Universitatea Politehnica Bucuresti Ingineria Sistemelor Biotehnice

Contaminarea alimentelor cu micotoxine

Gheorghisor Marius- Eugen Grupa: 746

Micotoxine
Micotoxinele sunt metabolii toxici produi de cteva tulpini de fungi care se gsesc pe alimente de uz uman i de uz animal. Acestea sunt de obicei invizibile, insipide i stabile din punct de vedere chimic la temperaturi ridicate i n timpul perioadelor lungi de depozitare. Toxicitatea lor este destul de mare si astfel cantitati foarte mici pot influenta starea de sanatate a organismului. Aproape toate micotoxinele sunt citotoxice si pot produce spargerea membranelor celulare si sa impiedice sau sa influenteze sinteza ADN, ARN si a proteinelor. Termenul micotoxine a fost dat in 1961 dupa ce langa Londra (Anglia) aproximativ 100000 de curcani au murit datorita unei boli misterioase numita boala X a curcanilor. Ulterior s-a descoperit ca cei 100000 de curcani au murit datorita arahidelor cu care acestia au fost hraniti. Arahidele erau contaminate cu metaboliti secundari ai Aspergillus flavus (aflatoxine). Perioada 1961-1975 a fost denumita perioada de glorie a micotoxicologiei datorita fondurilor mari de care dispuneau oamenii de stiinta pentru descoperirea acestor toxine ascunse. Termenul de micotoxin deriv din grecescul mykes care nseamn fungi si din latinescul toxicum care nseamn toxin, otrav. Termenul de micotoxin din punct de vedere literal nseamn toxin fungic sau otrav fungic, o substant toxic produs de fungi si mucegaiuri, ca un opus al unei substante care este toxic pentru mucegaiuri cum este fitotoxina, ce implic toxicitate pentru plante, zootoxina este toxic pentru animale. Micotoxinele pot ptrunde n alimente pe dou ci: - prin contaminare direct - prin contaminare indirect. Contaminarea direct este atunci cnd mucegaiul crete direct pe substrat i micotoxina se produce chiar pe substrat. Multe substraturi sunt susceptibile la creterea mucegaiurilor pe durata unor etape de producie, procesare, depozitare sau transport de aceea au potenial de contaminare direct. Mucegaiurile cresc pe alimente n timpul depozitrii ca de exemplu pe: brnzeturi maturate. Contaminarea direct a produselor lactate cu micotoxine poate rezulta din cresterea mucegaiului utilizat n scopul fermentrii sau din cresterea accidental a acestuia. Matrite care sunt cultivate n mod intentionat pe brnzeturi ca si culturi starter, precum specii de Penicillum pe brnzeturile franceze Roquefort si Camenbert chiar si n conditii sigure de cultivare acesti fungi sunt capabili s produc micotoxine (si asta datorit contaminrii n mod accidental din mediul inconjurator).

Contaminarea indirect a alimentelor apare atunci cnd se folosesc ingrediente deja contaminate n obinerea alimentelor, de exemplu obinerea brnzei, iaurtului, smntnii din lapte. Acestea pot fi folosite mai departe ca ingrediente petru alte alimente ex: brnz topit, cascaval, unt. Produsele procesate sunt cele mai implicate n contaminarea indirect i expunerea la micotoxine. Expunerea indirect la micotoxine poate rezulta i din consumul de produse de origine animal ca laptele. Laptele poate fi contaminat cu aflatoxina M1 i M2 ca rezultat al hrnirii animalelor cu hran contaminat. Contaminarea indirect cu micotoxine se realizeaz i prin consumul de furaje contaminate cu mucegaiuri, care produc astfel de substane toxice (mai ales Aspergillus). Cea mai periculoas micotoxin este aflatoxina, care se elimin n lapte chiar n primele zile dup consumarea furajelor mucegite. In prezent aproximativ 300-400 de substante au fost catalogate ca micotoxine dar doar 20-30 de micotoxine sunt supravegheate de catre autoritati, acestea fiind considerate cele mai toxice si cele mai raspandite. Cele mai monitorizate micotoxine 3-acetildeoxinivalenol (3-AcDON) 15-acetilDeoxinivalenol (15-AcDON) Aflatoxina B1 Aflatoxina B2 Aflatoxina G1 Aflatoxina G2 Aflatoxina M1 Deoxinivalenol (DON) Diacetoxiscirpenol Ergocristina Ergocriptina Ergometrina Ergotamina Citrinina Fumonisina B1 Fumonisina B2 Fumonisina B3 Fusarenona-X (FUSX) Neosolaniol Nivalenol (NIV) Ochratoxina A (OTA) Patulina Toxina T-2 Toxina HT-2 T2-triol Verrucol Zearalenona (ZON)

Ergocornina Monoacetoxyscirpenol In general, micotoxinele intra in organism prin intermediul alimentelor contaminate dar mai pot intra si pe calea aerului sau prin contact direct cu pielea. Majoritatea micotoxinelor sunt rezistente la temperaturi ridicate (coacere, fierbere si in unele cazuri rezista si la prajire). Multe toxine rezista si la procesarea industriala a alimentelor de aceea pentru a avea alimente libere de micotoxine trebuie analizata materia prima (grau, lapte, legume, carne etc).

Din cauza faptului ca sunt rezistente la procesare acestea pot fi gasite in paine, cerealele de la micul dejun, vin, bere etc. Prin procesare doar se poate reduce cantitatea de micotoxine nu si eliminarea totala a acestora. In tabelul de mai jos puteti vedea in ce alimente s-au gasit micotoxine si ce micotoxine sunt prezente in alimente Contaminarea produselor alimentare cu micotoxine Produse contaminate Fasole Grau Porumb Orz Secara Ovaz Orez Secara Sorg Produse derivate din alimentele de mai sus Bere Vin Cafea Cacao Fructe deshidratate Carne Lapte Oua * * * * * * * * * Principalele micotoxine gasite in alimente Ochratoxina Fumonisine Zearalenona Deoxinivalenol * * * * * * * * * * *

* * * * *

* * * *

Micotoxinele se pot dezvolta in timpul cultivarii, transportului, depozitarii sau in alte momente pe parcursul productiei. Rezultatul final este ca acestea sunt gasite in foarte multe alimente (in special cele bazate pe cereale). Se considera ca micotoxinele prezinta risc alimentar mai mare decat aditivii, contaminantii sintetici si pesticidele. Mucegaiurile producatoare de micotoxine sunt foarte comune si pot creste pe foarte multe substraturi nutritive si in conditii climatice variate. In agricultura contaminarea recoltelor variaza de la an la an in functie de clima si alti factori de mediu. De exemplu aflatoxina este de obicei in cantitate mai mare in anii de seceta pentru ca atunci plantele sunt slabite si pot fi mai usor atacate de boli si daunatori. Se estimeaza ca un sfert din culturile, prezente la nivel mondial, sunt, intr-o oarecare masura,contaminate cu micotoxine. Consecintele economice al contaminarii cu micotoxine sunt grave. Recoltele cu cantitati mari de micotoxine sunt distruse sau aceste sunt folosite ca furaje pentru animale ceea ce poate duce la o dezvoltare slaba a animalelor sau chiar la deces. Daca recoltele folosite pentru furaje sunt contaminate atunci produse ca laptele si carnea vor contine toxine sau produsi de biotransformare. De exemplu vitele transforma aflatoxina in aflatoxina M1 ce este apoi secretata in lapte. In cazul porcinelor ochratoxina prezenta in hrana se acumuleaza in carnea acestora.

Diagnostic
Un diagnostic precis este greu de dat datorita faptului ca este greu sa dovedesti ca boala respectiva este o micotoxicoza. Mucegaiurile pot exista fara sa produca micotoxine si deci daca demonstram contaminarea cu mucegai nu inseamna ca acesta este responsabil pentru starea de sanatate a pacientului. Chiar daca se descopera micotoxine in organismul bolnav nu se poate sti precis daca acea micotoxina este cea care a cauzat boala. Si mai interesant este faptul ca 1 gram din micotoxina A este mult mai putin periculos decat 0.1 grame din A + 0.1 grame din B. Acest fenomen se numeste sinergism si anume intensificarea actiunii a doua substante prin asocierea acestora. Datorita acestui fenomen este si mai greu sa diagnostichezi boala ca fiind micotoxicoza datorita faptului ca in organismul respectiv exista cantitati foarte mici de toxine. Pentru a da un diagnostic corect este necesara coroborarea datelor clinice, radiologice, microbiologice si histopatologice pentru ca separat aceste date nu pot furniza datele necesare diagnosticarii corecte. Simptome sau efecte ale micotoxinelor asupra organismului Aceste simptome sunt simptome generale ale contaminarii cu diferite micotoxine si nu prezinta simptomele date de contaminarea cu mai multe micotoxine, aici putand sa apara si alte simptome datorita sinergismului.

Efecte asupra sistemului vascular -fragilitatea crescuta a vaselor de sange - hemoragie interna mucoase, plamani Efecte asupra sistemului digestiv - voma - hemoragie intestinala - necroza ficatului - distrugerea mucoaselor Efecte asupra sistemului respirator - respiratie greoaie - sangerarea plamanilor Efecte asupra sistemului nervos - tremuraturi - depresie - dureri de cap - lipsa coordonarii Efecte asupra pielii - iritatii - senzatie de arsura la nivelul pielii - fotosensibilitate Efecte asupra sistemului reproducator si excretor - infertilitate - nefrotoxicitate Efecte asupra sistemului imunitar - distrugerea capacitatii de aparare a organismului si deci facilitarea infectarii cu alte microorganisme Micotoxinele produc pagube importante i n zootehnie. Organizaia pentru Alimente i Agricultur (FAO) estimeaz c pe plan mondial pn la 25 % din culturile alimentare sunt semnificativ contaminate cu micotoxine. Cele mai importante micotoxine care prezint riscuri semnificative pentru sntatea omului sunt sintetizate de mucegaiurile care cresc pe cereale, n special porumb, dar i gru, orz, ovz i orez. Consecinele consumului de alimente contaminate cu aflatoxin asupra sntii omului sunt estimate indirect pe baza efectului observat la animale. Susceptibilitatea omului la aflatoxin nu este foarte bine cunoscut datorit raritii cazurilor. Date cu privire la doza de risc pentru oameni au fost obinute cu ocazia unor intoxicaii colective izbucnite, una n India n 1974 n cursul creia au fost afectate aproape 400 de persoane din care o treime au murit i alta n Kenia n 1982, unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12. Investigaiile din care aceste focare de aflatoxicoz au dus la concluzia c ele s-au datorat ingestiei repetate a unei cantiti de 38-55 micrograme de

aflatoxin/kg corp mai multe zile la rnd. Cercetrile fcute de veterinari americani, sugereaz c unii aditivi alimentari cum este BHT (butilhidroxitoluen, sau E 321) ar putea fi folosii n viitor ca msur de protecie fa de efectele nedorite ale alimentelor contaminate cu aflatoxin. Vivacitatea i viteza de rspndire n condiiile naturale este uimitoare. De exemplu: dintr-un spor de Penicillium aflat pe un mediu nutritiv, must de mal cu agar, dup a doua zi de la germinarea acestuia s-au format 100.000 spori i n urmtoarele 24 ore nc 2 spori. Pe un bob de gru mucegit cu Penicillium verrucosum var. Cyclopium s-au numrat 25 milioane spori. O portocal mucegit este purttoare a aproximativ 15 miliarde de spori.

Unde se formeaz micotoxinele

Exist n momentul de fa circa 300-400 micotoxine (intervalul este dat de diferii autori, aparinnd la 24 de grupe chimice de toxine care pot aprea n condiii din cele mai diferite n produciile agricole i n diferitele alimente obinute din acestea). n cazul cerealelor i porumbului sunt cunoscute urmtoarele toxine foarte periculoase: 1. Fumonisin b1 (FB1) produs de Fusarium Verticiloides i Fusarium proliferatum (prezente mai ales la porumb, dar i de speciile Fusarium napiforme, 2. Fusarium anthophilum, Fusarium diamini i Fusarium nygami, prezente mai ales n Canada, SUA, Africa de Sud, Nepal, Australia, Tailanda, Filipine, Indonezia, Mexic, Frana, Italia, Polonia i Spania. 3. Deoxynivalenol, produs ndeosebi de Fusarium graminearum i care este foarte prezent n spaiul romnesc, ndeosebi la gru i triticale i foarte rar pe secar i orz. Foarte frecvente i periculos de abundente sunt aceste micotoxine n grul dur (Triticum durum). Distributia micotoxinelor n diferite zone ale globului se caracterizeaz prin urmtoarele: n regiunile reci domin aflatoxinele (excepie fac produsele de import provenite din rile calde) dar foarte importante sunt: vomitoxina, zearalenona, ochratoxina, DAS, toxina T-2 i toxina HT-2; n sudul i centrul Europei, unde se cultiv porumb, domin fusariotoxinele (vomitoxina, zearelona, toxina T-2); n nordul Europei pe primul loc se afla ochratoxina A; n regiunile calde i umede mai rspndite sunt aflatoxinele.

Sensibilitatea animalelor la micotoxine

Intoxicrile produse oamenilor i animalelor cu micotoxine sunt denumite micotoxicoze. Ele apar cu o frecven destul de mare i la fel de frecvent nu sunt recunoscute.

Declanarea bolii poate aprea sezonal fiind influenat de condiiile de clim care favorizeaz formarea micotoxinelor. n asemenea situaii, crete mult frecvena micotoxinelor. Nu se definete, ntotdeauna, o relaie clar cu sursa de furaj contaminat. Intoxicrile acute sunt date, totui, de concentraiile ridicate de micotoxine n furaje. Intoxicarea chiar i cronic este greu de diagnosticat, pentru c nu exist parametri de msurare a bolii. Cel mai frecvent apar indicii privind reducerea productivitii animalelor fr un motiv anume. Pot aprea diaree sau pneumonii inexplicabile. Nediagnosticarea corect poate conduce la tratamente false i se pot finaliza prin moartea animalului. Speciile de animale au o sensibilitate diferit la diferite categorii de micotoxine. Zearalenonul are o structur estrogenic, aparinnd grupei fitoestrogenilor. Simptomele induse la porc se caracterizeaz prin agitaie, diaree i temperaturi, mortalitate ridicat la purcei. Intoxicarea are loc la o concentraie ntre 50 i 200 g/kg furaj administrat (5-20 ppm). Puii par a fi puin mai rezisteni. La rumegtoarele adulte (vite i oi), datorit tubului digestiv prevzut cu prestomac (rumen), att zearalenonul ct i celelalte micotoxine (Deoxynivalenol, Ochratoxin A), datorit faptului c n stomac se ntlnesc cu microorganisme diverse (bacterii, protozoare), pot fi degradate i fcute inofensive, dac concentraiile nu sunt prea mari.

Relaia dintre pesticide i micotoxine

n linii generale, relaia este una invers, adic exist o corelaie pozitiv ntre calitatea i mai ales modalitile de aplicare a pesticidelor specifice i cantitatea de micotoxine n infeciile la culturile de cmp. Aceste corelaii sunt n curs de elaborare pe diferite meridiane ale globului, n ciuda unor autoriti care persist n a spune c micotoxinele nu reprezint un pericol. Produsele chimice care combat fusariozele i alte ciuperci care produc micotoxine, ar trebui aplicate la acel moment la ciupercile parazite care nu au nceput s produc toxicul. Fungicidul devine favorizant al acumulrii acesteia n bob, deoarece blocheaz extinderea ciupercii, dar favorizeaz migrarea micotoxinei spre bob prin meninerea verde a furajului. Mucegaiurile i micotoxinele creeaz probleme de natur economic n agricultur, cresctorilor de psri i animale i pierderi n industria alimentar. Se estimeaz c pe plan mondial aceste pierderi sunt de peste 5-10 %. Ca toate substanele toxice, ele produc doua tipuri de intoxicaii: -acute, care se produc prin ingestia unei doze relativ mari de micotoxine sau n cantiti mai mici ntr-un interval scurt de timp; -cronice, care se produc pe termen lung, iar intoxicaia se manifest dupa consumarea unor doze mici un timp indelungat i repetat. Aceste intoxicaii provoac tulburri la nivelul diferitelor organe i sisteme: ficat, rinichi, cnetri

nervoi, circulaia sanguin sau la nivelul tractului digestiv.

Factori care favorizeaz contaminarea cu mucegaiuri

Factorii care favorizeaz contaminarea produselor agro-alimentare cu mucegaiuri sunt: starea produsului, temperatura, oxigenul din aer, natura substratului i cantitatea de ap. a) Integritatea boabelor i a nveliului produselor vegetale. Asigur calitatea produselor n timpul conservrii i mai dificil atacul mucegaiurilor. b) Temperatura. Temperatura de 20...30 C reprezint o zon optim de cretere la care mucegaiurile pot s se dezvolte intr-o gam foarte larg. Exist i unele excepii : Aspergillus flavus se poate dezvolta i la temperaturi de 36...38 C i poate forma la 25 C aflatoxine. Penicillium verrucosum se poate dezvolta i poate produce toxine la 4 C. Fusarium produce toxina T2 la 4...8 C. Mucegaiurile sunt n general aerobe, iar creterea cantitii de CO2 limiteaz dezvoltarea. c) Natura substratului. n general, substratul optim este cel glucidic. Aflatoxina este secretat n special pe amidon, iar zearenona se formeaz pe un substrat celulozic. Micotoxinele pot aparea in produsele agricole in cursul prelucrarii sub forma de uleiuri, unturi, snacksuri, produse de panificatie, produse de patiserie etc. prin macinare, morarit. Micotoxinele se formeaza in conditii specifice in urma depozitarii furajelor si cerearelor. Factorii care determina dezvoltarea micotoxinelor sunt: umiditatea, temperatura si pH-ul mediului, durata depozitarii, modul de conservare. In studii s-a demonstrat ca micotoxinele se dezvolta la o umiditate de A17.5, la o temperatura optima intre 25-30o grade Celsius, si un pH usor acid (intre 4.5-6).

Pregatirea preliminara a probelor

Micotoxinele prezinta un real pericol atat pentru animale cat si pentru om, si este obligatoriu ca manipularea probelor sa se faca cu grija si sa se lucreze in conditii care sa impiedice contaminarea materialelor si a atmosferei. In plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substante sunt ele insusi toxice: este exemplul lui Aspergillus flavus si Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei tipuri de simptome la om: infectie, alergie si toxicoza. Infectia reprezinta o invazie a tesuturilor vii in timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigena fungica. Toxicozele sunt maladii rezultate in urma expunerii, in general prin ingerare, prin inhalare sau prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie sa se insiste asupra faptului ca atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa fie maxima. Personalul din laborator trebuie sa fie familiarizat cu reglementarile privind securitatea. Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat si trebuie sa

se realizeze un set complet de analize la sange. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie sa cuprinda trei puncte: 1.identificarea sursei periculoase si a efectelor posibile asupra sanatatii in cazul nefolosirii echipamentului adecvat;. 2. punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor si microorganismelor; 3. intelegerea sensului responsabilitatii pentru a permite aplicarea masurilor de securitate

Manipularea mucegaiurilor
Culturile trebuie sa fie pastrate in eprubete, placi Petri. Pentru manipularea esantioanelor se recomanda sa se lucreze in cabine securizate biologic. Pentru protectie, personalul trebuie sa poarte in permanenta sort, manusi si masca.

Manipularea produselor mucegaite

Produsele mucegaite nu trebuie sa fie manipulate niciodata fara manusi si analizele se vor face inasa fel incat sa se evite pe cat posibil inhalarea particulelor toxice.

Analiza esantioanelor test

Securitatea manipularii este foarte importanta in timpul acestei operatii. Este primordiala minimizarea contaminarii atmosferice cu vapori toxici si particule de praf. Contactul direct cu toxinele pure sau in solutie trebuie sa fie evitat prin folosirea echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafetele de lucru ca si echipamentele folosite in timpul extractiei trebuie sa fie obligatoriu decontaminate dupa utilizare.

Hranirea animalelor cu alimente contaminate

Cand animalele de laborator sunt hranite cu alimente care contin toxine trebuie sa se poarte in orice moment echipamentul de protectie. Alimentele trebuie sa fie corect etichetate si depozitate cu grija pentru a evita confuziile.

Decontaminarea laboratorului
Sticlaria de laborator si suprafetele care au intrat in contact cu toxinele sunt spalate cu NaClO 0,5%. Carcasele in care au fost tinute animalele de laborator sunt incinerate.

Esantionarea
Studii au aratat ca peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datoreaza esantionarii necorespunzatoare; trebuie deci sa ne asiguram ca esantioanele prelevate pentru a fi analizate sunt reprezentative. Este important deci sa se prezinte un plan de esantionare care sa faca parte din reglementarile privind controlul contaminarii cu micotoxine. In ultimii ani, o atentie deosebita a fost acordata ameliorarii si asigurarii calitatii analizelor facute pentru identificarea contaminantilor din produsele din alimentatia umana si animala. Pentru stabilirea normelor comerciale, contaminantii trebuie sa fie corect identificati si

cantitatile determinate sa fie scazute. Micotoxinele nu fac exceptie de la aceste reguli si analiza lor prezinta dificultati particulare in ceea ce priveste obtinerea esantioanelor reprezentative iar analiza trebuie sa permita identificarea nivelurilor scazute de micotoxine (sub 500 ppm). Esantionarea constitue o etapa cruciala in determinarea continutului de micotoxine dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxina nu este proportionala cu cantitatea de mucegaiuri prezenta, sunt foarte rar distribuite uniform in esantion. Contrar metodelor analitice, sistemele de esantionare nu pot face obiectul incercarilor interlaboratoriale si in general, un plan de esantionare este propus pe baza unui studiu statistic al repartitiei toxinelor masurate, apoi el este adoptat in mod oficial. Publicatia colectiva a UNDP si FAO a definit clar procedurile de esantionare pentru diferite micotoxine. Se tine cont de tipul produsului si de dimensiunea lotului. In fiecare caz, numarul minim de subesantioane prelevate este precizat, ca si dimensiunea unitara minima a fiecaruia dintre ele. In plus, cantitatea subesantionului prelevat pentru analiza si modul in care este prelevat sunt specificate. Comisia europeana a editat o directiva in care se specifica metodele analitice de esantionare pentru controlul oficial la nivelul anumitor contaminanti in produsele alimentare. Procedura de esantionare poate fi rezumata intr-o secventa de sapte etape.

Etapele esantionarii
Scopul esantionarii Identificarea punctelor de esantionare Identificarea loturilor Alegerea metodei de esantionare Prelevarea esantioanelor Prepararea esantionului Conditionarea esantionului Inainte de toate, trebuie sa se determine cu precizie scopul esantionarii si apoi se identifica punctele de esantionare. Modul de esantionare difera in functie de modul in care produsele sunt depozitate in vrac sau in ambalaje (saci, cutii metalice, butelii). Odata ce modul de conditionare a fost determinat, trebuie sa se localizeze cu precizie, punctele de esantionare. A treia etapa consta in identificarea loturilor care trebuie sa fie reprezentativa pentru sistemul analizat. Nu trebuie omisa metoda de esantionare care trebuie sa fie cat mai apropiata de analiza noastra, se disting trei tipuri de metode: Esantionare uniforma In acest caz, se preleveaza o cantitate mica de proba din fiecare portie. In acest tip de esantionare, cantitatea prelevata este testata. Esantioanele trebuie sa fie deci reduse; aceasta procedura este numita divizare si este realizata de un divizor care preleveaza o fractiune identica din fiecare esantion in parte. Esantionare selectiva Acest tip de esantionare presupune prelevarea partilor cele mai susceptibile a fi contaminate din lot. Aceasta tehnica se aplica de exemplu in cazul unui lot de cereale

unde investigatia se va face doar pe granele care prezinta un stadiu avansat de mucegaire. Esantionare aleatorie Acest tip de esantionare se efectueaza in cazul in care e nevoie de multe esantioane, de calitate diferita, care provin dintr-un lot neuniform. La aceasta tehnica, numarul esantioanelor, cantitatile lor totale si perioada de prelevare nu sunt determinate inainte de esantionare. Esantionarea strict aleatorie este complicata, si se face apel la tehnicile complexe de prelevare aleatorie. Prelevarea esantionului reprezentativ pentru lot este urmatoarea etapa a esantionarii. Cea de-a sasea etapa consta in prepararea esantionului, mai bine spus, separarea esantionului de impuritatile de dimensiuni mari pe care le contine. Ultima etapa presupune conditionarea esantionului in vederea determinarilor. In mod frecvent, esantioanele reprezentative cantaresc intre 3 si douazeci kilograme.

Variante de esantionare, de pregatire a esantionului si analitice

Se poate spune ca etapa de esantionare este de obicei sursa cea mai mare de erori in secventa analitica, mai bine spus in secventa de esantionare, prepararea esantionului si analizei. Varianta( ), exprimata de reprezentativitatea esantionului trebuie sa fie cat se poate de scazuta, sau cel mult egala cu suma variantelor de esantionare (Ss2), de preparare a esantionului (Ssp2) si de analiza (Sa2): St - Ss + SSp + Sa Determinarea acestor variante se poate face in maniera empirica plecand de la formule stabilite in prealabil. De exemplu, in cazul arahidelor, Whitaker si colaboratorii saiau stabilit urmatoarele relatii: Ss2= (49,0546*MLU955 - 0,39 ML1,7867) /Ws Unde Ss este varianta esantionarii ML este concentratia in aflatoxina in lot in ppb Ws este masa de arahide in esantion in kg 2 Ssp = (0,978 MS1J867-0,0178 Ms1'9339)/Wsp Unde Ssp2 este varianta de preparare a esantionului Ms este concentratia in aflatoxine in esantion in ppb Wsp este masa de arahide macinata in subesantion in kg 2 Sa = (l/na)*(0,00482 MSS1J518) Unde Sa2 este varianta analitica pentru analiza HPLC na- este numarul de analize repetate Mss este concentratia de aflatoxina in subesantion in ppb.

Conceptul si evaluarea unui plan de esantionare

Factorii urmatori sunt esentiali in stabilirea unui plan de esantionare: - tipul de marfa - concentratia maxima in toxine permisa in lot

concentratia maxima permisa in esantion (concentratia critica) dimensiunea esantionului numarul subesantioanelor; numarul esantioanelor; metoda de obtinere a esantionului; metoda analitica;

Trebuie sa se stie ca exista doua tipuri de riscuri legate de planul de esantionare: riscul producatorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, si cel al consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. Dupa determinarea partii relative a fiecaruia dintre cele doua riscuri se poate construi o curba unica numita curba caracteristica de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe abscisa are reprezentata probabilitatea [P(M)] ca planul de esantionare sa accepte un lot in functie de concentratia in aflatoxina M in lot. Forma acestei curbe va fi influentata de urmatorii parametri: concentratia critica permisa in esantion; marimea esantionului; marimea subesantionului si gradul de fragmentare; metoda analitica (tipul si numarul analizelor). Probabilitatea ca un lot sa fe acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X<Xc/M) Unde X este concentratia in toxina a esantionului Xc este concentratia critica a esantionului M este concentratia in aflatoxina a lotului. Pentru analiza micotoxinelor, se vor prelua cate 4 esantioane identice cantitativ: - primul pentru analiza propriu-zisa; - doua pentru eventualele analize complementare; - ultima este pastrata ca referinta Dupa principiul Gafta Rules, daca cantitatea de micotoxina gasita in prima proba este mai mare de 50% fata de limita autorizata, cea de-a doua analiza va fi efectuata pe cel deal doilea esantion. Daca rezultatele furnizate de aceasta data sunt inferioare limitelor, atunci, lotul va fi acceptat. Daca ce-a de a doua analiza prezinta valori mai mari decat normele tolerate dar inferioare primei probe, se va realiza o noua analiza pe cel de al treilea esantion. Daca rezultatele celei de a treia analiza sunt conforme cu normele in vigoare, lotul este acceptat, daca nu este respins. Metodele care permit evidentierea micotoxinelor in produsele alimentare sunt scindate in doua categorii calitative si cantitative mentionand in egala masura si testele kit' care permit analiza pe teren si furnizeaza date referitoare la prezenta sau absenta contaminantilor, dar trebuie sa fie confirmata de o analiza complementara de laborator. Cele din urma, reprezinta un protocol recunoscut si normalizat de AOAC (Association of Official Analytical Chemist). Totusi, inainte de a fi normalizat, un protocol de

analiza propus de un laborator trebuie sa fie validat prin teste iterlaboratoriale, organizate dupa normele ISO 43. Diferitele metode de referinta se pot clasa dupa principiul lor fundamnental de functionare in tehnici fizico-chimice sau imunochimice; totusi noi le vom imparti in functie de performanta lor, in tehnici calitative: minicoloanele, coloanele de imunoafinitate, testul ELISA (poate fi considerat si test cantitativ); si tehnici calitative: cromatografie in strat subtire (TLC), cromatografie gazoasa (CG) si cromatografie lichida de inalta rezolutie (HPLC).

Metode calitative
In aceasta sectiune vom trata metodele care in general sunt folosite ca metode rapide de detectie a micotoxinelor. Aceste metode sunt folosite ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor. Dupa cum stim, metodele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a determina concentratia molara a solutiei. Pentru interpretarea corecta a masurilor realizate, ne vom folosi de doua legi care descriu absorbtia luminii de materie: Legea lui Lambert: A = log Legea lui Beer : A=Cd Unde: A = absorbanta sau densitatea optica a solutiei; I = intensitatea luminii emise Io = intensitatea luminii transmise C = concentratia substantei absorbante = coeficeintul de extinctie al substantei absorbante In practica, in cazul unui spectofotometru UV cu un fascicol, scala absorbantei este adusa la zero cu un solvant folosit ca martor. Celula care contine solutia de analizat este apoi plasata in spectrofotometru si citirea poate incepe. Fiecare micotoxina are o valoare a absorbantei bine specificata. Parametri spectrofotometrici pentru diferite micotoxine Micotoxina Masa Solvant moleculara Aflatoxina B 312 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v Aflatoxina Bl 312 Chloroform Aflatoxina B2 314 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v Aflatoxina Gl 328 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v Aflatoxina 62 330 Benzen .acetonitri! (98 :2) v/v Aflatoxina Ml 328 Chloroform

Absorbanta max (nm) 353 353 355 355 357 357

Ochratoxina A Ochratoxina B Ochratoxina A etil ester Ochratoxina B etil ester Patulina Patulina Sterigmatocistina Citrinina Zearalenona Zearalenona Zearalenona

403 369 431 397 154 154 324 259 318 318 318

Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Benzen :acid acetic (99 :1) v/v Etanol absolut Metanol Benzen Chloroform Etanol Etanol Etanol

333 320 333 320 276 275 325 322 236 274 316

Metode imunologice
Testele imunologice constituie astazi metodele rapide de detectie a aflatoxinelor si a altor micotoxine in alimente. Anticorpii policloni si monocloni folositi sunt agentii de legatura folositi. Se stie ca micotoxinele sunt molecule non antigene cu masa moleculara mica, anticorpii policloni sunt produsi indirect prin raspunsul imunitar al animalelor la un complex micotoxina-proteina. Raportul molecular micotoxinaproteina este foarte important pentru intensitatea raspunsului imunitar. Pozitia si tipul de legatura intre toxina si proteina sunt de asemenea critice. Anticorpii monocloni sunt secretati prin fusiunea celulelor in splina soarecilor si legarea celulelor miceliene datorita polietilen glicolului. Imunogeneza este administrata prin injectari repetate de cantitati mici de proteina (40-300 g). Recunoasterea imunologica este bazata pe complementarismul spatial al grupelor specifice al antigenelor cu cei doi anticorpi. Anticorpii sunt reactivul cheie in testul immunologic si trebuie sa fie obligatoriu corect preparat si caracterizat. Caracteristicile utile pentru selectionarea unui anticorp convenabil sunt: constanta de afinitate, specificitatea si randamentul. Se cunosc trei tipuri de teste imunologice : Testele RIA (radioimmunoassays), testele ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), si testele pe coloana de imunoafinitate. In ultima categorie sunt incluse minicoloanele sau coloanele de imunoafinitate.

Testele RIA
In testele RIA, aflatoxina este marcata din punct de vedere al radioactivitatii. Aflatoxina nemarcata sau aflatoxina in solutie test si aflatoxina marcata intra in competitie pentru numarul limita de legaturi la anticorpi. Cantitatea de aflatoxina in esantion este invers proportionala cu cantitatea de aflatoxina marcata in

solutie. Avantajul acestor teste este acela ca necesita o cantitate scazuta de anticorpi. Prezinta totusi si dezavantaje in ceea ce priveste radioactivitatea, folosirea marcajelor izotopice.

Testele ELISA
Doua formate principale ale testelor ELISA sunt dezvoltate: testele competitive si testele non-competitive. In testul ELISA tipic, legatura unui complex micotoxinaenzima cu anticorpi imobilizati este inhibata prin prezenta micotoxinei in solutia test. Enzimele legate, catalizeaza transformarea substratului intr-un complex colorat. Intensitatea culorii este invers proportionala cu concentratia de aflatoxine. Peroxidaza care catalizeaza oxidarea substratului tetrametilbenzidina intr-un complex bleu este enzima de marcaj cel mai des intalnita. Metoda ELISA este frecvent intalnita in cazul laboratoarelor centrale unde sunt frecvent realizate numeroase teste. Pentru o viziune rapida si tot odata detaliata a variantelor metodei, este prezentat tabelul 2.12. Principiul metodei ELISA Testul se bazeaza pe reactia antigen - anticorp. Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu anticorpi captura, directionati impotriva anticorpilor anti - micotoxina. In fiecare godeu, atat pentru standard, cat si pentru proba, se adauga conjugatul enzimatic si anticorpii anti - micotoxina. Micotoxina libera si conjugatul enzimatic concureaza pentru siturile de legare ale anticorpilor de acoperire ai godeurilor (metoda imunoenzimatica competitiva). Conjugatul enzimatic nelegat este indepartat in faza de spalare. Se adauga substrat/cromogen, observandu-se virarea culorii de la rosu la albastru. Adaugarea reactivului de stopare al reactiei determina modificarea culorii albastre in galben. Citirea probelor se realizeaza la 450 nm. Absorbanta este invers proportionala cu concentratia micotoxinei din proba. Aplicatii ale metodei ELISA in determinarea micotoxinelor in alimentatie. Toxina Modul de extractie Spalare Limita Esantion de detectie 0/g/kg) Aflatoxina B1 Metanol :apa 55 :45 (v/v) Fragmentare 2,9 Alune Unt de esantion :solvant 1 :5 in CHCI3, alune (v/w) evaporare, rediluare in tampon salin de fosfat (PBS)

Evaporare si 5 descompunere in PBS Aflatoxina Bl Concentrare 0,1 prin evaporare, diluare cu PBS Aflatoxina Bl Metanol :apa 55 :45 (v/v) Diluare cu un 5-10 tampon Ochratoxina CHCI3 Impartire in 2,5 esantion:solvant 1:5 (w/v) volume egale de NaHC03 Ochratoxina CHCl3 Impartire 0,5 esantion:solvant 1:5 (w/v) intre 1,4 x NaHC03 (30 g/l) in metanol:apa 4 :10 (v/v) Ochratoxina CHCI3 Evaporare si 0,06 esantion :solvant 1:5 descompunere (w/v) in PBS Ochratoxina Metanol Spalare pe 0,5-1 cartus C18 si impartire in solutie 1 M NaHC03 3Metanol :apa 6:4 (v/v) Diluare cu un 1 acetyldesoxynivaleol tampon Toxina T2 Cartus C18 0,2 Sep-Pak in faza inversa

Af latoxina Bl

CHCl3 esantion:solvant 1 :5 (w/v) Metanol :tampon salin fosfat 1 :1 (v/w)

Porumb

Arahide

Alune,porumb Grau

Rinichi de porc

Grau

Grau

Orez Serum, lapte, urina

Metode de imunoafinitate
Coloanele de imunoafinitate sunt preparate prin adsorbtie de anticorpi pe un suport inert (tuburi de microtitrare , membrane, bile de sticla). Micotoxinele sunt prelevate de solutiile test prin anticorpi imunospecifici. Dupa ce impuritatile din cartus au fost spalate, micotoxinele sunt desorbite in metanol si transferate pe coloana in faza inversa pentru a fi separate. Apoi determinarea se face cu UV. Folosirea coloanelor de imunoafinitate pentru prelevarea si concentrarea micotoxinelor prezinta mai multe avantaje: cresterea selectivitatii, posibilitatea prelevarii din volume mari si asocierea cu alte tehnici analitice. Aceasta tehnica prezinta de asemena avantajul de a fi foarte

rapida (10-15 minute) si nu presupune necesitatea unui personal calificat. Inconvenientul major al acestei tehnici este folosirea unei cantitati importante de anticorpi. Trebuie specificat faptul ca in cazul anumitor micotoxine ca aflatoxinele, o derivatie prealabila trebuie sa fie realizata pentru a putea folosi tehnica fluorimetrica cu lumina UV.

Minicoloanele
Aceasta metoda a fost inventata in 1976 in Tailanda. Aflatoxina este extrasa in metanol apos, urmata de o limpezire prin precipitare cu acetat de zinc sau sulfat de amoniu saturat. Aceasta ultima metoda permite mai ales reducerea continutului de specii interferate. Aflatoxina este apoi pusa in fluorisilul din minicoloana. Fluorescenta este apoi detectata cu ajutorul Luminii UV la 365 nm si comparata cu standardele. Metoda care face referire la calibrarea aflatoxinelor in cereale cu o limita de detectie de 20 ppb este metoda Holaday-Velasco numita si minicoloane HV. Aceasta metoda a fost acreditata in 1980 de Federal Grain Inspection Service. Coloana (25cm-6mm) este realizata din aluminiu, silicagel si din fluorisil. Sulfatul de sodiu sau calciul anhidru este de asemenea folosit pentru a inlatura toate urmele de umiditate. Metoda necesita o purificare prealabila a extractului, care se face de obicei printr-o simpla filtrare.

Coloane de imunopurificare
Spre deosebire de minicoloane care sunt de obicei folosite ca metode de calibrare, coloanele de imunoafinitate normale sunt mai degraba folosite in timpul unei purificari prealabile a esantionului inaintea dozarii cantitative prin HPLC, de exemplu. Imunopurificarea consta in purificarea aflatoxinelor sau ochratoxinelor plecand de la extractia unui esantion prin trecere pe coloane de imunoafinitate care contin un suport prevazut cu anticorpi dirijati in mod special impotriva micotoxinelor.

Metode cantitative Teste kit

Testele kit permit determinarea continutului de micotoxine in laboratoare nespecializate. Testele kit folosite functioneaza dupa doua metode: metoda cromatografiei in strat subtire si metoda imunologica. Avantajul folosirii testelor kit TLC este acela ca un singur test poate fi folosit pentru determinarea mai multor micotoxine. Testele kit bazate pe metodele imunologice au avantajul usurintei si rapiditatii metodei.

Cromatografie in strat subtire (TLC)

Cromatografia in strat subtire este o metoda folosita incepand cu anul 1990 pentru analiza aflatoxinelor. Pentru cromatografia in strat subtire limita de detectie pentru dozarea aflatoxinelor este de 2 ppb, iar cea pentru tricotecine limita este de 50 ppb. De

obicei, aceasta metoda este urmata de un test ELISA in cazul in care furnizeaza un raspuns pozitiv. S-a aratat ca cromatografia in strat subtire poate fi aplicata in egala masura si in cazul analizei tricotecenelor, in particular a desoxinivalenolului (DON) si al zearalenonei (ZON). Principiul metodei Extractia micotoxinelor in solventi organici si separarea lor prin cromatografie in strat subtire, identificarea micotoxinelor separate in lumina ultravioleta la lungimile de unda de 254 nm si 366 nm fata de substanta etalon si confirmarea prezenzei micotoxinelor identificate in spoturi prin reactii de derivatizare.

HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie cu lichid de inalta performanta)

Metoda HPLC realizeaza cuantificare de mare precizie. Este o metoda de referinta si poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat in cantitati foarte mici (ng). In cazul metodei HPLC dezvoltate limita de detectie poate ajunge pana la 0,02 ppm, in timp ce limita de cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metoda folosita pentru analiza numeroaselor micotoxine ca: zearalenina, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina si alfatoxine. Desi este o metoda cu un pret ridicat, care necesita experienta si timp, aceasta metoda este foarte mult folosita ca tehnica de confirmare in cazul determinarilor folosind cromatografia in strat subtire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportata la cromatografia in strat subtire: precizie. Exista doua tipuri de cromatografie cu lichid de inalta performanta: cu faza normala si cu faza inversa (RP-HPLC). Daca prima a avut o perioada de glorie acum 20 de ani, astazi cel mai des folosita este cea de a doua. Totusi trebuie specificat faptul ca in cazul folosirii (RP-HPLC), fluorescenta aflatoxinelor B1 si G1 scade. Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare si unul de detectie. Modulul de separare controleaza urmatorii parametri cromatografici: programare metoda, compozitie solvent, viteza de elutie, spalarea garniturilor, injectia probei, semnalarea a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfata IEEE- 488, termostatare coloana, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare consta din doua sisteme- un sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe si o valva de realizare a gradientului) si un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a cate 24 de flacoane si un injector automat) Modul de detetie - este un detector performant UV/Vis, cu doua canale, destinat aplicatiilor HPLC si opereaza in domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul caruia se fac achizitiile de date, cat si prelucrarea lor, este MILLENIUM. Proba de la care se pleaca este reprezentata de cereale macinate. Fiind o proba solida, trebuie sa se faca extractia prealabila a compusului de analizat, DON fiind solubil in solventi folositi in mod curent pentru extractie. Deoarece extractul este foarte complex este necesara realizarea unei separari prealabile, care are rolul de a inlatura eventualii interferenti, dar si de a proteja coloana cromatografica.

Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a doua tipuri de coloane, pe de o parte, coloane de iminoafinitate DONprep, care leaga micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana, de anticorpul specific aflat in umplutura coloanei, iar pe de alta parte, coloane multifunctionale, Mycosep 225 si coloana Multisep 216, care lasa sa treaca micotoxina prin coloana, in timp ce compusi de interferenta sunt retinuti in umplutura coloanei. In selectarea metodei HPLC si a conditiilor initiale se porneste de la proba de analizat. In urma extractiei si a separarii se obtine o proba care contine molecule cu mase moleculare mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indica abordarea unei cromatografii cu faza inversa. Alegerea coloanei de separare se face cunoscand ca DON-ul are masa moleculara mai mica de 2000, este solubil in solventi aposi, nu este ionic si nici polar. Coloana de separare aleasa pentru analiza este Symetry C18, avand lungimea de 25 cm si diametrul interior de 0,46 cm. Faza stationara este octadecilsilanul, care prezinta o retentie foarte buna deoarece lungimea lantului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de carbon). Dimensiunea porilor este de 100 , iar dimensiunea particulelor este de 5 m, optiunea fiind justificata de masa moleculara mica a compusului de analizat.

Metode de limitare si reducere a continutului in micotoxine a unor produse alimentare de origine vegetala
Jemmali (1979) si Park si col. (1988) au propus criterii specifice pentru validarea procedurilor de decontaminare a micotoxinelor in produsele alimentare. Pentru a fi considerat eficace, acest procedeu trebuie sa raspunda urmatoarelor exigente: -trebuie sa inactiveze, distruga sau sa elimine toxina; -nu trebuie sa genereze sau sa lase reziduuri toxice in produs; - trebuie sa mentina calitatile nutritive ale alimentului; -trebuie sa fie acceptabil pentru alimentatia umana si animala; -nu trebuie sa modifice in mod semnificativ proprietatile tehnologice ale produsului; -trebuie sa distruga daca este posibil sporii si mucegaiurile; O alta strategie consta in limitarea efectelor toxice ale micotoxinelor prin ingerarea de agenti chelati ai toxinei ca aluminosilicatii de sodiu sau calciu hidratati, sau cu ajutorul aditivilor alimentari (vitamine, aspartam, melatonine, piroxicam sau acid lactic si acid ascorbis), contribuind la protectia partiala a organismului fata de toxicitatea micotoxinelor.

Metode fizice
Metodele fizice pot fi clasificate in doua categorii: -metode care conduc la eliminarea fractiunilor alterate; - metode care produc denaturarea toxinelor.

Rezultatele obtinute in functie de tipul de aliment si de toxinele in cauza sunt prezentate in tabelul urmator. Metoda Produs Toxina Eficienta Curatire si eliminare Triere electronica/manuala arahide aflatoxine ++ Plutire si separare (densitate) Cernere Curatire si polizare Macinare si separare Macinare umeda Inmuiere arahide, porumb aflatoxine porumb grau porumb porumb grau porumb porumb +++

fumonisine +++ deoxinivalenolaflatoxine +/zearalenone +/fumonisine ++ deoxinivalenol++ ochratoxina A ++ aflatoxine +/zearalenona +/-

Macinare uscata Tratamente termice Caldura umeda

toate produsele aflatoxine + sau porumb fumonisine + sau Prajire toate produsele aflatoxine + sau Caldura uscata faina ochratoxine ++ Caldura toate produsele tricotecene Iradiere toate produsele aflatoxine +++ : eliminarea sau denaturare mai mult de 90%; ++: eliminare sau denaturare cuprinsa intre 70-90%;+ : eliminare sau denaturare cuprinsa intre 50-70%; :eliminare in anumite fractiuni; + sau: eliminare moderata, variabila dupa tratamentul efectuat.

Denaturare chimica
O modificare a structurii micotoxinelor poate fi efectuata prin diferite tipuri de reactii chimice (hidroliza epoxizilor si esterilor, oxidari). Metoda folosita este obligatoriu specifica structurii compusului degradat, si pentru aceeasi familie de micotoxine. Efectele diferitelor tratamente chimice ale alimentelor conform toxinelor in cauza sunt prezentate in tabelul urmator:

Metoda

Toxina

Eficienta

Acizi si baze Amoniacare aflatoxine +++ fumonisine ? Nixtamalizare aflatoxine + si? fumonisine ? Nixtamalizare+H2O2 fumonisine ? Oxidanti si redactori Apa oxigenataaflatoxine + Bisulfiti aflatoxine + Glucoza, fructoza fumonisine +
+++: denaturare si diminuare importanta a toxicitatii; +: efect benefic;-: efect nefast; ?: denaturare far modificarea toxicitatii.

Metode biologice de decontaminare

Se incearca degradarea in mediu natural a micotoxinelor cu microorganisme sau enzime. Identificarea potentialului de degradare cu microorgansime este prima etapa de dezvoltare a procedeelor. Aceasta activitate de decontaminare trebuie sa poata fi transferata pe produsele contaminate cu micotoxine. Prin decontaminare biologica' se intelege transformarea enzimatica a micotoxinei intr un compus mai putin toxic. Diluarea' nivelului de contaminare cu micotoxine, prin amestecarea unui lot sanatos si un lot contaminat este o practica interzisa in Europa (reglementata prin CE N466/2001) dar, inainte era totusi o metoda frecvent folosita. Degradarea ochratoxinei A prin metode biologice a fost pusa in evidenta in timpul procesului de insilozare. Ochratoxina A prezenta in orz poate fi degradata de flora microbiana existenta. OTA poate fi degradata de asemenea de bacteriile prezente in rumenul vacilor, ceea ce face ca aceste animale sa fie mult mai rezistente la micotoxine decat animalele monogastrice. Ochratoxina A este hidrolizata in ochratoxina si fenilalanina sau este esterificata in ochratoxina A. Eubacterium BBSH 797, bacterie izolata din rumen a fost caracterizata de Schtzmayr si col (2005) pentru potentialul sau de degradare a ochratoxinei A in ochratoxina. Capacitatea de degradare a ochratoxinei A n -ochratoxina cu Acinobacter calcoaceticus, izolat de asemenea din rumen, a fost pusa in evidenta in vitro pe mediu sintetic la 25-30C (Hwang si Dranghen, 1994). Enzimele naturale au de asemenea capacitatea de a degrada ochratoxina A. Degradarea ochratoxinei A in diverse produse neidentificate, a fost pusa in evidenta in suspensii de celule de grau, orz sau porumb. Aceste transformari enzimatice cuprind reactii de hidroliza, de metilare care contribuie uneori la pierderea potentialului toxic al moleculelor ( Ruhland si col, 1994, 1996a si 1996b). O lipaza, izolata plecand de la Aspergillus niger degradeaza ochratoxina A in ochratoxina (Stander si col. 2000).

Alte activitati enzimatice cat si alte microorganisme au fost caracterizate pentru potentialul lor de degradare a ochratoxinei A. Ochratoxina este degradata de surse de Rhizopus stolonifer si Rhizopus microsporus cu o eficacitate care poate atinge 96% pe graul umed (Varga si col, 2005). Rhizopus stolonifer este un patogen ai plantelor care contamineaza dupa recoltare. Speciile Rhizopus sunt principalele ciuperci izolate in zycomycose; cu toate acestea Rhizopus stolonifer, este rar mentionat ca patogen uman. Se propune folosirea acestor surse pentru decontaminarea cerealelor. Caracterizarea potentialului de degradare ai ochratoxinei A de anumite microorganisme care apartin florei microbiene naturale a alimentului contaminat prezinta un interes mult mai mare decat caracterizarea activitatilor enzimatice. Sursele de mucegaiuri, izolate plecand de la ciorchinele de strugure, sunt capabile se degradeze ochratoxina A pana la un nivel mai mare de 80% pe mediu sintetic. (Abrunhosa si col, 2002). Doua cai de degradare diferite au fost puse in evidenta in functie de specie, implicand activitatea carboxipeptidazei, conducand la transformarea ochratoxinei A in -ochratoxina. In plus, aceasta capacitate de degradare a ochratoxinei A a fost identificata in sursele ochratoxicogene si in sursele netoxicogene. Aceste surse apartin florei microbiene naturale a strugurelui. Folosirea surselor netoxicogene pentru eliminarea ochratoxinei A din struguri poate fi luata in considerare. Bacteriile lactice si drojdiile intervin in procedeele de fermentatie agroalimentara, prezentant potential pentru decontaminarea micotoxinelor din produsele alimentare (Shetty si Jespersen, 2005). Degradarea ochratoxinei A din lapte a fost pusa in evidenta de bacteriile din iaurt; Lactobacilius, Streptococcus si Bifidobacterium (Skrinjar si col, 1996). Sacharomyces cerevisiae, are capacitatea de a elimina ochratoxina A. Adsorbtia micotoxinelor de drojdii a fost pusa in evidenta prin folosirea unui amestec de drojdii sterile si reziduuri ale fermentatiei berii: mecanismul disparitiei ochratoxinei A in vitro presupune adsorbta micotoxinei pe peretele drojdiei (Grunkemerer, 1990). Eliminarea ochratoxinei cu ajutorul drojdiilor este superioara atunci cand drojdiile folosite sunt moarte, atingand aproximativ 90%. Acest lucru confirma ipoteza potrivit careia, eliminarea ochratoxinei A este rezultatul unui fenomen de adsorbtie, in care, volumul de celula joaca un rol in capacitatea de eliminare (Bejaouii si col, 2004). In plus, folosirea acestor drojdii vii, sau moarte, nu atrage modificari ale calitatii vinului. Acest procedeu poate fi considerat ca fiind promotor pentru decontaminarea ochratoxinei A din vin. Fermentatia alcoolica cu Sacharomyces cerevisiae cu must contaminat cu desoxinivalenol si zearalenona a aratat rezultate dupa 7-9 zile de fermentare, desoxinivalenolul a fost stabil. Din continutul initial de zearalenona, 69% a fost convertita in -zearalenol, 8,1% in -zearalenol. Marea parte a metabolizarii zearalenonei s-a produs dupa 1-2 zile de fermentatie. Folosirea fibrelor vegetale - capabile de a adsorbi imobilizarea micotoxinelor in tractul gastro-intestinal este de asemenea o metoda biologica folosita la decontaminare.

Activitatile enzimatice au fost identificate pentru degradarea ochratoxinei dar punerea la punct ca procedee de decontaminare, ramane sa fie rezolvata. Potentialul de degradare a micotoxinelor cu microorgansime prezenta in mod natural in siloz sau in produsele alimentare, prezinta un interes pentru a reduce expunerea animalului si omului la aceste toxine. Totusi, la ora actuala, nici un procedeu nu este pus la punct.

Bibliografie The Genera of Hyphomycetes, Bryce Kendrick, Keith Seifert, Gareth Morgan-Jones http://foodmycology.org/