrementa la mortalidad al momento de transferir al substra- to, perose evita una etapa completa de la micropropagacién, por lo que debe analizarse la conveniencia del enraizamiento in vivo para cada especie ETAPA 4. ADAPTACION AL MEDIO EXTERNO- Las plantas generadas in vitro presentan varias caracteristicas peculia- res que dificultan su adaptacién al medio externo una vez concluido el perfodo de cultivo, A continuacién se detallan las mas importantes: + La humedad relativa dentro de los recipientes de cultivo suele ser muy alta, lo que provoca que las plantas generadas in vitro carez~ can de algunos de los sistemas normales para evitar la pérdida de agua. Por ejemplo, su cutfcula esta poco desarrollada y el meca- nismo de cierre de los estomas esta atrofiado. Por ello, el proceso de adaptacién al ambiente externo de una planta generada in vi- tro debe ser lo mas gradual posible, siendo lo més recomendable una reduccién lenta de la humedad relativa, primero en el re- cipiente de cultivo y luego fuera de éste para permitir asf el desarrollo paulatino de los sistemas de proteccién de la planta contra la desecaci6n. Se han probado diferentes antitranspi- rantes para proteger a la planta durante este perfodo critico, en- tre ellos las soluciones de glicerol 0 algunas ceras liquidas, pero los resultados no siempre han justificado el uso de estos com- puestos, * Las plantas durante su cultivo in vitro no realizan una fotosinte- sis normal y sus requerimientos de carbono son satisfechos por el medio. La anatomia de las hojas difiere de la de las plantas que ctecen int vivo, siendo éstas por lo general més delgadas y con me- nor concentracién de clorofilas. Es por todo ello que el paso de las plantas generadas in vitro hacia la autotrotia debe ser gradual, exponiéndoseles a incrementos paulatinos en la intensidad lu- ‘minosa. De cualquier forma, es de esperarse un balance negativo ena adquisicién de carbono durante las primeras semanas a par- tir de que se eliminé el medio de cultivo, las plantas deberdn ser Jo suficientemente vigorosas para soportar esto. * Por tratarse de sistemas de cultivo axénicos, las plantas no han 749. Micropropagacién generado resistencias naturales contra los microorganismos potencialmente nocivos, por lo que es recomendable trabajar durante las primeras fases de la adaptacin bajo las condiciones mas higiénicas posibles, Asimismo, se recomienda eliminar cualquier remanente del medio de cultivo que pudiera quedar adherido a la planta, ya que éste por su alto contenido de sacaro- sa podria favorecer ei crecimiento de estos microorganismos. Una evidencia para determinar el momento en que la adaptacién puede considerarse exitosa, es la aparicién de hojas nuevas después de la transferencia al substrato. En este momento es cuando deberd reducirse la humedad e incrementarse la luz. La adaptaci6n de las plantas generadas in vitro a las condiciones externas es un factor deter- minante para la costeabilidad de un sistema de micropropagacién, ya que de nada sirve un sistema de proliferacién muy productivo, si el porcentaje de plantas que sobrevivirdn a la adaptacién es bajo. Existen en el mercado recipientes de cultivo cuyas caracteristicas permiten un cierto intercambio gaseoso con el ambiente externo y disminuyen la diferencia entre la humedad relativa interna y la externa. Con esto se puede acortar el perfodo de adaptacién de las plantas a las condicio- nes externas, MICROPROPAGACION: CONSIDERACIONES ECONOMICAS Dado que la micropropagacién ha pasado de ser una herramienta uti- lizada en la investigacin a un proceso productivo con un potencial econémico muy amplio, es necesario tomar en cuenta otras conside- raciones ademas de las meramente cientificas cuando se desea aplicar con fines comerciales. Muchas veces no basta tener un sistema de micropropagacion muy productivo, sino que hay que tomar en cuen- ta otro tipo de factores como los siguientes (Zimmerman 1991): + {C6mo se producen actualmente las pléntulas de la especie que nos interesa mictopropagar?, ;d6nde se localizan los centro de pro- duccién, cudl es el costo de produccién y cudl el margen de ganancia bajo los sistemas tradicionales de propagacién? No siempre los sistemas de micropropagacién pueden competir con éxito con los tradicionales. + {Cuél es el mercado potencial de la especie que se desea micro- propagar?, ,qué porcentaje del mismo esta cubierto por los sistemas tradicionales de propagacin? ;Puede la micropropaga- cin competir en este mercado utilizando algunas de sus ventajas como lo serfan la produccién fuera de la temporada normal, el bajar los precios o introducir nuevas variedades? © En cuanto a las variedades, zhay regulaciones mediante paten- tes?, con qué frecuencia aparecen en el mercado nuevas va- riedades y de dénde provienen éstas?, zpuede el sistema de 75are Introduccién al cultivo de tejidos vegetales micropropagacién adaptarse a la multiplicacién de nuevas variedades al ritmo que lo exige el mercado? Por otra parte, se sabe que la mano de obra representa entre el 60 y e1 80% del costo final de las plantas micropropagadas, y también {que se debe contar con personal capacitado dedicado a la investiga~ cién y desarrollo de los sistemas de micropropagacidn, asf como de la resolucidn de los problemas que se presenten durante la produccién (contaminacion, vitrificacién, pérdida de vigor, etc.) La micropropagacién de plantas es en la actualidad una indus- tria de gran importancia en varios paises del mundo, habiendo des- plazado en muchos casos a los sistemas tradicionales de produccién de plantulas. En Europa occidental para el afio de 1988 se produjeron 216.46 millones de plantas mediante sistemas de micropropagacién, destacando los laboratorios instalados en Holanda, Francia, Italia, Bélgica, Alemania, Espafia e Inglaterra. En cuanto al tipo de plantas, las mas importantes se muestran en la Tabla 8: En cuanto a los paises de Europa oriental, destaca la industria de micropropa- | Ormamentales de maceta 92.33 millones gacién establecida en Polonia, aunque con voltimenes de produccién menores a los Flores para corte antes mencionados. Para los EUA, se dis- Para cort 37.84 millones pone de datos del afio de 1985, cuando se produjeron unos 65 millones de plantas | Frutales 19.42 millones mediante la micropropagaci6n, destacando las ornamentales, forestales, frutales y | Omamentales de bulbo 13.16 millones orquideas. En Asia se producen entre 65 y 86 millones de plantas al afio mediante el Orquideas sistema mencionado, de las cuales unos 38 | Ora" 5.28 millones millones son orquideas, destacando Japén, Tailandia, Singapur y Malasia (Zimmerman _| Especies forestales 1.29 millones 1991).Se sabe también de la existencia de una industria emergente de micropropagacion de plantas en algunos paises de América Latina En México, la industria de la micropropagacisn se concentra en plantas ornamentales y algunos cultivos horticolas, entre los que desta~ a la papa, La produccién de propagulos de papa a base de mini y microtubérculos en México se inicia en algunas dependencias como la Universidad Auténoma Chapingo, el Colegio de Posgraduados, el Programa de Papa del Instituto Nacional de Investigaciones Foresta- les, Agricolas y Pecuarias (INIFAP) y la Delegacién del Centro In- ternacional de la Papa en México. Posteriormente se ha extendido la validacién de las técnicas de micropropagacién de papa a otras universidades del pais y lo mas importante, es que esta metodologia ha sido asimilada por algunos productores que en distintas partes de la Republica manejan sus propios sistemas de produccién de mi- nitubérculos y distribuyen sus excedentes entre productores que no cuentan con sus propios laboratorios de micropropagacién. Los datos del ntimero de laboratorios e invernaderos, asf como de la produccién 76 ‘Tabla 8. (Zimmerman 1991)9. Micropropagacién de microtubérculos de papa se presentan en Afto Laboratorio | Invernaderos | ja Tabla 9 (Datos proporcionados por la Confederacién Nacional de Productores de 1988 2 2 Papa de la Reptiblica Mexicana). En cuanto al futuro de la industria de la s . ‘i micropropagacién, en los pafses desarrolla- dos la tendencia es hacia la automatizacién ya la mayor especializacion de los labora- 1999 2 2 torios en la produccién de una o algunas cuantas especies. Estén en desarrollo sis- 1991 1 a temas de embriogénesis somatica a gran escala e incluso sistemas de produccién de a : . semillas artificiales. En los pafses menos desarrollados, el futuro de esta industria podria estar ligado a la produccién y explo- 1993 3 3 tacién de especies locales de gran potencial, sin descuidar el importante papel de estos 1994 1 3 sistemas en la propagaciGn de especies ame- nazadas, permitiendo su explotacion sin po- _ z ; ner en peligro a la especie Enla Figura 9 se presenta un esquema ge- neral de un sistema de micropropagacién, y Total 10 v7 en las Fotos 5 y 6 algunos aspectos concre- tos de este proceso. Tabla. Laboratories ¢ innvernaderos en operacién en México para la produccion de plintulas y ricrotubéreules de papa hota, Produceién de plantas micropropagadas y microtubérculos de papa en laboratorios de cultivo de tejidos vegetales e invernaderos. a8 | iat as | miaupapuatas | Monaco | Mises 09 i500 nso) 1as0) asa ot 3000 cwoo) 2100) 47300 283 wxo0) ramon] 50000] sa 00 495 niso00] 168500 siz] 921500 as ae ae oe 77Introduccién al cultivo de tejides vegetales = i Tabla Entidad ene eet ees Ubicaciony superficie | ri (nt) ds os laboratories © | . invernaderos dedicades Estado de México os 300, eee | depapmen Mec. | Chihuahua xo 3a Guanajuato 254 3555 Baja California 100 1.200 ‘Coahuila - Nuevo Leén == 8100 Sinaloa ans 2500 | oe Figura 9. \ Esguema general Total nis? 23995 down sso de micropropagation ‘SELECCION DE LA ESPECIE ATRABAJAR PRETRATAMIENTOS: ELECCION DE LAS PLANTAS MADRE. PLANTAS ELITE ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS AXENICOS. ELECCION Y ESTERILIZACION DEL EXPLANTE cICLOS DE MULTIPLICACION IN VITRO. SALMPLIGAGON ETAPA2 DE ACUERDO AL —— NOMERO DE PLANTAS ELOGACION ENRAIZAMIENTO. ETAPA3 DISTRIBUCION Y COMERCIALIZACION. | [___COMERCIALIZACION. |Introduccién al cultivo de tejidos vegetales Fotos 6b. Etapas 3 y 4 de la Micropropagacién Plantas micropropagadas de la orguitea Oncidium sp. ceciendo in vivo sobre substrato. Fotos 6a. Etapas 3 y 4 de la Micropropagaci6n Elongacién y enraizamiento de plantas de 1a orquidea Oncidium sp. Fotos 6c: Etapas 3 y 4 de la Micropropagacién Brotes de Cephalocereus senilis generados y enraizados in vitro, Fotos 6d. Etapas 3 y 4 dela Micropropagacién. listos para ser transferidos Brotes de Allium tuberosum generados y envaizadas Pi sfe rs 4. suelo. in vitro, lists para transferirse a suelo ia “ i ee1 a il al 4 ail jl a | fl 4 4d A b 10. CULTIVO DE CELULAS EN SUSPENSION Se le denomina cultivo de eélulas en suspensi6n al cultivo in vitro de células vegetales aisladas 0 en pequenos agregados, distribuidas en un medio nutritivo I{quido y en constante movimiento, las cuales presentan una alta tasa de divisién celular y una homogeneidad rela- tivamente alta. Los cultivos celulares se han utilizado como sistemas modelo para estudiar distintos procesos en la ciencia vegetal basica y aplicada, Entre ellos destacan las investigaciones sobre metabolismo secundario y/o produccién de los metabolitos secundarios (Alfermann y Petersen 1995, Ochoa-Alejo y Gémez-Peralta 1993), aspectos bio- {quimicos del metabolismo basico 0 primario (Shintani y Ohlorogge 1995), diferenciacién de organelos (Gillot y col. 1991), aspectos mo- leculares y bioquimicos de lasinteracciones planta/ patégeno (Gotthardt y Grambow 1992), metabolismo de nutrientes (Carrol y col. 1992), res- piracién celular (Nagano y Ashihara 1993), absorciGn y efecto de los RCV y herbicidas (Ochoa-Alejo y Crocomo 1987, Delbarre y col. 1996), aspectos ultraestructurales de la diferenciacién celular Figueiredo y Pais 1994), expresion genética (Cuzzoni y col. 1995), mecanismos de to- lerancia a diferentes tipos de estrés (Robertson y col 1995), seleccién de células resistentes a factores ambientales (Santos-Diaz y Ochoa-Alejo 1994), respuestas celulares a metales téxicos (Wollgiehn y Neumaan 1995), estudios sobre pared celular (Itoh y Ogawa 1993), y como fuente para el aislamiento y purificacién de enzimas (Murphy y Auh 1996). Lo anterior se debe a que los cultivos celulares ofrecen sistemas adecuados para diferentes procesos, ya que nos permiten disponer de grandes pobla- ciones de células relativamente homogéneas creciendo en condiciones perfectamente controladas. Ademds, estas eélulas son susceptibles de recibir de manera répida y uniforme cualquier tipo de estimulo exter- no que se aplique y cuyo efecto se desee estudiar; asimismo, la falta de clorofilas y carotenos en la mayoria de las suspensiones celulares es de gran utilidad para el aislamiento y purificacién de enzimas de origen vegetal. Por otra parte, el cultivo in vitro de eéluias en suspen-Introduccién al cultivo de tejidos vegetales si6n tiene también aplicaciones practicas directas en ciertos sistemas de embriogénesis somitica. El comportamiento de las células vegetales cultivadas en medios liquidos tiene algunas semejanzas con el cultivo de microorganismos, de hecho en los primeros experimentos que se realizaron para inten- tar crecer las células vegetales se emplearon las técnicas bésicas del cultivo de microorganismos. Sin embargo, las células vegetales presen- tan diferencias notables cuando se les compara con las células mi- crobianas. En la Tabla 12 se resumen algunas de las diferencias mas importantes. Tabla 12. Diferenciasbasicas entre células ricrobianas y etulas vegetales cultioadas en suspensién Caracteristicas (Células microbianas Células vegetales Tamaito 1-5 pm? Mayores de 10° ym? Formacién de agregados celulares rad Muy frecuente in| Usualmente menor de Tiempo de generacién it 24-150 h Densidad del indculo | 951% del volumen 5-20% del volumen extracelular total total Tolerancia al esteés causado por la Alta Baja agitacion Contenido de agua Alrededor del 75% | Alrededor del 90% Consumo de oxigeno 590mm h 1-4 mmol ft ht ee Frecuentemente Frecuentemente intracelular Complejidad del medio de cultivo Pak Alta o muy alta Casto aproximado del medio de cultivo Ce US.$50.m* Modificada de Taticek y col. 1991 El uso de medios liquidos para cultivar suspensiones celulares tiene varias ventajas en comparacién con los medios semisélidos. Cuando el tejido calloso se hace crecer sobre un medio semisélido, no todas las células se encuentran expuestas uniformemente al medio de cultivo; por ello, se forman gradientes de disponibilidad de nutrientes y de gases en el tejido, lo cual puede conducir a que se presenten 8210, Cultivo de células en suspensién alteraciones en el crecimiento y en el metabolismo. El propio agente gelificante puede liberar algunas impurezas t6xicas al medio nutritivo © también el tejido en ocasiones produce ciertos metabolites toxicos que se acumulan en la matriz gelificante y afectan al tejido vegetal En teorfa, el cultivo de células en suspensién puede iniciarse a partir de cualquier explante inoculado en medio liquido con agitacién; sin embargo, hay una mayor probabilidad de éxito y rapidez en la obtencién del cultivo si se parte de tejido calloso; por lo tanto, los cultivos de eélulas en suspensién generalmente se inician transfirien- do fragmentos de tejido calloso a matraces Erlenmeyer con medio nutritive, y colocando éstos en un agitador rotatorio para facilitar la dispersi6n celular y la oxigenacién del medio. A manera de ejemplo, podemos mencionar que para establecer cultivos en suspensién de chile (Capsicum artmum L.) se inoculan fragmentos de 5 g de tejido ca- lloso en 50 ml de medio liquido contenidos en matraces de 250 ml y se incuban bajo agitacién (120 rpm), a 25 °C por 1-3 semanas (Salgado- Garciglia y Ochoa-Alejo 1990). Los cultivos celulares deben agitarse 0 someterse a aireacién forzada para permitir un intercambio gaseoso adecuado, pues la produccién de etanol y /o de etileno por los cultivos podrian privar de oxigeno a las células y afectar su crecimiento y comportamiento (Perata y Alpi 1991, Mirjalili y Linden 1995). En ge- neral, un rango de velocidad rotatoria de 40 a 200 rpm puede ser conveniente para los cultivos celulares mantenidos en matraces Erlenmeyer de 250 ml de capacidad. Para ello, un agitador con mo- vimiento orbital de 2a 4 cm es el adecuado, Por otra parte, las sus- pensiones celulares que se utilizan para la produccién de metabolitos secundarios no necesariamente tienen que cultivarse en sistemas de agitacion; el uso de bolsas fabricadas con materiales que permiten un buen intercambio gaseoso ha dado excelentes resultados para incre- mentar 1a produccién de los metabolitos secundarios (Hamade y col 1994, Fukui y Tanaka 1995). El volumen del medio Iiquido y el tamafio del recipiente son factores muy importantes para obtener una ade- cuada aireacién (el medio de cultivo debe ocupar el 20% del volumen del matraz). El rango de temperaturas de incubacién para los cultivos celulares es el mismo que se recomienda para otros sistemas in vitro (25-28 °C), las suspensiones celulares no requieren iluminacin 0 fotoperiodos especificos, excepto cuando se desea producir meta- bolitos cuya sintesis es inducida por la luz y/o para suspensiones celulares fotoautotr6ficas. Estas tiltimas son sistemas muy titiles pa- ra el estudio de las vias metabélicas asociadas a los cloroplastos para investigar la relacion entre el crecimiento celular y el desarrollo de estos organelos. Después de la inoculacién del tejido calloso en el medio liquido agitado, éste inicia un periodo de fragmentacién en pequeftos agrega- dos que producen células libres y nuevos grupos de células; sin em- bargo, debe tenerse siempre presente que es muy dificil 0 imposible establecer un cultivo en suspensién compuesto totalmente de eélulas individuales. Por Jo que respecta al crecimiento del cultivo, éste suele —te—«83Introduccién al cultivo de tejidos vegetales mostrar un comportamiento sigmoide, mostrando las 5 fases ca- racteristicas del crecimiento (Figura 10). Esta fases son: Fase inicial de reposo (fase lag). Perfodo comprendido entre el inicio del cultivo y el momento en que se inicia la divisién celular acelerada. Su duracién depende de varios factores como la edad y cantidad del inéculo y la calidad del medio de cultivo. Las ca- racteristicas de esta fase son: Poca o nula divisién celular por lo que la densidad se mantiene constante, alta actividad de sintesis, de protefnas y las células mantienen una alta cantidad de citoplas- ma en relacion al volumen de las vacuolas. De manera general puede decirse que se trata de una fase de adaptacisn antes de la division acelerada de las células. Fase logaritmica (fase log). Aumento exponencial en el ntimero de células causado por division celular acelerada, Porlo general tiene tuna corta duracién (3-4 generaciones, aunque esto es variable). Fase linear. Fase de ineremento linear en la poblacién de células. Se incrementa el peso fresco y seco de las células debido al crecimien- to de las mismas. Fase de desaceleracién progresiva. Desaceleracién gradual en la tasa de divisién celular debido al agotamiento del medio y acumula- cion de desechos y restos celulares. Fase estacionaria. Ya no hay divisin ni crecimiento celular. Célu- las muy vacuoladas y fragiles. FASES DE DESACELERACION PROGRESIVA. DENSIDAD CELULAR FASE lag TIEMPO Figura 10, Cinética de crecimiento de wn cultivo in vitro de células vegetales en suspension. 2 FASE ESTACIONARIA FASE log10, Cultivo de cétulas en suspension Los cultivos de células en suspensién usualmente requieren subcultivos mas frecuentes que los cultivos de tejido calloso; por ello, las suspensiones celulares deben subcultivarse antes de que entren en la fase estacionaria, es decir, durante la fase linear o la fase de desace- leracién progresiva, ya que después la viabilidad celular del cultivo disminuye drasticamente. El subcultivo implica la transferencia de un inéculo adecuado de la suspensién a medio nutritivo fresco, ya sea utilizando pipetas y/o jeringas estériles, o en su defecto simplemente vaciando una parte de Ja suspensién en el medio nuevo en condiciones asépticas. Las células vegetales en cultivo requieren un inéculo minimo para poder crecer satisfactoriamente (Manoharan y Gnanam 1992). Un inéculo apropia- do para las suspensiones celulares de chile (Capsicuin anstumt L.) es el equivalente a 5 mg de peso seco por cada mililitro de medio de cultivo Galgado-Garciglia y Ochoa-Alejo 1990). En general, la fase lag del crecimiento se incrementa a medida que la cantidad del inéculo disminuye; sin embargo, es posible hacer crecer cultivos a bajas den- sidades celulares utilizando medio condicionado. El medio con- dicionado se prepara al hacer crecer células vegetales con densidades de biomasa adecuadas por determinado tiempo, para luego eliminar- las y utilizar el medio nutritive para otro cultivo. Aparentemente las células liberan compuestos desconocidos al medio liquido, los cua- les promueven la divisién y el crecimiento celular a densidades e¢ lulares subéptimas (Teasdale y Richards 1991). Los medios con- dicionados contienen factores que no parecen ser especificos para cada especie vegetal, ya que el medio condicionado de una especie ayuda al crecimiento de células de otras especies distintas (condicionamiento eruzado) (Steinbrenner y col. 1989). En ciertos cultivos, la estimulacién del crecimiento por un medio condicionado puede ser mimetizada por la poliamina denominada espermidina, pero no por otras poliaminas (Manoharan y Gnanam 1992). Por otro lado, existen reportes en la literatura que indican que el efecto del medio condicionado en algunos otros cultivos no puede ser substituido por una gran diversidad de substancias tales como auxinas, citocininas, poliaminas y vitaminas (Teasdale y Richards 1991). La mayorfa de los estudios para dilucidar la naturaleza quimica del(los) factor(es) involucrados en este fend- ‘meno, sugieren que son compuestos de tipo oligosacarido (Schroder y Knoop 1995). La velocidad de crecimiento de un cultivo de células en suspen- sién depende de la densidad inicial del inéculo, de la duracién en cada caso de la fase lag 0 de reposo y de la tasa de multiplicacién del cul- tivo. Los dos tiltimos factores dependen del genotipo de las lineas celulares, del medio nutritivo y de las condiciones de incubacidn. Exis- ten diferentes técnicas para medi el crecimiento de las suspensiones celulares, algunas de ellas son de tipo destructivo y otras son no des- tructivas; cada una varia en complejidad y en la informacion que proporciona (Ryu y col. 1990, Olofsdotter 1993). Ya que ninguno de los métodos para medir crecimiento en las suspensiones celulares es cienIntroduccién al cultivo de tejides vegetales por ciento infalible, es recomendable medir este parametro utilizando dos o més técnicas al mismo tiempo. A continuacién se discuten brevemente las mas comunes. 86 Volunten del paquete celular. Este método se basa en determinar el volumen celular en relacién al volumen total del cultivo. Para es- tose debe tomar una muestra del cultivo y enar con ella un tubo de centrifuga graduado, anotando el volumen total. Esta mues- tra deberé centrifugarse por 5 min a 200 g para sedimentar las células. Finalmente se determina el volumen celular sedimenta- do y se expresa éste como porcentaje del volumen total 0 como mililitro de paquete celular. Este es uno de los métodos no destructivos mas sencillos y por lo tanto mas utilizados para monitorear el crecimiento de una suspensién celular, Niimero de células por unidad de volumen. Este método se basa en la determinacion del ntimero de células por unidad de volumen. Para ello, se toma una muestra del cultivo y se realiza un conteo celular con ayuda de un hemocitémetro. Para que este método resulte confiable, debe utilizarse el valor promedio de varias determinaciones independientes. Los hemocit6metros mds co- ‘munes (0.1 mm de profundidad) tienen un volumen en cada cua dro de 0.1 mm*, por lo que el promedio obtenido de los conteos deberd multiplicarse por 10 000 para obtener el numero de célu- las por mililitro en el cultivo original. En caso de resultar necesario el cultivo puede diluirse, en cuyo caso el valor final deberd multi- plicarse ademas por el factor de dilucién. Sin embargo, como las, suspensiones celulares no estén constituidas por células vegeta- les individuales, sino que en su mayorta se encuentran en forma de agregados celulares de tamafio variable, es recomendable realizar una disgregaci6n previa. En estos casos se puede adicio- nar un volumen de la suspensién celular a dos voltimenes de una solucién de tridxido de cromo al 8% (p/v) y calentar a 70°C por 15 min. Después de enfriar la mezcla, ésta se agita vigorosamente para disgregar los grupos de células antes de realizar el conteo. ‘Alternativamente, se pueden utilizar tratamientos enzimati- cos para separar los agregados celulares, tales como pectinasa al 0.25% (v/v). eso fresco y peso seco, El crecimiento también se puede evaluar determinando el peso de la biomasa producida, En este caso se filtra un volumen conocido de medio para obtener las células contenidas en él, y se determina el peso fresco de las mismas. Es indispensable pesar previamente los filtros en que se va a llevar a cabo la determinacién. Ademés, en la determinacién del peso fresco, el tiempo para retirar el exceso de medio de cultivo debe ser homogéneo para todas las muestras. Para la determinacién del peso seco, los filtros con las células se mantienen a 95°C du- rante 5-8 h para retirar la humedad contenida en ellas. El resul- tado se expresa como peso fresco y/o peso seco de biomasa por unidad de volumen.10, Cultivo de células en suspension © Conductividad eléctrica del medio. Se sabe que la conductividad del medio es inversamente proporcional al peso fresco de las célu- las contenidas en él; esto debido a la utilizacién de los nitratos contenidos en el medio por parte de las células que reduce la con- ductividad del mismo. Este es el método mas sencillo, pero se requiere de hacer una calibracién para cada tipo de cultivo utilizando algtin otro de los métodos mencionados. * Contenido de proteina y ADN. El método se basa en el incremento de la protefna total o del ADN por unidad de volumen a medida que el ntimero de células se incrementa. Para estimar la proteina total, se colectan las células en un filtro de fibra de vidrio y se la- van dos veces con etanol 70% hirviendo. El material vegetal se seca con acetona y enseguida se coloca el filtro en una solucion de NaOH 1 My se calienta a 85°C por 90 min. Se filtra la mezcla y la proteina hidrolizada se cuantifica en el filtrado por alguno de los métodos que existen para ello. Para la determinacién del contenido de ADN en las suspensiones, existe una gran variedad de métodos, éstos varfan desde la simple extraccién con dcido perclorico hasta técnicas de particidn en solventes y precipitacién. La cuantificacién del ADN se hace por espectrofotometria. + Viabilidad celular. Los métodos descritos anteriormente miden la biomasa celular; sin embargo, en algunos casos se requiere cuan- tificar mas que el ntimero total de células, el ntimero 0 proporcion de células viables presentes en un cultivo. Las técnicas para medir esta viabilidad celular pueden ser agrupadas dentro de tres categorfas. 1. Observaciones de las corrientes citoplasmdticas 2. Mediciones de la integridad de las membranas, tales como liberaci6n de electrolitos, plasmélisis y exclusién o retencion de colorantes. 3. Mediciones de actividad bioquimica, tales como sintesis de proteinas, reduccidn desales de tetrazolio, sintesis de ADN y ARN, contenido de ATP y tincién con diacetato de fluorescein, De estas técnicas, sélo la observacion de corrientes citoplis- micas es no destructiva. SINCRONIZACION DEL CRECIMIENTO CELULAR Como se ha mencionado anteriormente, los cultivos de células en sus- pension son un sistema modelo adecuado para un gran nimero de estudios relacionados con la bioquimica y fisiologta celular. Esto se de- bea que nos dan la posibilidad de contar con poblaciones relativamente homogéneas de células creciendo bajo condiciones controladas. Sin embargo, en un cultivo en suspensin normal no hay homogeneidad — ~ ~ 87