BIOTEHNOLOGIA TRANSFERULUI DE EMBRIONI LA ANIMALE REZUMAT Ameliorarea produciei animale a beneficiat n mod tradiional de progresele realizate n mai multe

domenii: selecia geneticii, controlul reproduciei, vaccinarea, echilibrul raiilor alimentare. Pentru perfecionarea continu a procesului de reproducere n ultimele 2-3 decenii, att pe plan mondial ct i n ara noastr, se aplic cu succes biotehnologia transferului de embrioni. Transferul de embrioni este o metod modern de intensivizare a reproduciei care const n a recolta, dup superovulare i fecundaie, embrioni din aparatul genital al femelei donatoare i a-i transfera n aparatul genital ale uneia sau mai multor femele receptoare unde urmeaz ca acetia sse dezvolte. Prin acest procedeu, gradul de utilizare al femelelor de mare valoare zootehnic crete considerabil, numrul de produi care pot fi obinui n aceeai perioad de la o femel crescnd foarte mult.Biotehnologia transferului de embrioni presupune cunoaterea proceselor fiziologice intime legate de ovulaie, particularitile ciclului sexual al femelelor i evoluia zigotului n primele zile de la fecundaie. Transferul de embrioni include urm toarele etape: selecia i pregtirea femelelor donatoare i receptoare,sincronizarea estrului i ovulaiei la femelele donatoare i receptoare, inducerea poliovulaiei i nsmnarea artificial a femelelor donatoare, recoltarea, conservarea i transferul embrionilor.

2.1. Importanta transferului de embrioni Importanta transferului de embrioni poate fi zooeconomica sittiintifica. Importanta zooeconomica. Lucrarile de selectie si ameliorare aefectivelor de animale sunt limitate de numarul redus de produsi care se obtin de la o femela in cursul vietii sexuale si de intervalul dintre generatii. Asupra animalelor valoroase, ambii factori sunt frenatori,treptele ameliorarii numarndu-se in generatii succesive. Transferul de embrioni da posibilitatea folosirii cu eficienta crescuta a rezervelor deovocite de la animalele de inalta valoare zootehnica numite donatoare, prin provocarea maturarii si eliberarii mai multor gameti femeli (poliovulatie) cu obtinerea unui numar mai mare de produsi de la aceeasi femela prin transferul embrionilor in uterul femelelor receptoare. Astfel in decursul vietii sexuale este valorificat doar o infima parte din rezervade ovocite cu care femela ajunge la maturitatea sexuala. De exemplu, vaca incepe perioada genitala cu o rezerva de circa 150000 de ovocite (in ambele ovare), rezerva care diminua la circa 21000 la vrsta de 2-3 ani si la circa 2500 la 12-14 ani. Numarul de ovocite eliberate in intreaga viata sexuala nu depaseste 50, din care in conditii normale rezulta maxim 10-12 vitei. O scroafa poate produce intr-un ciclu pna la 50 de ovule dincare se vor dezvolta 10-15 purcei. Prin asigurarea numarului corespunzator de animale primitoare, de la vacile donatoare se pot obtine, in medie 3-4 vitei pe an, fiind cunoscute cazuri cnd in conditiide supraovulatie, de la o vaca donatoare s-au obtinut 30-35 vitei.Transferul de embrioni se practica si pentru scurtarea intervalului dintre generatii. Prin instalarea gestatiei, femela intra in repaus productiv (sub raportul procreerii) pe intreaga durata a gestatiei. In cazul practicarii transferului de embrioni, produsii de conceptie sunt transferati in alteorganisme, ceea ce da posibilitatea obtinerii de noi produsi de la aceeasi femel in intervalul de timp in care in mod normal, ar fi trebuit sa fie gestanta. Mai mult, in prezent se pot obtine gameti si de la tineretul femel prepuber prin provocarea prin mijloace hormonale a maturarii si expulzarii ovocitelor, care vor fi apoi transferate `n uterul femelelor receptoare. Scurtndu-se mult intervalul dintre genera]ii, se accelereaz\ameliorarea efectivelor de animale.Transferul de embrioni reduce considerabil costurile de transport,carantin\ [i eventualele restric]ii sanitar-veterinare `n

comer]ul cuanimale, prin conservarea prin congelare a embrionilor. Totodat\, prin practicarea transferului de embrioni, se pot ob]ine produ[i de la femelelevaloroase dar cu diverse afec]iuni genitale incompatibile cu men]inereagesta]iei sau cu parturi]ia.Prin apelarea la transferul de embrioni se pot ob]ine gemeni de lataurinele de carne, prin transferarea unui embrion suplimentar ob]inut dela femelele dintr-o ras\ convenabil\. De asemenea, prin transferul deembrioni se reduce intervalul de timp necesar cre\rii de noi rase deanimale cu `nsu[iri morfo-productive performante care pot forma linii defemele consangvine `n vederea folosirii lor la `ncruci[\ri industriale.~n sintez\, `n practica de produc]ie, transferul de embrioni se aplic\ pentru rezolvarea urm\toarelor probleme: reproducerea accelerat\ a animalelor de pr\sil\, de calitatesuperioar\, a raselor rare, a animalelor din rezerva genetic\ a purt\toarelor unor `nsu[iri valoroase (produc]ii ridicate,capacitate de utilizare intens\ a furajelor, prolificitate mare,longevitate productiv\, rezisten]\ la anumi]i factorinefavorabili etc.); ob]inerea unui num\r mare de descenden]i de la femelele cu produc]ii ridicate [i cu durat\ prelungit\ de exploatare, `nvederea cre\rii de familii cu aceste `nsu[iri; ra]ionalizarea importului [i exportului animalelor valoroase, caurmare a transportului embrionilor congela]i, `nl\turndu-se 103 astfel barierele sanitar-veterinare [i `nlesnirea aclimatiz\riimaterialului importat, dezvoltarea lui embrionar\ avnd loc `norganismul primitoarelor; ob]inerea de embrioni liberi de leucoz\ cu posibilitateatransferului acestora femelelor leuconegative; crearea unor b\nci de embrioni `n vederea p\str\rii ra]ionale arezervelor genetice, ceea ce este mai economic dect`ntre]inerea unor efective numeroase din rezerva genetic\. Importan]a [tiin]ific\ Transferul de embrioni reprezint\ o biotehnologie prin intermediulc\reia se poate efectua, `n condi]ii optime, un aprofundat studiu [tiin]ifical proceselor intime legate de fecunda]ie [i de influen]ele matern\ [i patern\ asupra produsului de concep]ie. Totodat\, poate fi studiat\dezvoltarea embrionar\ la animale, diversele abateri de la dezvoltareanormal\, cauzele [i factorii care genereaz\ mortalitatea embrionar\.Produ[ii ob]inu]i prin transferul de embrioni permit studiereainfluen]elor factorilor genetici [i ai mediului extern asupra dezvolt\riiembrionilor, ereditatea grupelor sanguine, ob]inerea de animale mozaicde gene, a concentr\rii mai multor caractere pe acela[i individ, ainstituirii unei profilaxii [i terapeutici genetice pentru unele boli demetabolism. Pe aceea[i linie, transferul de embrioni reprezint\ baza uneinoi genera]ii de biotehnici care deriv\ din aceasta sau `i sunt asociate: bisec]ia embrionilor, sexajul, fecunda]ia in vitro clonarea, transferul degene, iar ingineria genetic\ folose[te ca verig\ important\, `nmetodologie, aceast\ biotehnologie.Micromanipularea [i microchirurgia ovocitelor [i a embrionilor permit desf\[urarea unei cercet\ri [tiin]ifice

interesante, [i ob]inerea din punct de vedere practic a unor `nalte performan]e `n reu[ita transferuluide embrioni, prin transferul jum\t\]ilor de embrioni.Sexul embrionului poate fi precizat cu mult\ acurate]e, bazainvestiga]iei fiind dat\ de transferul embrionilor.Reproducerea, f\r\ contribu]ia genetic\ a partenerului, se poaterealiza prin ginogenez\, fiind deja ob]inu]i primii [oareci homozigo]i , (Groza I., 1996). Aspecte similare ridic\ androgeneza `n care se poateinduce bispermia, adic\ p\trunderea `n ovul a doi spermatozoizi, curetragerea ulterioar\ a pronucleului femel [i `n consecin]\ diviziunea vacontinua numai `n zona masculin\ ( Groza I., 1996 ). 2.2. Biotehnologia transferului de embrioni la vac\ La bovine, transferul de embrioni a devenit o biotehnologie dereproduc]ie larg r\spndit\ `n lume. Tehnicile de lucru sunt foarte binest\pnite, astfel `nct aceast\ modern\ biotehnologie poate fi extins\ laaproape toate fermele de cre[terea vacilor din lume. Astfel, `n Europa seob]in anual circa 100000 de produ[i prin transfer de embrioni, iar pe planmondial circa 300000 de produ[i, extinderea biotehnologiei fiind limitat\de costurile destul de ridicate. Transferul de embrioni constituie, totodat\, baza unei noigenera]ii de biotehnici, care deriv\ din aceasta sau `i sunt asociate, cumar fi: bisec]ia embrionilor, sexajul, fecunda]ia ,,in vitro, clonarea,transferul de gene.Transferul de embrioni presupune parcurgerea urm\toarelor etape:

2.2.1. Selec]ia [i preg\tirea vacilor donatoare Vacile donatoare de embrioni trebuie s\ `ntruneasc\ la cel mai`nalt nivel caracterele zootehnice care intereseaz\. De aceea, cnd se faceselec]ia donatoarelor, se are `n vedere evaluarea urm\toarelor criterii: performan]a reproductiv\, superioritatea genetic\ [i valoarea produsuluiob]inut prin transfer embrionar.Vaca donatoare va fi mai performant\ reproductiv atunci cndvrsta se situeaz\ `ntre 3 [i 10 ani, a n\scut anual cte un vi]el, a r\masgestant\ `n maxim dou\ cicluri sexuale, ciclurile de c\lduri au osuccesiune fiziologic\ [i nu a avut antecedente ginecologice (distocii,reten]ii placentare, infec]ii genitale etc.). Practic, criteriile care se au `nvedere sunt: o stare ginecologic\ perfect\, intervalul dintre parturi]ie [i primul estru s\ fie mai mic de 60 de zile, intervalul parturi]ie-`ns\mn]area fecund\ s\ fie mai redus de 80 zile iar indicele de gesta]ies\ fie mai mic de 1,5.Superioritatea genetic\ const\ `ntr-un ritm superior de cre[tere,`nainte [i dup\ `n]\rcare [i un randament ridicat la sacrificare. ~n cazulvacilor de lapte, `nsu[irile cu heritabilitate ridicat\ se refer\ la produc]iade lapte, procentul de gr\sime din lapte [i conforma]ia corporal\.Vacile donatoare trebuie s\ fie s\n\toase, ele suportnd mai multeinterven]ii de supraovulare [i recoltare de embrioni. O aten]ie deosebit\trebuie s\ se acorde alimenta]iei ra]ionale a acestei categorii de vaci.Pentru vacile de carne, necesarul de hran\ minim variaz\ cu greutateacorporal\ a femelei, cu stadiul gesta]iei, cu stadiul [i nivelul lacta]iei.Alimenta]ie pentru gesta]ie [i lacta]ie nu este necesar\ pentru vaciledonatoare, `ns\ trebuie s\ fie inclus\ `n ra]ia de hran\ a primitoarelor,dup\ instalarea gesta]iei. De regul\, vacile donatoare de embrioni suntgrupate dup\ m\rime [i/sau necesit\]i nutri]ionale pentru care se`ntocmesc de nutri]ioni[ti, ra]ii ct mai complete care s\ asigurenecesarul de hran\ zilnic pentru fiecare grup\.Vacile donatoare dup\ supraovulare, vor fi `ns\mn]ate artificialcu material seminal provenit de la cei mai valoro[i tauri. ~ns\mn]areaartificial\ se face `n perioada optim\, `n vederea asigur\rii unui nivelridicat de fecunditate, evitndu-se infectarea tractusului genital al femeleidonatoare etc

106 2.2.2. Selec]ia [i preg\tirea vacilor primitoare (receptoare) Vacile receptoare de embrioni trebuie s\ fie s\n\toase, f\r\ afec]iuniginecologice, s\ aib\ aceea[i talie cu donatoarele, s\ fie apte s\ nasc\descenden]i cu aceea[i greutate la na[tere ca donatoarele, avndu-se `nvedere c\ gesta]ia constituie un fenomen morfo-fiziologic complex ce presupune eforturi suplimentare deosebite din partea organismului matern.Cele mai bune rezultate se ob]in atunci cnd transferul deembrioni se face la tineretul femel `n vrst\ de 18-20 de luni. 2.2.3. Sincronizarea estrului [i ovula]iei la vacile donatoare[i primitoare Sincronizarea ciclului sexual la vacile donatoare [i receptoare deembrioni se poate realiza pe cale natural\ sau medicamentoas\. ~n cazul sincroniz\rii femelelor prin mijloace naturale seurm\resc, `n lotul receptoarelor femelele care `n mod spontan manifest\estrul `n acela[i timp cu donatoarele. Principalul dezavantaj const\ `nfapul c\ sunt necesare multe animale receptoare `n a[teptare. Aceast\modalitate de sincronizare s-a practicat `n perioada de `nceput atransferului de embrioni, cnd s-au folosit pentru transfer embrionii proasp\t recolta]i. ~n aceast\ situa]ie, `n aceea[i unitate trebuia s\ fie [ivaci donatoare [i receptoare, iar transferul embrionilor trebuia s\ serealizeze `ntr-un timp relativ scurt (4-6 ore de la recoltare).Sincronizarea estrului prin mijloace medicamentoase se bazeaz\ pe faptul c\ se urm\resc succesiv dou\-trei cicluri de c\lduri la vaciledonatoare [i se stabile[te durata ciclului. ~n acest fel se poate calcula dataapari]iei ciclului care intereseaz\ `n transferul de embrioni. ~n func]ie dedata previzibil\, se ac]ioneaz\ prin tratamente hormonale asupra unuigrup de femele primitoare `n vederea inducerii c\ldurilor, sincronizate cuc\ldurile naturale ale donatoarei. ~n acest caz se ac]ioneaz\ asupradonatoarei numai `n ceea ce prive[te inducerea poliovula]iei.Sincronizarea medicamentoas\ a ciclului estral al femelelor donatoare [i receptoare de embrioni se realizeaz\ pe dou\ c\i: blocareaeliber\rii hormonilor gonadotropi sau prin inducerea luteolizei.Prima cale presupune folosirea progesteronului, sau a progestinelor sintetice care prin retroac]iune `[i exercit\ efectul negativasupra hipotalamusului, diminund nivelul hormonilor gonadotropi.(Vezi capitolul Sincronizarea estrului). 2.2.4 Inducerea poliovula]iei [i `ns\mn]area artificial\a vacilor donatoare Provocarea eliber\rii concomitente la aceea[i perioad\ de c\lduria unui num\r sporit de ovocite dect cel caracteristic speciei se nume[te poliovula]ie (supraovula]ie, superovula]ie). Coordonarea neuro-hormonal\ a dezvolt\rii [i matur\rii foliculilor ovarieni ca [i a ovula]ieisunt cunoscute pn\ `n cele mai mici detalii, ceea ce a permiscercet\torilor experimentarea unei serii de scheme de tratamentehormonale care s\ induc\ poliovula]ia. Dintre multiplele scheme de

107 tratament experimentate, practica zootehnic\ a re]inut pe cele mai simple[i mai eficiente.Tratamentele actuale aplicabile in vitro se sprijin\ pecunoa[terea mecanismelor foliculogenezei, a efectului tonic alhormonilor gonadotropi (FSH, LH) care intervin `ndeosebi `n ultima faz\a cre[terii [i matur\rii foliculare. Poten]ialul ovarian de foliculi ter]iari(cu

antrum) r\mne relativ constant (`ns\ variabil cu individul) de lavrsta de dou\ luni pn\ la 12 ani ( Nibart M., 1991 ). Fiziologic, la vac\,un singur folicul ajunge la maturitate `n preajma ovula]iei, `n timp ce, `ntimpul unui ciclu sexual, 10-20 de foliculi degenereaz\. Injec]ia unuihormon cu activitate de FSH `mpiedic\ atrezia unor foliculi [i stimuleaz\dezvoltarea [i maturarea simultan\ a mai multor foliculi ter]iari, `n cursulaceluia[i ciclu estral.~n prezent, dou\ scheme clasice de tratament poliovulator suntaplicate, ambele bazate pe efectul foliculo stimulant al hormonilor gonadotropi: serul gonadotrop de iap\ gestant\, liofilizat [i standardizat -PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) denumit [i EcvinChorionic Gonadotropin (ECG), produs de celulele corionice ale iepeigestante [i hormonul de stimulare folicular\ (FSH) extras din hipofiza anterioar\. PMSG se extrage din serul sanguin al iepei gestante [i are o dubl\activitate: de tip FSH [i LH, raportul FSH/LH variaz\ de la 1/1 la 1/5 (Saumande J., 1987) . Perioada de `njum\t\]ire destul de lung\ - 120 ore- a acestui hormon determin\ o u[urin]\ `n folosire, o singur\ injec]ie de2000-2500 U.I. i.m. fiind eficient\ `n provocarea poliovula]iei. La dou\-trei zile de la injectarea PMSG se administreaz\ i.m. o doz\ de 500-750 g prostaglandin\ F 2 , c\ldurile ap\rnd la circa 48-60 de ore de lainjectarea prostaglandinei. Folosirea PMSG antreneaz\ [i unele efectenegative traduse prin cre[terea folicular\ [i secre]ia ridicat\ de estradiol[i dup\ desc\rcarea preovulatorie de LH. Acest efect negativ poate ficontracarat prin injectarea i.v. a unui anticorp anti PMSG concomitent cu prima sau cea de a doua `ns\mn]are artificial\ (de ex. Neutra -PMSGintervet).Fecundarea ovocitelor se face, de regul\, prin `ns\mn]areaartificial\ a vacilor la un interval de 12 ore de la `nceputul estrului curepetare la 8-12 ore interval. FSH se prepar\ din extractele purificate par]ial, provenite dinhipofiza mamiferelor - `n principal de suine - care con]ine FSH [i LH.Con]inutul `n cei doi hormoni [i raportul dintre ace[tia variaz\ cu lotul.Perioada de `njum\t\]ire foarte scurt\ (circa 70 minute a acestui hormonnecesit\ injectarea lui bicotidian timp de 4 zile, `n vederea men]ineriiunui nivel sanguin suficient de ridicat. Func]ie de preparatul comercial,raportul dintre FSH [i LH, de regul\ variaz\ de la 1 la 0,5. Dozele totalecare se administreaz\, `n vederea producerii poliovula]iei, variaz\ de la28 mg la vi]elele de lapte, la 40 mg pentru vaci, injec]iile f\cndu-se `nritm descresc\tor, intramuscular sau subcutanat.Preparatele care con]in ace[ti hormoni au denumiri care difer\ cuunitatea produc\toare: FSH-p, Stimufol, Ovaset, Follitropin, Superov,Ovagen, Pluset etc

108 Ca [i cealalt\ schem\ de tratament, injectarea prostaglandinei F 2 ,`n doz\ de 500-750

 g se face la 48-72 de ore de la `ncepereatratamentului, estrul ap\rnd la circa 50-60 ore de la injectarea prostaglandinei. Fecundarea ovocitelor se face prin `ns\mn]areaartificial\ a femelelor supraovulate de dou\ ori, la 12 [i 24 ore de laapari]ia estrului

109 Fig. 14 Scheme de inducere a poliovula]iei la vacile donatoare de embrioni (dup\ I.C.P.C.B. Balote[ti) O alt\ schem\ de tratament const\ `n utilizarea progestinelor pecale oral\, parenteral\, intravaginal sau implant subcutanat timp de 9-12zile. Progestinele blocheaz\ axul hipotalamohipofizo-ovarian, prinneeliberarea de FSH dar mai ales de LH. Ct timp receptorii axuluihipotalamo-hipofizar se g\sesc sub ac]iunea temporar\ a progestinelor,femela nu va manifesta estru [i nici nu va ovula. Dup\ suprimareaterapiei cu progestine, se produce o desc\rcare rapid\, compensatoare deGn-RH, ceea ce va determina, `n decurs de 5-7 zile, intrarea `n c\lduriovulatorii a femelelor tratate. ~n cursul unui astfel de tratament de blocare a ciclului se poate injecta hormonul de stimulare (FSH-p) bicotidian, `n ritm descresc\tor `ncepnd cu a 6-a zi de la blocareaciclului, concomitent cu o injec]ie intramuscular\ de PGF 2 . ~n cazul`ntrebuin]\rii preparatelor hormonale pe baz\ de PMSG, acestea seinjecteaz\, `mpreun\ cu o doz\ de prostaglandin\ F 2 , `n a 6-a - a 7-a zide la introducerea implantelor, pesariilor etc., urmat\ de injectarea uneidoze de anti PMSG concomitent cu a 2-a `ns\mn]are artificial\ Rezultatele tratamentelor de superovulare sunt influen]ate devrsta femelelor, ras\, mascul, sezon, nivelul produc]iei de lapte, stareageneral\, etc. De regul\, vi]elele produc un embrion viabil mai pu]indect vacile adulte. 2.2.5. Fecundarea ovocitelor Ovocitele sunt fecundate `n urma `ns\mn]\rii naturale sauartificiale. De regul\, se efectueaz\ dou\ `ns\mn]\ri artificiale lainterval de 12-24 de ore de la `nceputul c\ldurilor observate clinic sau,sistematic, dup\ 56 [i 72 de ore de la injec]ia cu PGF 2 , sau dup\ 36 [i48 de ore de la retragerea implantelor sau pesariilor. 2.2.6. Recoltarea embrionilor Embrionii sunt colecta]i atunci cnd se g\sesc `n cornul uterin,dup\ ie[irea lor din oviduct (`ntre zilele 4-5). Din motive sanitare [i decongelare se prefer\ colectarea embrionilor `nc\ inclu[i `n zona lor pelucid\ (ies `n a 9-a zi). Cel mai frecvent, colectarea se realizeaz\ `ntrezilele 6-8 dup\ fecunda]ie, de regul\ `n ziua a 7-a.Recoltarea embrionilor se face chirurgical [i nechirurgical . Multtimp, metoda chirurgical\ a fost singura utilizat\. Tehnica operatorie presupunea parcurgerea a dou\ etape: laparotomia, cu exteriorizareaaparatului genital `n plag\ [i recoltarea propriu-zis\ a embrionilor prinsp\larea cu un lichid cu o compozi]ie special\, a oviductelor (dup\ uninterval de timp mai mic de 3 zile dup\ `ns\mn]are) sau a coarnelor uterine (dup\ un

interval de timp mai mare de 4 zile de la `ns\mn]are).~n prezent, metoda chirurgical\ de recuperare a embrionilor la vac\ esteabandonat\, datorit\ inconvenientelor pe care le prezint\. Ast\zi, estegeneralizat\ metoda nechirurgical\ de prelevare a embrionilor, a c\rei principiu const\ `n sp\larea coarnelor uterine cu un mediu special preparat, sp\lare care se realizeaz\ `n condi]ii de asepsie `n a 7-a zi de la`ns\mn]are. Tehnica nechirurgical\ de colectare a embrionilor s-a perfec]ionat continuu, firme specializate produc pe scar\ industrial\mediul de recoltare, congelare, decongelare [i `ntreaga aparatur\necesar\ recolt\rii [i transferului embrionilor. Tehnicile nechirurgicale de recoltare a embrionilor presupun maimulte opera]ii: conten]ia femelei, anestezia, vidarea rectului, toaletavulvei [i a regiunii perivulvare, identificarea prezen]ei corpilor galbeni pe ovar, introducerea lichidului de sp\lare `n lumenul coarnelor uterine,sp\larea acestora, recuperarea lichidului `mpreun\ cu embrionii,identificarea [i recuperarea embrionilor din lichidul recuperat [i supusdecant\rii [i aprecierea morfologic\ a acestora.~n condi]ii de ferm\, recoltarea embrionilor se face la locul undese g\se[te femela donatoare, dup\ ce `n prealabil, vecinele acesteia aufost `ndep\rtate. Femela se conten]ioneaz\ adecvat, astfel `nct s\-i fielimitate mi[c\rile, trecerea sondei prin canalul cervical care este `nchis, provocnd dureri animalului [i implicit, reac]ie de ap\rare. Pentru a suprima durerea, se practic\ anestezia epidural\ cu 4-6 ml procain\ 2%sau cu 10 ml ludocain\ 1%, care blocheaz\ nervii coccidieni [i ultimele perechi de nervi sacrali (S 3 ,S 4 ,S 5 ). Acul se introduce `ntre prima [i adoua vertebr\ coccigian\ sau `ntre ultima vertebr\ sacral\ [i primavertebr\ coccigian\, anestezia instalndu-se dup\ circa 10-15 minute [idureaz\ `n jur de 90 de minute, zonele insensibilizate fiind: coada,anusul, rectul, vulva, vaginul [i uterul.Se introduce, cu precau]iile de rigoare, mna `n rect, acesta sevideaz\ de con]inut, apoi se apreciaz\ r\spunsul femelei la tratamentul poliovulator, palpndu-se cu aten]ie ambele ovare [i num\rdu-se corpiigalbeni (foto 24). ~n cazul `n care r\spunsul la tratamentul desuperovulare este pozitiv, se procedeaz\ cu precau]ie la introducereacateterului de tip Folley cu dou\ sau trei c\i, prin conductul cervical pn\`n cornul uterin. Pentru rigidizarea cateterului, se introduce pe lumenulacestuia un mandren (tij\ metalic\), care se men]ine pn\ se ajunge `nlumenul cornului uterin, apoi seretrage. Cateterul este introduscirca 5-8 cm de la bifurca]iacoarnelor uterine, pe unul dintreacestea, apoi se introduce de laexterior, cu seringa, 8-15 ml de aer `n scopul fix\rii cateterului [i pentru a `mpiedica refularea dincervix a lichidului de sp\lare.Vasul din sticl\, ce con]ine lichidulde sp\lare se suspend\ la 1,5 m dela sol [i, prin c\dere, acesta ajunge prin calea de admisie a cateterului`n coarnele uterine. Irigareaacestora se face continuu, calea deevacuare a lichidului esteconectat\, printr-un tub de plastic,la vasul de colectare a mediuluirecuperat (de sp\lare). Recuperarealichidului de sp\lare se face princalea de admisie (`n cazulcateterului cu dou\ c\i la care s-aadaptat o pies\ `n forma literei y ) Foto 24 Recoltarea embrionilor prinmetoda nechirurgical\

prev\zut cu canal de admisie [i evacuare al lichidului, ramura de evacuarea lichidului fiind conectat\ la un filtru de colectare a c\rui orificii au undiametru de 75 m, care are rolul de re]inere a embrionilor, lichidul cetraverseaz\ filtrul fiind colectat `ntr-un recipient situat sub filtru. Mediulfolosit la sp\larea unui corn uterin se folose[te la sp\larea, `n acela[i mod,a celui de-al doilea corn uterin. Cantitatea de mediu care se folose[te pentru sp\larea unui corn uterin este de 300-500 ml, efectundu-se irig\rirepetate [i un masaj transrectal permanent al cornului uterin perfuzat.Exist\ diverse sonde de recuperare a embrionilor, imaginate de diver[icercet\tori, care se bazeaz\ pe acela[i principiu constructiv (Elsden [i colab., 1978, Newcomb [i colab., 1978, Cassou etc.) 2.2.8. Conservarea [i deconservarea embrionilor Embrionii pot fi conserva]i cteva ore in vitro la 20 o C `ntr-unmediu de conservare: PBS adi]ionat cu 4 g/l albumin\ seric\ bovin\, saucu 10% ser de vi]el fetal decomplementat. ~n acest mediu, embrionii suntmen]inu]i pn\ cnd sunt transfera]i la receptoare. ~n cazul `n caretransferul nu se realizeaz\ `n 6-8 ore de la recoltare, se recomand\congelarea prin refrigerare a embrionilor, la o temperatur\ de 0 o -4 o C`ntr-un mediu de conservare identic. ~n acest fel embrionii pot ficonserva]i una-dou\ zile f\r\ ca viabilitatea s\ fie afectat\.Conservarea de lung\ durat\ a embrionilor congelarea - r\mnecea mai avantajoas\ metod\ de men]inere pentru un interval de timp practic nelimitat a viabilit\]ii embrionilor. Pentru aceasta, embrionii,trebuie s\ fie men]inu]i `n stare solid\, `n azot lichid, la temperatura decirca -196 o C. La temperaturi mai sc\zute de -100 o C, metabolismulcelular este complet blocat, singura problem\ mai dificil\ constnd `natingerea acestor temperaturi f\r\ a omor` embrionii. ~n timpulcongel\rii, intervin doi factori letali pentru embrioni: formarea ghe]iiintracelulare [i concentra]ia salin\ ridicat\. Pentru a pre`ntmpina efectulnegativ al acestor doi factori, metoda de r\cire const\ `n deshidratarea par]ial\ a celulelor [i evitarea [ocului produs de concentra]iile ridicate `ns\ruri prin utilizarea unui Crioprotector, `n general glicerol cu oconcentra]ie de 1,5 M (sau 10% `n volum) `n mediul de congelare. Caagen]i criopro-tectori se mai pot folosi: dimetilsulfoxid (DMSO), etilen-glicol, glicerol, propilen-glicol. ~n prezent sunt numeroase aparate programabile (freezere) care permit realizarea unei curbe optimale der\cire (foto 28). Substan]ele crioprotectoare (`n general polialcooli) suntcapabile s\ p\trund\ u[or `n celule printr-o simpl\ difuziune (osmoz\),`ntrziind formarea cristalelor deghea]\ prin coborrea punctuluide `nghe]. Totodat\, substan]elecriopro-tectoare limiteaz\ efectelenegative ale concentra]iei salineridicate, `nlocuind o parte din apaintracelular\ atras\ prin cre[terea presiunii osmotice extracelulare.Al]i compu[i pot avea un rol protector fa]\ de membranelecelulare (hidra]i de carbon, polivinilpirolidon), ( Baril [i colab., 1993

) Viteza de coborre a temperaturii are importan]\ mare `n protejarea viabilit\]ii embrionilor. Mediul care con]ine embrionii(extracelular) este mai bogat `n ap\ dect mediul celular. Prin coborreatemperaturii, primele cristale de ghea]\ se produc mai `nti `n mediulextracelular, ceea ce va antrena o ridicare a concentra]iei `n solu]ie afrac]iunii necristalizate. Aceast\ concentra]ie salin\ ridicat\ va provocaie[irea unei p\r]i din apa celular\, reducnd `n acest fel formarea ghe]iiintracelulare. Dac\ ritmul de r\cire este prea rapid, apa intracelular\ nu poate ie[i `n cantitate suficient\, cristalele de ghea]\ se formeaz\ `ncantitate mare `n interiorul celulelor [i aceste cristale `[i m\resc talia lor `n timpul congel\rii [i decongel\rii distrugnd structurile celulare. ~ncazul `n care ritmul de r\cire este lent, deshidratarea progresiv\ acelulelor antreneaz\ o cre[tere important\ a concentra]iei `n electroli]i, `nmediul celular, modificnd propriet\]ile fizico-chimice (efectul solu]iei),consecin]a fiind totdeauna pierderea viabilit\]ii celulelor.Astfel, integritatea celulelor vii dup\ congelare este strns legat\de dinamica apei intracelulare `n timpul r\cirii [i deci de viteza decongelare. ~n cazul embrionilor, ritmul de r\cire trebuie s\ corespund\ pentru toate tipurile de celule care-l compun. Rezultatele cercet\rilor `ntreprinse pentru clarificarea aspectelor referitoare la ritmul decongelare confirm\ faptul c\ acesta trebuie s\ se desf\[oare `n dou\etape diferite: o congelare lent\, `n dou\ trepte: la `nceput 4 o C/min pn\la 6 7 o C [i 0,3-0,6 o C/min `ntre 7 o C [i 30 35 o C, apoi o congelarerapid\ (brusc\) de la -35 o C pn\ la temperatura de p\strare -196 o C.Timpul de a[teptare al embrionilor din momentul recolt\rii [i pn\la `nceperea congel\rii, nu trebuie s\ dep\[easc\ dou\-trei ore.Protocolul de congelare a embrionilor bovini prevedeurm\toarele: alegerea embrionilor - calitate excelent sau bun; timp de la recoltare pn\ la `nceperea congel\rii: dou\-trei ore; introducerea embrionilor `n mediul de congelare la temperaturalaboratorului (20 o C); -

introducerea embrionilor `n paiete identificate (mediu, bul\ deaer, embrioni +mediu, bul\ de aer, mediu); r\cirea pn\ la -6 o C sau -7 o C cu o vitez\ de 4 o C/minut; inducerea cristaliz\rii (palier 5-10 minute); r\cirea pn\ la 30 o C sau 35 o C cu o vitez\ de 0,3 -0,6 o C/minut; introducerea paietelor ce con]in embrionii, direct `n azot lichid[i stocarea lor (-196 o C).Paietele se vor p\stra `n permanen]\ `n azot lichid pn\ `nmomentul transferului la femelele receptoare. Durata stoc\rii embrionilor `n azot lichid nu influen]eaz\ supravie]uirea ulterioar\ a acestora. Decongelarea embrionilor [i `nl\turarea crioprotectorului Embrionii congela]i la -35 o C nu sunt dect par]ial deshidrata]i, oanumit\ cantitate de ghea]\ se formeaz\ inevitabil `n celule, `n momentulimersiei `n azot lichid (-196 o C). Pentru a se evita ca prin decongelare s\se produc\ o cre[tere a acestor mici cristale de ghea]\ care s\ distrug\

118 celulele, decongelarea trebuie s\ se fac\ `n timp, ct mai repede posibil(circa 2000 o C/minut). Pentru aceasta, paietele se scot repede dincontainerul cu azot lichid [i se introduc direct `ntr-o baie de ap\ la 37 o C,unde se men]in circa 30 de secunde. Imediat dup\ decongelare,`nl\turarea rapid\ a crioprotectorului este indispensabil\ supravie]uiriiembrionilor. Totu[i, celulele care con]in o

concentra]ie ridicat\ decrioprotector nu trebuie s\ fie introduse direct `ntr-un mediu izotonic,`ntruct diferen]a mare de presiune osmotic\ va provoca p\trunderea prea rapid\ a apei `n celul\, ceea ce va risca s\ explodeze. De aceea, estenecesar\ o `ndep\rtare progresiv\ a crioprotectorului astfel `nct ie[ireaacestuia [i p\trunderea apei `n celul\ s\ fie compatibile cu permeabilitatea membranei celulare.Pentru aceasta sunt mai multe metode care realizeaz\ o rehidratarelent\ a celulelor embrionare. 2.2.9. Transferul embrionilor O aten]ie deosebit\ va fi acordat\ selec]iei femelelor receptoare,`ntruct condi]ioneaz\ `n mare parte rezultatele dup\ transfer. Condi]iilede mediu `n care receptoarele sunt `ntre]inute trebuie s\ corespund\ unuimicroclimat optim de igien\ [i de statut sanitar. A[a cum s-a men]ionat`n capitolul anterior, receptoarele trebuie s\ aib\ o activitate sexual\ciclic\, s\ fie bine dezvoltate corporal, f\r\ afec]iuni ale tractusuluigenital. Alegerea receptoarelor poate porni de la vi]ele `n vrst\ de 18luni cu condi]ia atingerii a cel pu]in 2/3 din greutatea corporal\ aadultului. Aprecierea curbei de cre[tere cu cel pu]in 30 de zile `naintea`nceperii tratamentului sau a transferului d\ posibilitatea corect\rii sauoptimiz\rii alimenta]iei (dac\ este necesar). Transferul embrionilor seface cu foarte bune rezultate [i la vaci adulte `n vrst\ de 3-6 ani dac\func]ia de reproduc]ie s-a desf\[urat normal.Examenul femelelor receptoare se completeaz\ cu apreciereaultimului estru, care trebuie s\ aib\ loc `ntre parametrii fiziologici(comportament sexual, calitatea mucusului cervical, starea de s\n\tate aconductului vestibulo-vaginal [i al orificiului vaginal al cervixului). Preg\tirea receptoarelor const\ `ntr-o sincronizare ct mai perfect\ a ciclului sexual cu cel al femelei donatoare. Se pot folosifemele receptoare, fie `n c\lduri naturale fie `n c\lduri induse printr-untratament de control al ciclurilor sexuale (vezi cele men]ionate anterior).O aten]ie special\ se va acorda depist\rii ciclurilor (diminea]a, prnz,seara) apoi se determin\ momentul exact al `nceputului estrului. ~nainteatransferului propriu-zis se face un examen transrectal al ovarelor pentru aidentifica corpul galben pe unul din ovare. Transferul embrionului se vaface `n vrful cornului uterin adiacent ovarului pe suprafa]a c\ruia este prezent corpul galben. Rezultate bune s-au ob]inut [i prin depunereaembrionului la circa 10 cm de la bifurca]ia coarnelor uterine `n lumenulcornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben. ~nainte [i imediatdup\ transfer se va evita orice stres: vaccin\ri, tratamente antiparazitare,ecorn\ri, lotiz\ri, tuberculin\ri, recolt\ri de snge etc. Se va evitaschimbarea brusc\ a regimului alimentar: de exemplu introducerea maseiverzi prim\vara 4 s\pt\mni dup\ transfer. Varia]iile climatice determin\o cre[tere a mortalit\]ii embrionilor dup\ transfer. ~n cazul folosiriiembrionilor proaspe]i, receptoarele se ]in `ntr-un grajd curat [i ct mai aproape de donatoare. ~n acest mod se evit\ pierderile de timp [i seamelioreaz\ factorii de reu[it\.Transferul propriu-zis al embrionilor la femelele receptoare serealizeaz\ prin dou\ metode: chirurgical [i nechirurgical. Transferul chirurgical s-a aplicat `n perioada de `nceput [i aconstat `n deschiderea cavit\]ii abdominale (pe linia alb\ sau `n flanc),exteriorizarea cornului uterin [i depunerea embrionului pe cornul uterincorespunz\tor ovarului cu corp galben prin punc]ionarea pereteluiacestuia. Este o metod\ laborioas\, costisitoare, traumatizant\ pentrufemele, ceea ce a condus la abandonarea ei.Metoda actual\ care d\ cele mai concludente rezultate este cea nechirurgical\. Aceast\ metod\ folose[te calea vagin-cervix,asem\n\tor `ns\mn]\rii artificiale. Pentru transfer se folose[te un pistolet tip Cassou `n care se introduce paieta cu embrionul deconservatsau proasp\t recoltat. Pentru a se evita contaminarea `nveli[ului dinmaterial plastic al pistoletului Cassou pe timpul travers\rii conductuluivestibulo-vaginal, se fixeaz\ un al doilea `nveli[ din material plastic careeste sec]ionat pe toat\ lungimea sa. Dup\ ce pistoletul ajunge `n

lumenulcervical, acest `nveli[ protector se retrage. Pentru a `nvinge rezistean]acervixului (`n aceast\ faz\ cervixul fiind `nchis) se folosesc uneoridilatatoare. La circa 10 cm de bifurca]ie, pe cornul uterin corespunz\tor ovarului ce con]ine corpul galben, se depune embrionul, asem\n\tor `ns\mn]\rii artificiale. Aceast\ metod\ este exclusiv folosit\ `n prezent, progresul depinznd de antrenamentul [i obi[nuin]a operatorilor.Traversarea cervixului trebuie s\ se realizeze cu mare precau]ie `nvederea evit\rii lezion\rii mucoasei acestuia. ~n vederea relax\riicervixului, a evit\rii contrac]iilor organelor genitale se efectueaz\anestezia epidural\ cu 4-6 ml procain\ 2%, sau alte preparatemedicamentoase cu efect similar.