2.

Determinarea celulara -celulele determinate sunt angajate pe o anumita cale de dezvoltare -ele sunt denumite cu sufixul blast-mioblast, neuroblast -ele se pot diferentia autonom atunci cand sunt palsate in alta regiune embrionara -se pot diferentia autonom intr-un mediu neutru(in alta reg embr) -daca se preleva din blastula de amfibian, celule care vor forma capul si se transplanteaza in alt embrion -se constata ca celulele transplantate se diferentiaza in aceeasi directie cu celulele inconjuratoare -concluzia: celulele nu erau determinate in momentul transplantului -daca se preleva din gastrula de amfibian celule care vor da nastere capului si se transplanteaza in alt embrion -se constata ca embrionul gazda, va forma un cap suplimentar -concluzia: in momentul transplantului celulele erau determinate si nu depind de celulele inconjuratoare -au fost prelevate portiuni din regiunea dorsala a blastoporului -Momentul in care o celula este determinata poate fi aflat pe baza transplantului celular (DESEN 1) -desen 1: tehnica prin care se stabilesye momentul determinarii consta in transplantarea celulelor dintr-o regiune embrionara in alta regiune embrionara. Ex: rux Determinarea celulara implica selectarea genelor care se vor exprima in fiecare tip celular. Odata implicate aceste gene, optiunile embrionare ale celulei sunt limitate si celula va transmite starea celulara determinata tuturor descendentilor. -legat de determinarea celulara se pun 2 intrebari moleculare: -1) care sunt moleculele care definesc starea celulara determinata? -2) mecanismele prin care se asigura transmiterea starii determinate de la o celula la alta in cursul diviziunilor celulare? -1) In cazul muschilor un rol foarte important il joaca proteinele miogene din care fac parte: Myo D-Myoblast Determination Myf-5-MyoD family Miogenina -Gena Myo D-se exprima prima, exprimarea ei angajand celulele specificate din somite sa se angajeze pe calea musculara. In plus, daca gena Myo D este introdusa intr-un fibroblast, in cultura, ea converteste acest fibroblast in mioblast prin aparitia in citoplasma a actinei specific musculare. (Desen 2)-dana -Muschii se dezvoltau si aveau originea in miotomul somitelor, acestea sunt nedeterminate si cand sunt exprimate primele 2 gene si se angajau pe cale determinata si devin mioblaste. Mioblastele fuzioneaza unele cu altele si formeaza miotubul. Proprietetea fibrei musculare striate: mai multi nuclei. Legenda: Implicarea factorilor transcriptionali miogeni in miogeneza. Celulele determinate prezinata in citoplasma un ansamblu de proteine care angajeaza respectiva celula pe o anumita cale de dezvoltare. Aceste proteine sunt repr de factori de transcriptie sau factori transcriptionali. In cadrul dezv embr exista o sg celula determinata, care se divide si da nastere la 2 celule determinate si asa mai departe. -2) s-au propus 2 mecanisme pentru asigurarea acestei memorii celulare: -memoria citoplasmatica/feed-back pozitiv -memorie nucleara Memoria citoplasmatica-se considera ca in prima celula deterinata exista un factor transcriptional notat A. -acesta se poate lega de regiunea promotor a propriei gene, ceea ce determina un autoreglaj, la nivel transcriptional. -astfel, atata timp cat proteina A este legata de gena a (propria gena) -aceasta gena va fi activa si va produce proteina A. -factorul transcriptional A poate interactiona si cu alte gene: cu gena b, pe care o blocheaza si gena c, pe care o activeaza. -acest model de activari si represii genice, caracterizeaza un anumit tip celular. 1

-dupa diviziunea mitotica a celulei respective, celulele fiice contin in citoplasma suficienta proteina A, care translocata intr-un nucleu reia modelule exprimarii genice din celula parentala. DESEN 3-rux legenda: memoria citoplasmatica este asigurata printr-un mecanism de feedback pozitiv (pt ca proteina este legata de propria gena) -in cazul muschilor exista o intarziere intre perioada de determinare si diferentiere 2)Memoria nucleara. -implica existenta unui anumit model de gene active si inactive si se bazeaza pe modificari intrinseci ale cromatinei de tipul metilarii ADN si inactivarii unui cromozom X. -existenta memoriei nucleare face posibil ca 2 gene identice (alele, provenite una de la mama,iar alta de la tata) sa fie exprimate diferit chiar daca sunt expuse aceluiasi mediu citoplasmatic -intiparire genomica metilare ADN-exprimarea unei alele numai de la un parinte 3) Diferentierea celulara -in cursul diferentierii celulare, celulele devin diferite unele de altele si capata identitati distincte -in cursul diferentierii celulare, se exprima genele caracteristice fiecarui tip celular -gene care codifica pentru produsi specifici -ex: gena hemoglobinei in hematii, gena keratinei in celulele epidermale (keratinocite) -acest lucru este foarte important, daca se angajau gene pentru o cale celulara, ele nu se deosem de celalte tipuri de cel dpdv fenotipic si astfel este imp diferentierea -in afara genelor caracteristice fiecarui tip celular, celulele diferentiate exprima si gene comune de ex. genele implicate in metabolismul energetic -celulele diferentiate sunt caracterizate de produsii pe care ii contin, a.i. introducerea unei noi proteine modifica fenotipul celular -de ex: proteina Vilina se gaseste in cortexul celular al celulelor care prezinta in polul apical microvili -daca ADN-ul care codifica pentru Vilina este introdus intr-o celula care prezinta microvili rudimentari -aceasta celula dezvolta microvili lungi -celulele diferentiate in mod normal nu se mai divid (o celula terminal diferentiata nu se mai divide) -(in cazul celulelor diferentiate-care nu se divid, o singura optiune este apoptoza) -exista 2 exceptii de la aceasta regula: -1)transdiferentierea (are loc doar in-vitro si doar la triton in-vivo) -2)dediferentierea 1)TRANSDIFERENTIEREA-a fost observata initial in cursul regenerearii la unele organisme -s-au observat convertirea unui tip celulat in alt tip celular inrudit -ex: regenarea cristalinului la triton se realizeaza prin recrutarea celulelor din regiunea dorsla a epiteliului pigmentat al irisului -transiferentierea poate fi demonstrata in cultura: -1)-celulele RETINIENE in cultura prezinta un anumit fenotip caracterizat prin microvili la polul animal si granule de pigment in citoplasma. Daca in mediul de cultura se adauga hialuronidaza, ser fetal bovin si fenilthiouree, se constata ca celulele pierd pigmentul si microvilii , se aplatizeaza si se stratifica. Daca in continuare se adauga in mediul de cultura acid ascorbic, celulele de transdiferentiaza in celule cristaliniene si produc proteina cristalina. *INHIBITIE DE CONTACT in cazul celulelor normale, in mediu in-vitro, celulele tumorale nu au inhibitie de contact si se dezvolta in multistrat. -2)-celulele CROMAFINE din medulosuprarenala, in cultura au un fenotip caracteristic, sunt prismatice si secreta adrenalina. Daca se adauga in mediu de cultura, factor de crestere nervos, se constata ca fenotipul se modifica, devin neuroni simpatici cu prelungiri si secreta noradrenalina. DESEN 4. Transdiferentierea are loc numai intre tipuri celulare inrudite! -astfel celulele retiniene si celulele cristaliene provin din ectoderm si participa la formarea ochiului -celulele cromafine si neuronii simpatici provin din crestele neurale. 2)DEDIFERENTIEREA-reprezinta pierderea caracteristicilor diferentiate si diferentierea intr-un tip celular care poate fi neinrudit 2

-ex: dupa amputarea unui membru la triton, keratinocitele de la marginea ranii se dediferentiaza, prolifereaza si formeaza o structura denumita BLASTEM. -pe baza blastemului va fi regenerat complet membrul amputat -in acest caz blastemul va forma si celule osoase care sunt de origine mezodermala, diferita de originea ectodermala a keratinocitelor. REGENERARE EPIMORFICA-regenerarea cozii la pesti, regenerare dupa model, are loc doar la triton, dintre amfibieni. Capitolul 2 : Reglarea transcriptionala in cursul embriogenezei -reglarea expresiei genice necesita actiunea concertata a unui spectru larg de proteine care se leaga de ADN si interactioneaza cu aparatul transcriptional -factorii transcriptionali sunt reprezentati de proteine, care prin legarea de ADN influenteaza transcrierea unei gene prin activarea sau blocarea ei -acest efect poate fi realizat direct prin legarea de ADN -sau indirect prin interactia cu alte proteine -factorii transcriptionali care interactioneaza cu regiunile de control ale genelor (promotorul si enhancerul) -au fost impartiti in 2 categorii: 1) -factori transcriptionali generali sau bazali 2) -factori transcriptionali reglatori 1)-Factorii transcriptionali generali -interactioneaza cu secventa promotoare TATA aflata la 25 de nucleotide, inaintea situsului START de initiere a transcriere -acesti factori transcriptiionali sunt necesari pentru transcrierea majoritatii genelor si din acest motiv se intalnesc in toate tipurile celulare 2)-Factii transcriptionali reglatori -se leaga de ADN la distanta de situsul de initiere al transcrierii -au rolul de a modula activitatea transcriptionala si sunt caracteristici unui tip celular -compararea secventelor de aa necesare pentru lecarea de ADN, a condus la identificarea unor motive sau domenii necesare pentru fixarea de acidul nucleic -s-a constatat ca aceste motive sunt conservate in lumea animala de la nevertebrate la om -pe baza motivelor de legare de ADN, factorii transcriptionali au fost impartiti in superclase, clase si familii -in afara motivului de legare de ADN, factorii transcriptionali prezinta si alte domenii necesare pentru activarea sau blocarea transcriptionala, legarea unui ligand, dimerizarea cu alti factori transcriptionali, raspunsul la un semnal intracelular. DESEN 5-cu galben este proteina. *vezi site cu factori transcriptionali Clasificarea factorilor transcriptionali (reglatori) I. Superclasa factorilor tasnscriptionali cu motive zinc-finger II. Superclasa factorilor transcriptionali cu domenii bazice III. Superclasa factorilor transcriptionali cu motiv HTH -Cea mai importanta descoperire a ultimilor 20 de ani, este aceea ca mecanismele moleculare de baza ale embriogenezei, sunt conservate in toata lumea animala de la nematode la om. -gene omoloage pot realiza functii similare la organisme diferite -o astfel de gena este Engrailed, denumita dupa fenotipul mutant, care inseamna a marginii -....la drosophila....unor ggl nervosi -gena Engrailed 1 la soarece este implicata in formarea cerebelului -daca la soarece nu se exprima gena engariled 1, cerebelul la embrioni este rudimentar -daca se realizeaza soareci transgenici in care gena Englailed 1 de la soarece este inlocuita cu gena Engrailed de la Drosophila, se constata ca dezvoltarea cerebelului nu este afectata. Ex2: gena Pax6, este implicata in formarea ochilor la toate metazoarele -la Drosophila, aceasta gena poatra denumirea de eyeless, dupa fenotipul mutant, de lipsa a ochilor 3

-daca aceasta gena este introdusa in embrionul de Drosophila, la situsuri ectopice apar ochi suplimentari -aceeasi gena daca este introdusa in embrionii de amfibian, determina formarea de ochi suplimentari q -daca se compara organisme cu plan corporal asemanator: pesti, amfibieni, se constata ca genele omoloage au nodule reglatorii asemanatoare -acelasi lucru este valabil si daca se compara specii de nematode cu insecte -daca se compara, insa, genele omoloage de la nevertebrate cu cele de la vertebrate, se constata ca regiunile reglatorii sunt foarte diferite, chiar daca regiunile codificatoare pentru proteine sunt asemanatoare I. Superclasa factorilor transcriptionali de legare zinc-finger Clasa I.1.: Cys2His2 (C2H2) I.1.1. Familia factorilor ubiquitari: TFIIIA I.1.2. Familia reglatortilor embrionari/ celulari: KRUPPEL, HUNCHBACK Clasa I..: Cys4(C4)=receptori nucleari I.2.1 Familia receptorilor pentru hormoni steroizi: GR, PR, AR, ER (grucocorticoizi, progesteron, androgen si estogen) receptori pentru: I.2.2 Familia factorilor tip receptori pentri hormoni tiroidieni: RAR, RXR, T3R(receptorh tiroidian R3), VDR (R pt vitamina D) Clasa I.1 C2H2 -in modelele zinc-finger ale acestei clase, zincul joaca un rol structural pentru ca el stabilizeaza aceste motive scurte, prin interacii ionice in care sunt implicate 2 histidine dintr-un helix si 2 cisteine dintr-o structura pliata. -motivele zinc-finger, sunt implicate in legarea de ADN, de ARN si in dimerizare in unele cazuri Factorul transcriptional TF III A Transcription Factor, care interactioneaza cu ARN pol III A -a fost descoperit in citoplasma ovocitelor de Xaenopus, unde sa gaseste in cantitate foarte mare -este o proteina de 39kDa, care contine 9 motive zinc-finger -fecare motiv zinc-finger interactioneaza cu 3 pana la 5 perechi de baze -interactiile cu ADN-ul se realizeaza prin intermediul aa din helixurile motivurilor zinc-finger -structurile pliate nu sunt implicate in aceste interactii -acest factor transcriptional recun o secv specif din promotorul genei, ARNr 5S -TFIIIA interactneaza si cu produsul genei, adica ARNr 5S pentru a forma particule ribo-nucleo-proteice de 7 S, formate dintr-o molecula de TFIIIA si una de ARNr 5S -TFIIIA se infasoara in jurul foselor majore din ADN prin intermediul celor 3 motive zinc-finger aflate la fiecare capat al moleculei si se aseaza pe o singura fata a acidului nucleic cu cele 3 motive zinc-finger centrale Factorul transcriptional KRUPPEL -functioneaza in cursul dezvoltarii embrionare la Drospphila -este denumit dupa fenotipul mutant (germ: schilod invalid) -contine 5 motive zinc-finger -el se poate lega de propria gena, realizand un autoreglaj transcriptional -se poate lega de alte gene embrionare pe care le activeaza sau le blocheaza Factorul transcriptional HUNCHBACK -este prezent tot la Drosophila -este denumit dupa fenotipul mutant (germ: cocosat) -este diferit de alte proteine zinc-finger, deoarece contine 2 domenii distincte -unul cu 4 si altul cu 2 motive zinc-finger -aceasta structura bipartita reflecta 2 functii moleculare diferite -acest factor transcriptiona este implicat in formarea capului la Drosophila -si mai este implicat in blocarea genelor din complexul Bithorax 4

Clasa C4-receptorii nucleari -cuprinde peste 150 de proteine diferite -majoritatea acestora, dar nu toate, interactioneaza direct cu moleculele ligand, care datorita caracterului lipofilic, pot trece prin membrana plasmatica -moleculele ligand au caracter lipofilic si pot trece prin membrana plasmatica -spre deosebire de receptorii transmembranari, receptorii nucleari influenteaza direct exprimarea genelor -ei se numesc receptori pentru ca fc in prezenta unui ligand -s-au descris 3 cai prin care liganzii sunt livrati receptorilor nucleari 1)-ligandul (hormonul tiroidian) este produs in afara celulei tinta printr-un mecanism endocrin clasic fiind apoi inportat in celula tinta 2)-liigandul (acizii retinoici) este produs in celula tinta dintr-un apohormon importat De ex. retinolul sangvin este convertit intracelular de catre izomeraze in retinoizi bioactivi trans si 9-cis. -acestia sunt recrutati de 2 proteine Chaperone, si translocati in nucleu unde interactioneaza cu receptorii RAR-Retinoic Acid Receptor. -de acest receptor se leaga toti retinoziii trans si 9-cis -RXR-Retinoic Acid X Receptor de care se leaga retinoizii 9-cis 3)-ligandul (prostaglandinele) sunt produse in celula tinta