TEHNOLOGII UTILIZATE PENTRU CLONAREA PLANTELOR

I.

CULTURA DE MERISTEME

Meristemele sunt alcatuite din celule nediferentiate, care se divid intens si asigura organogeneza. Pot fi: primare (organogene) asigura cresterea in lungime meristeme caulinare sau radiculare; secundare asigura cresterea in grosime felogenul (cambiul libero-lemnos) si cambiul subero-felodermic; florale apar din meristemele caulinare genereaza carpele si stamine; foliare - elaboreaza limbul frunzei; intercalare (la nivelul nodurilor) asigura alungirea internodurilor. . CULTURA DE MERISTEME Meristemul caulinar este alcatuit din: Zona apicala axiala - celule cu activitate mitotica redusa; Zona apicala laterala - celule ce se divid activ si genereaza primordiile foliare; Primordiile foliare; Zona axilara - la baza primordiilor foliare; Meristemul foliar, histogen, genereaza celulele maduvei; Procambiul plasat sub domul apical si genereaza floemul si xilemul. Meristemele sunt surse preferate de explante pentru culturile in vitro. Se folosesc:

Toate elementele componente sau Meristemul sensu-stricto (doar domul apical) sau Mersitemul sensu-lato (domul apical + 1-3 primordii foliare) sau Apexuri de 0,5 mm. Etapele unei culturi de meristeme: Sterilizarea materialului biologic Spalarea repetata cu apa Imersare 1 min. in alcool 70% Imersare in solutie sterilizanta (hipoclorit de sodiu sau calciu) Spalare repetata cu apa distilata sterila. Prelevrarea meristemelor Se inlatura aseptic frunzele Se detaseaza (sectionare) un fragment de 0,1-0,5mm Se transfera explantul pe mediu de cultura agarizat cu hormoni vegetali Cultivare la 20-25C timp de 10 zile in camera climatica Lastarii se transfera pe medii de cultura fara hormoni pentru inradacinare si obtinerea plantelor Factori ce influenteaza culturile de meristeme: Dimensiunea explantului (0,2-0,5mm) Varsta plantei donor; in cazul plantelor lemnoase se practica rejuvenilizarea:

Drajoni (la plop, prun, pin); Taieri sistematice pentru a stimula lastarirea (la pin); Altoirea cu ramuri din varful coroanei pe ramuri de la baza (din aceeasi specie); Microaltoirea in vitro a unor meristeme pe plantule obtinute din seminte. Localizarea mugurelui mugurii terminali sunt superiori celor axilari in privinta potentialului de crestere. Sezonul prelevarea mugurelui la sfarsitul perioadei de latenta si din apexuri care cresc activ. Medii de cultura: solidificate cu 0,7-1% agar , cu zaharoza ca sursa de carbon (2-5%g/v), suplimentate cu vitamine, auxine, gibereline, citochinine (10-5-10-8M), pH 5,5-5,8 (Murashige&Skoog, B5, White), iar pentru orhidee, ferigi si gimnosperme se folosesc medii mai simple (solutia Knop).

II. MICROPROPAGAREA Reprezinta propagarea (multiplicarea) asexuata in vitro. Accelerarea proliferarii mugurilor axilari (lastarirea axilara multipla) Inducerea formarii mugurilor adventivi Inducerea diferentierii embrionilor somatici. Lastarirea axilara multipla: Initierea culturii folosind ca explante: varfuri de lastari, noduri cu muguri axilari, inflorescente;

Reactivarea meristemelor din explante si inducerea lastaririi (tufe de lastari) cu citochinina (suprima dominanta apicala si accelereaza functionarea meristemelor din mugurii axilari si de la noduri); Utilizarea lastarilor ca noi surse de explante. Nu implica etapa de calus si asigura o mare uniformitate genetica. Exemplu: la crizantema se pot obtine 9 x 106 butasi/an de la un singur apex Formarea mugurilor adventivi Initierea culturii folosind ca explante fragmente de organe si tesuturi (frunza, tulpina) sau celule izolate (polen, protoplasti); Inducerea formarii mugurilor adventivi; Alungirea lastarilor; Formarea calusului primar; Transferul calusului pe mediul de inducere a organogenezei pentru formarea lastarilor (regenerare indirecta via calus); Inradacinarea lastarilor in vitro pe medii cu auxina sau direct in sol. Dezavantaj: apar numeroase variatii genetice si epigenetice (pot fi evitate prin evitarea regenerarii indirecte). Embriogeneza somatica Initierea culturii in vitro folosind explante (fragmente de tesuturi si organe, celule izolate); Formarea calusului primar sau a microcalusului (din celule izolate); Subcultivarea calusului primar sau a microcalusului;

Disocierea celulelor calusului si obtinerea suspensiilor celulare care se disperseaza pe suprafata mediului solid pentru obtinerea de noi calusuri; Inducerea embriogenezei somatice in culturile de calus; Germinarea embrionilor si obtinerea plantelor O planta haploida este un sporofit cu numar gametofitic de cromozomi (deci o planta cu constitutia cromozomala similara cu cea a gametilor normali ai speciei respective). La plantele inferioare haploidia este constitutia normala a perioadei gametofitice din ciclul evolutiv. La plantele superioare este un eveniment rar spontan sau indus. Haploidia spontana: s-a raportat la 71 specii de angiosperme; poate fi cauzata de: partenogeneza, poliembrionie, androgeneza.

PRODUCEREA HAPLOIZILOR IN VITRO

Haploidia spontana Partenogeneza Haploizii partenogenetici sunt originari din oosfere nefecundate (fecundatia nu mai e dubla, are loc doar in celula centrala a sacului embrionar si apare endospermul, iar oosfera se dezvolta intr-un embrion partenogenetic); frecventa de 1% la porumb. Poliembrionia Intr-o samanta pot exista simultan 2-3 embrioni din care unul e haploid; frecventa 10% la in. Cauza este ca oosfera se divide inainte de fecundare, o celula e

fecundata de nucleul spermatic si genereaza zigotul si embrionul normal, cealalta celula - dezvolta un embrion partenogenetic. Androgeneza Un gamet mascul (nucleu spermatic) nu mai realizeaza fecundare, ci da nastere unui embrion chiar in interiorul sacului embrionar; frecventa de 21% la Brassica napus. Haploidia indusa: Se realizeaza prin anomalii ale dezvoltarii embrionilor, fecundari anormale, alterarea procesului de gametogeneza. Tratarea gametofitului cu agenti fizici (iradiere, socuri termice) sau chimici (albastru de toluidin) afecteaza capacitatea de germinare a polenului si polenizarea cu polen steril duce la formarea embrionilor partenogenetici (care vor fi cultivati in vitro pe medii adecvate); s-au obtinut astfel haploizi la petunii si pepeni Hibridarea interspecifica sau intergenerica, de multe ori, presupune incompatibilitate genomica si fecundarea, fie nu are loc, fie se realizeaza, dar in primele 5-10 zile se elimina unul dintre genomuri. Procesul afecteaza si endospermul, de aceea embrionii trebuie cultivati in vitro. Ex. hibridizarea intre Hordeum vulgare si Hordeum bulbosum duce la obtinerea haploizilor de H. vulgare. La fel, hibridizarea intre Triticum si Zea duce la obtinerea haploizilor de grau. Cultura in vitro a gametofitilor femeli si masculi exploateaza insusirea de totipotenta pe care o poseda si celula haploida. Haploidia indusa Prin androgeneza experimentala (culturi de antere si/sau microspori) se practica la H. vulgare, Triticum aestivum, Nicotiana tabacum (tutun), Datura inoxica (ciumafaie), Brassica napus, etc.

Cultivate in vitro, in antere sau izolate, grauncioarele de polen (microsporii) pot fi reprogramate sa dezvolte un sporofit. Androgeneza directa cand microsporul se comporta ca un zigot, parcurge embriogeneza polinica si formeaza un embrion; Androgeneza indirecta cand microsporul evolueaza intai intr-un calus, din care, apoi regenereaza plante haploide. Dezvoltarea normala a gametofitului mascul (graunciorul de polen) presupune: Formarea celulelor mama ale grauncioarelor de polen (microsporocite); Meioza si formarea unei tetrade cu spori in fiecare sporocit; Eliberarea sporilor din tetrade si dezvoltarea lor in antera (cresterea in volum, vacuolarea); Maturarea microsporilor cuprinde o prima diviziune mitotica (mitoza polinica) prin care se formeaza o celula vegetativa si o celula generativa, urmata de o a doua diviziune mitotica (mitoza spermica) prin care celula generativa se divide in doi nuclei spermatici. Rezultatul androgenezei induse depinde de stadiul de dezvoltare al gametofitului. Embriogeneza polinica Prin diviziuni repetate anormale ale microsporilor se poate forma un polen multilocular (multicelular); fiecare nucleu, poate genera un proembrion; prin ruperea exinei in stadiul globular (2-5 saptamani), embrionii polinici sunt eliberati si parcurg aceleasi stadii ca embrionii zigotici sau pot genera calus. Deci pot regenera plante in vitro.

Tehnica de cultura a anterelor: Cultivarea plantelor donor de antere in sere sau camp, in conditii optime de mediu, nutritie si sanatate; Prelevarea mugurilor florali (care contin antere cu microspori) de pe plante tinere, la inceputul perioadei de inflorire; Pretratamente stresante (socuri termice); Sterilizarea cu solutii standard (hipoclorit de sodiu sau calciu) si spalarea repetata cu apa distilata sterila sub hota cu flux laminar; Prelevarea aseptica a anterelor cu instrumente fine (ace, pense) pentru a evita ranireasi transferul pe medii de cultura; Incubarea 3-5 saptamani in conditii controlate de temperatura (2427C) si lumina; uneori se aplica soc termic (30-35C). Transferul embrionilor sau calusurilor obtinute pe medii speciale pentru regenerarea plantelor haploide (sau pot germina in acelasi mediu); Transferul plantelor haploide in sol. Plantele haploide (n) sunt de obicei sterile. Pentru obtinerea plantelor homozigote fertile se practica diploidizarea (2n) cu colchicina 0,5-1%, tratament aplicat calusurilor, plantulelor sau plantelor (la nivelul mugurilor axilari) Tehnica de cultura a microsporilor presupune izolarea mecanica a microsporilor prin zdrobirea anterelor si filtrarea amestecului pentru eliminarea resturilor de tesut. Se folosesc filtre metalice sau de nylon cu pori de dimensiune adecvata marimii microsporilor speciei cu care se lucreaza. Se spala si se filtreaza de 2-3 ori, iar inainte de cultivare, densitatea microsporilor trebuie sa fie de 0,5-1 x 105/ml. Culturile se incubeaza la intuneric.

Ginogeneza experimentala - tehnica de cultura a ovarelor sau ovulelor nefecundate, a fost aplicata prima data in 1976 la orz. Azi se practica la numeroase specii: orez, gerbera, sfecla de zahar, floarea soarelui, petunie, plop. La recoltare, ovulele trebuie sa contina saci embrionari maturi. Dezvoltarea normala a gametofitului femel presupune: O celula a nucelei devine arhespor. Arhesporul se divide si formeaza 2 celule din care una degenereaza si cealalta devine macrosporocit; Macrosporocitul se divide meiotic si formeaza 4 celule haploide din care 3 degenereaza si una devine macrospor; Macrosporul se divide de 3 ori mitotic si formeaza 8 nuclei haploizi ai sacului embrionar, care se vor diferentia in 3 antipode, doua sinergide, oosfera si celula centrala diploida. De dezvoltarea normala a gametofitului femel si de stadiul atins in momentul recoltarii depinde ginogeneza indusa experimental; Factori implicati in producerea haploizilor in vitro: Genetici -aptitudine/competenta androgenetica/ginogenetica Numarul anterelor androgenetice/100 antere cultivate; Numarul plantelor haploide obtinute in final din 100 antere cultivate. De mediu: temperatura, fotoperioada, intensitatea luminii, difera de la o specie la alta; In fitotron (cu intensitati mari ale luminii 24.000 lucsi) se pot obtine rezultate pe durata intregului an. Pretratamente aplicate in vivo sau in vitro pot stimula dezvoltarea sporofitica a gametofitilor. Infometarea de azot,

Temperaturi scazute sau ridicate, Fotoperioade scurte, Absenta fierului (fierul e indispensabil pentru o embriogeneza normala); Hormoni de crestere (auxine si citochinine in doze variabile in functie de specie).

Utilizarea haploizilor in ameliorare si genetica Obtinerea liniilor homozigote instant si fertile (deoarece haploizii sunt sterili) se realizeaza prin dublarea numarului de cromozomi. Metodele clasice de obtinere a homozigotilor, prin autofecundari repetate, necesita timp indelungat . Elaborarea hartilor genetice ale unor specii; Obtinerea rapida de soiuri si hibrizi performanti la grau, orez, orz, tutun, vinete, rapita. Izolarea mutantelor recesive care in stare heterozigota, sunt mascate in fenotip, de manifestarea genelor dominante. Aparitia variabilitatii gametoclonale. Obtinerea poliploizilor si a aneuploizilor. Obtinerea plantelor transgenice (modificate genetic) prin transferul unor cromozomi intregi, brate sau fragmente, creste asfel numarul caracterelor utile transferate. Tehnicile aplicate sunt: Microinjectia materialului genetic exogen direct in nucleul microsporilor,

Electroporarea (aplicarea unor impulsuri electromagnetice pentru a crea pori prin care sa patrunda materialul genetic exogen in celula); Metoda biolistica prin care microsporii sunt bombardati cu microparticule pe care a fost adsorbit ADN exogen

Producerea metabolitilor secundari prin culturi in vitro

Celulele vegetale pot fi cultivate, ca si microorganismele, la scara industriala pentru obtinerea unor compusi chimici utili in industria farmaceutica, alimentara, textila, agricultura, etc. Metabolitii secundari se deosebesc de cei primari (glucide, proteine, lipide, acizi nucleici) prin: Natura chimica foarte variata (peste 50000 substante diferite); Sinteza lor in tesuturi specializate sau numai in anumite stadii de dezvoltare ale plantei Acumularea in anumite organe ale plantelor; Utilizarea lor in diferite domenii ale economiei. Pentru plante, ele au rol bine definit: Atragerea insectelor polenizatoare; Apararea contra insectelor, microorganismelor, ierbivorelor; Dispersarea semintelor. Obtinerea lor se face prin : Extractie din plante din flora spontana sau cultivata; Sinteza pe cale chimica (destul de greu si costisitor);

Cultivarea in vitro a celulelor vegetale producatoare de metaboliti secundari (avantaje: cantitate si calitate constanta, timp scurt, eficienta, costuri reduse). Etape: Alegerea speciei si chemotipului; Initierea culturilor de calus (pentru inducerea variabilitatii somatoclonale) Tipul de explant potrivit; Mediul de cultura; Conditii. Selectia liniilor celulare inalt producatoare prin metode moderne: cromatografie, colorimetrie, teste ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) RIA (radio-immunoassay); Obtinerea suspensiilor celulare stabile si foarte productive (deci in mediu lichid); Optimizarea productiei (adaugarea in mediu a unui precursor al metabolitului sau aplicarea unui factor de stress abiotic sau biotic); Productia la scara industriala (reactoare de peste 75m3, cultivare agitata pentru a evita formarea agregatelor, timp de dublare a biomasei de 16-24h, rata diviziunii mica, durata unei sarje mare) ; Extractia si purificarea prin metode chimice sau biochimice (din mediu sau direct din biomasa). Perspective: Cercetarea si lansarea pe piata a unui compus nou necesita 10 ani de investitii.

Costurile pot fi recuperate daca: Produsul are un cost de 400-500 USD/kg; Are o piata anuala de 50mil. USD (prin etichetarea natural urmarind sa inlocuiasca produse de sinteza din categoriile: arome, aditivi alimentari, cosmetice, farmaceutice). Scaderea costurilor se poate face prin clonare genelor si exprimarea lor in linii celulare (eventual microbiene) care sa fie cultivate mai ieftin sau prin inducerea (prin manipulare genica) a acumularii metabolitilor in cantitati mult mai mari in celule.

Tehnologii utilizate pentru introgresie genetica

Calea conventionala de ameliorare - hibridarea interspecifica sau intergenerica - se loveste de multe ori, de o serie de bariere, inainte sau dupa fecundare. Introgresia genetica inseamna modificarea unor genomuri prin introducerea unor gene noi de la specii mai mult sau mai putin inrudite filogenetic si are drept consecinta ameliorarea speciilor. Tehnologii aplicate: Fecundarea in vitro; Cultura embrionilor imaturi; Hibridarea somatica. 1. Fecundarea in vitro: Trebuie sa se utilizeze polen si ovule in stadii optime;

Anterele sunt recoltate din flori, cand sunt gata sa se deschida si sunt plasate pe un substrat nutritiv adecvat, pentru a elibera polenul; Se recolteaza aseptic carpela (pistilul) florii pe care se doreste sa se faca polenizarea; Polenizarea in vitro se face aducand polenul matur pe un stigmat sau direct pe un ovul (dupa excizarea lui aseptica); Dupa fecundare, pistilul se plaseaza pe mediu de cultura adecvat Aplicatii ale fecundarii in vitro: Producerea hibrizilor interspecifici sau chiar intergenerici, care nu exista in natura; Depasirea barierelor de autoincompatibilitate la fecundare (definita ca incapacitatea plantelor cu flori hermafrodite de a realiza autofecundare, adaptare prin care se asigura mentinerea unei structuri heterozigote a populatiilor); Producerea haploizilor (prin cultura in vitro a anterelor si ovarelor, polenizare intarziata, polenizare cu polen iradiat sau tratat chimic, termic, etc.). 2. Cultura embrionilor imaturi (salvarea embrionilor): Tehnica e utilizata inca din 1925, cand Leibach a salvat pe medii de cultura, embrionii zigotici obtinuti prin hibridari indepartate si care, in natura, ar fi degenerat. In prezent, se utilizeaza intens pentru depasirea latentei semintelor, scurtarea perioadei de ameliorare a speciilor,

furnizarea materialului pentru micropropagare, obtinerea plantelor haploide sau poliploide. Presupune disectia semintei, excizia embrionului (in conditii aseptice) fara a-l leza, si trecerea lui pe medii de cultura. Uneori, daca embrionul e prea mic, prea fragil se practica: Grefarea lui intr-un endosperm doica normal dezvoltat; viabilitatea embrionulului creste de la 1% la 30-40%; Transplantarea embrionului in ovare sau ovule sanatoase, viguroase care vor fi cultivate in vitro pe medii adecvate. Lumina e foarte importanta: cultura de embrioni trebuie tinuta 12 saptamani la intuneric si apoi trecuta la lumina pentru formarea clorofilei; Temperatura este foarte importanta 25-30C, la fel si mediul de cultura (sursa de energie zaharoza, giberelinele stimuleaza iesirea din perioada de latenta, citochininele in combinatie cu o auxina asigura buna dezvoltare a embrionilor). Astfel s-au obtinut hibrizi Hordeum x Secale, Triticum x Secale, Triticum x Aegilops. 3. Hibridarea somatica 3.1. Izolarea protoplastilor prin liza peretelui celular. Protoplastii : au capacitate de crestere, de diviziune, pot sa-si regenereze peretele celular,

constituie un sistem experimental optim pentru manipulari genetice; pot fuziona rezultand hibrizi somatici; pot ingloba in nucleul lor material genetic exogen (introgresie genica) si apar plante transgenice. Peretele celular: Contine 20-30% celuloza, hemiceluloze si pectine 70-80%, proteine 10%; Este lizat sub actiunea celulazelor sau a pectinazelor. 3.1. Izolarea protoplastilor prin liza peretelui celular. Plasmoliza se realizeaza in solutii de sorbitol sau manitol 0,5M substante hipertonice, netoxice, cat mai putin metabolizabile, care sa mentina potentialul osmotic al celulei, astfel incat celula sa nu piarda apa si sa se deshidrateze, dar nici sa nu primeasca apa, sa devina turgescenta si sa se sparga). ajustarea cu manitol sau sorbitol se aplica atat enzimelor care degradeaza peretele,cat si solutiilor de spalare sau mediilor de cultura. Digestia enzimatica a peretelui celular:

Se recolteaza tesuturi tinere, in crestere (frunze, cotiledoane, hipocotil) Se indeparteaza nervurile principale si epiderma inferioara a frunzelor si se taie fragmente mici; Se prepara solutia de digestie enzimatica: manitol sau sorbitol (stabilizator osmotic), o pectinaza (ce dizolva lamela mijlocie si separa celulele), celulaze, hemicelulaze (degradeaza propriu-zis peretele si elibereaza protoplastii). Enzimele se comercializeaza sub diferite denumiri: Celulaza R-10, Macerozim R-10, Drisdelaza, Pectoliaza Y-23; Protoplastii sunt separati de resturile nedigerate prin filtrare, se spala (in solutii cu aceeasi presiune osmotica); Se determina viabilitatea lor cu coloranti vitali (albastru Evans, diacetatul de fluoresceina) 3.2. Cultivarea protoplastilor presupune: Reglarea presiunii osmotice a mediului (scade treptat osmolaritatea dupa ce protoplastii si-au regenerat peretele celular si au parcurs primele diviziuni) Primele diviziuni au loc dupa 2-7 zile de la izolare; Reglarea densitatii initiale a protoplastilor in mediu se face prin numarare cu hemocitometru (0,5-2 x 105 sau 1-2 x 106/ml);

Mediul pentru formarea calusului din protoplasti izolati este Kao & Michayluk (1975) Metode de cultivare: Suspendati intr-un strat subtire de mediu, intr-un vas Petri; In micropicaturi de 20-40ml suspendate pe capacul unui vas Petri; Suspendati in mediu lichid ce se toarna la suprafata unui mediu solid; Imobilizati in agar, agaroza sau alginat; Pe straturi hranitoare (straturile de celule stau pe membrane); Cultura se face la lumina difuza sau intuneric, temperatura de 24-26C si cu aplicarea unor impulsurilor electrice 2501500 V timp de 10-50 msec. Plantele regenereaza via calus (organogeneza indirecta) 3.3. Fuziunea de protoplasti: Metoda chimica: aglutinarea protoplastilor are loc cu polietilenglicol (PEG) 25-40%, apoi, in solutia de fuziune (ce cuprinde ioni de Ca2+ si pH = 10) se obtin heterocarioni (celule ce inglobeaza cele doua nuclee ale protoplastilor ce au fuzionat). Metoda fizica: aglutinarea se produce cu curent alternativ (0,51,5MHz) iar heterocarionii se obtin cu socuri electrice de curent continuu 200 V, timp de 10-100 msec.

Selectia heterocarionilor (celulelor fuzionate) din amestecul final de celule se bazeaza pe utilizarea unor markeri genetici care confera o proprietate noua,usor detectabila pe un mediu selectiv. Ex. rezistenta la antibiotice, la erbicide, deficiente in sinteza unor compusi (mutatii auxotrofe) sau mutatii clorofiliene. 3.4. Caracterizarea hibrizilor somatici: Simetrici = a avut loc aditia completa a celor doua genomuri nucleare ale protoplastilor; Asimetrici = se elimina partial unul din cele doua genomuri; Cibrizi = contin citoplasma hibrida (genomul mitocondrial si cel cloroplastic al ambilor parteneri de fuziune) si un singur nucleu (celalalt fiind pierdut). S-au obtinut hibrizi somatici simetrici la Nicotiana, Petunia, Datura, Daucus, Lycopersicon, Brassica (amfiploizi) dar si poliploizi si aneuploizi. Cu cat speciile implicate in fuziune sunt mai indepartate filogenetic, cu atat se obtin mai usor hibrizi asimetrici (se pierd spontan cromozomi din genomul unei celule) fenomen de asimetrizare CONSERVAREA CELULELOR, TESUTURILOR SI ORGANELOR VEGETALE
Conservarea pe termen mediu determina prelungirea perioadei dintre doua repicari succesive: Conditii de hipoxie; Temperaturi scazute;

Potential hidric diminuat (zaharoza sau manitol); Medii aditionate cu acid abscisic (ABA 5mg/l). Crioconservarea in prezenta substantelor crioprotectoare: glicerol, dimetilsulfoxid, prolina, polietilenglicol (celulele sunt protejate de efectele negative ale cristalelor de gheata). Crioconservarea celulelor vegetale cultivate in vitro Pretratamentul: Precultura timp de cateva ore-zile in mediu cu manitol, prolina sau sorbitol; Impregnarea la 0C, in mediu de precultura in care se adauga, treptat, glicerol sau dimetilsulfoxid (DMSO); Repartizarea in fiole sterile. Congelarea Treptat 0,5C/min, pana la -40C sau Rapid, direct la -40C; Transferul in azot lichid la -196C. Estimarea viabilitatii celulelor: Cu DAF (diacetat de fluoresceina) celulele moarte apar colorate in albastru, cele vii apar fluorescente; (exprimare %) Cu TTC (trifeniltetrazoliu) care prin reducere formeaza formazan rosu, solubil in alcool 95% si determinarea spectrofotometrica (absorbtie la 485-530nm) e proportionala cu numarul celulelor vii.

OBTINEREA PLANTELOR TRANSGENICE PRIN CULTURI CELULARE IN VITRO Transformarea genetica a plantelor sau obtinerea plantelor transgenice consta in schimbarea structurii genetice a unei specii prin transferul si integrarea stabila a unor gene noi, manipulate in vitro (introgresie genica). Obtinerea si a confirmarea statutului de planta transgenica, implica: Tehnici de transfer al genelor; Tehnici de cultura in vitro a celulelor, protoplastilor, tesuturilor, organelor, plantelor intregi; Tehnici de confirmare a integrarii, mentinerii stabile si exprimarii genelor clonate in genomul plantelor regenerate. Tehnici de transfer al genelor: S-au inventariat 21 de astfel de tehnici, nici una nu este universal valabila; O tehnica ideala ar trebui: Sa fie independenta de genotipul celulei (organismului) gazda Sa necesite un numar cat mai mic de manipulari in vitro care sunt laborioase, mutagene; Sa asigure obtinerea unui numar cat mai mare de plante transgenice regenerate in care sa se exprime gena (genele) transferata.

Clasificare: Indirecte - cu ajutorul vectorilor (virusuri, plasmide Ti sau Ri); Directe fizice sau chimice: incubarea protoplastilor cu polietilenglicol (PEG), electroporarea, microinjectia cu AND exogen, metoda biolistica, etc. Transferul genelor la plante prin intermediul vectorilor Genul Agrobacterium cuprinde bacterii ce traiesc in sol si infecteaza plantele dicotiledonate, avand ca poarta de intrare leziuni de la nivelul coletului (portiunea de la baza tulpinii). A. tumefaciens induce formarea tumorilor contine plasmidul Ti (tumor inducing) A. rhizogenes dezvolta radacini firoase contine plasmidul Ri (root inducing) are un spectru de gazde mult mai mare deoarece determina modificarea fenotipica a radacinii, poate fi realizata usor selectia transformantilor, fara utilizarea unor gene marker. Sistemul genetic al plasmidelor Ti si Ri:

Zona ADN-T, care se integreaza in genomul celulei vegetale codifica enzime implicate in biosinteza fitohormonilor raspunzatori de aparitia malformatiilor (tumorilor) la plante; codifica enzime implicate in producerea si secretia opinelor (derivati ai aminoacizilor) pe care bacteria le utilizeaza in metabolismul propriu, ca sursa de carbon si azot; prezinta la capete, 25 pb recunoscute de o endonucleaza care decupeaza fragmentul pentru a-l transfera in genomul celulei gazda. Regiunea vir (virulenta) este activata de un mesager chimic (acetosiringona) elaborat de o planta ranita la nivelul coletului; codifica endonucleaza ce decupeaza fragmentul AND-T si astfel,o monocatena a acestuia va fi transferata in celula vegetala. ramane functionala si cand este plasata pe un alt replicon ce nu contine zona AND-T; Deci zona ADN-T si zona vir se complementeaza in pozitie trans pentru a determina fenotipul de oncogenitate; Dar: plasmidele Ti au dimensiuni mari (140-235kb) si sunt greu de manipulat; din celulele tumorale nu pot fi regenerate plante normale.

Modificari ale plasmidelor Ti: Dezarmarea plasmidelor Ti prin eliminarea zonei ADN-T; Construirea unor vectori binari din plasmide mici de la E. coli (pBR322, pUC, etc). Transferul vectorilor binari la Agrobacterium ce poseda plasmide Ti dezarmate, dar capabile sa exercite functia de virulenta si deci, sa insere fragmentul ce inlocuieste zona ADN-T, in genomul celulei vegetale.

Un vector binar folosit pentru clonare genica la plante contine: Originea replicarii (oriV) ce permite vectorului sa se multiplice atat in E. coli cat si in Agrobacterium. Gena marker detectabila in sistem bacterian (rezistenta la antibiotice). Caseta de expresie = zona delimitata de doua secvente de ADN complementare cu secvente de 25pb de la extremitatile zonei ADN-T din plasmidul Ti; aceasta zona va inlocui zona ADN-T (si, in final, se va integra in genomul celulei vegetale). Caseta de expresie este formata din: O secventa poli(A); Un PCS (poly cloning site) in care sa se gaseasca situsuri pentru cat mai multe endonucleaze de restrictie (Hind III, Pst I, Sal I, Bam H I, Eco R I, etc.) unde poate fi introdusa o secventa poli-linker;

Un promotor constitutiv ce asigura exprimarea (transcrierea) genelor clonate in PCS (continute de secventa poli-linker) si apoi transferate in celula vegetala (odata cu vectorul binar); poate fi: Promotorul 35S (de la virusul mozaicului conopidei) pentru transformarea genetica a unor plante dicotiledonate; Promotorul actinei (de la orez) sau cel al ubiquitinei (coenzima Q10 de la porumb) pentru transformarea genetica a unor plante monocotiledonate. Secventa poli-linker ce este introdusa in PCS, contine: Gena (genele) de interes ce confera plantei caractere importante economic: toleranta la erbicide, rezistenta la salinitate, la daunatori, agenti patogeni, etc; Un promotor organ (tesut)-specific: Pentru samanta: promotorul gluteninelor la grau, al vicilinei la mazare, al a-amilazelor din stratul de aleurona la cereale; Pentru tesuturi fotosintetizatoare: promotorul Rubisco, CAB (asociati cu biosinteza clorofilelor a/b); Pentru antere: promotorul specific pentru sinteza stratului (tapetum) ce captuseste lojele anterelor si hraneste microsporii. Gene raportor care permit selectia celulelor vegetale transformate deoarece codifica un produs vizibil, cuantificabil (gena LUX ce codifica luciferaza si asigura emisia de lumina, gena GFP pentru emisie de lumina fluorescenta verde, in UV, gena GUS de la E.coli ce codifica b-glucuronidaza si aparitia unor compusi colorati, NPT II ce confera rezistenta la Neomicina, etc.). Etapele unui protocol de transformare sunt:

Construirea vectorului binar; Obtinerea plasmidului Ti dezarmat de zona ADN-T si introducerea lui in tulpina de Agrobacterium; Incubarea vectorului binar cu tulpina de Agrobacterium ce poarta plasmidul Ti dezarmat pentru ca zona poli-linker sa inlocuiasca ADNT; Incubarea 2-8 zile a celulelor vegetale in prezenta tulpinii Agrobacterium transformate (trebuie sa existe compatibilitate intre genomul bacteriei si genomul speciei in care se intentioneaza transferul genelor); Selectia celulelor vegetale transformate de exemplu prin cultivare pe medii cu doua antibiotice (unul pentru eliminarea bacteriei, altul pentru eliminarea celulelor netransformate); Regenerarea plantelor transgenice (direct sau via calus) Utilizarea virusurilor ca vectori Virusurile fitopatogene sunt ribovirusuri (75%) sau dezoxiribovirusuri (25%) si se transmit prin intermediul insectelor sau la nivelul unor leziuni ale plantei. Avantaje: Infectia sistemica a plantei de catre virus determina formarea unui numar mare de copii ale genelor clonate in celula vegetala Nu mai e necesara regenerarea plantelor transgenice din celule transformate, deoarece este infectata toata planta. Dezavantaje:

Ribovirusurile (care predomina) nu pot fi folositi direct ca vectori (genomul celulei vegetale este prin excelenta format din ADN), ci dupa ce sunt reverstranscrise in sonde ADN.; Virusurile fitopatogene au o mare specificitate de gazda; Genele transferate nu se mentin stabil in genomul gazdei, nu se transmit la descendenti; Virusurile nu pot transfera fragmente prea mari de ADN. Tehnici de transfer direct al genelor in celulele vegetale Transformarea protoplastilor vegetali proaspat izolati cu ADN plasmidial (110mg/ml) in prezenta de PEG 25%, a ionilor de Ca2+ si Mg2+ si la pH optim de 6.0-6.5 Electroporarea protoplastilor cu impulsuri electrice (200-600V/cm2) care creaza pori prin membrana acestora prin care patrunde ADN plasmidial ce este incubat impreuna cu cultura de protoplasti; Tehnici de transfer direct al genelor in celulele vegetale Metoda biolistica (gene gun) utilizeaza dispozitive ce functioneaza cu heliu sub presiune (BiolisticPDS-1000, comercializat de Bio-Rad Laboratories) sau prin descarcare electrica (tehnologia ACCELL). ADN plasmidial este precipitat (adsorbit) pe microparticule (de teflon, nylon, tungsten, radiu, iridiu, paladiu, platina sau aur) inerte din punct de vedere chimic, ce sunt accelerate si bombardeaza ca niste microproiectile membrana celulara, o perforeaza si patrund in celula vegetala.

Confirmarea unui soi transgenic se face prin: 1. Teste de laborator: Decelarea transgenei in genom prin tehnici de genetica moleculara: PCR (polymerase chain reaction), electroforeza (genomica);

Determinarea numarului de copii ale transgenei/genom (prin hibridizare moleculara Southern blotting); Gradul de exprimare a transgenei prin hibridizare Northern blotting (transcriptomica); Detectarea si cuantificarea proteinei codificate de transgena respectiva prin hibridizare Western blotting (proteomica); Evidentierea activitatilor celulare a proteinei transgenice prin teste biochimice, biologice, biofizice (metabolomica). 2. Teste in sera sau camera climatica Selectionarea liniilor transformate si studierea lor in conditii controlate; Stabilirea modului de segregare = transmiterea la descendenta a caracterelor transgenice (mendeliana sau nemendeliana). 3. Teste in camp Evaluarea potentialului comercial al liniilor selectionate se face timp de mai multi ani, in locatii diferite, comparativ cu soiul martor (netransformat) pentru a putea inregistra noul soi, conform legislatiei nationale sau internationale (in Romania la institutul de Stat pentru Testarea si Inregistrarea Soiurilor)