TOXICOLOGIE MOLECULAR

Curs introductiv

Scurt istoric

Papirusul egiptean Ebers, datnd din 1500 BC, este cea mai veche farmacopee lucrrile lui Hippocrat, Aristotel i Teofrast publicate ntre 400 i 250 BC includ meniuni despre otrvuri Dioscorides, un grec slujitor al mpratului roman Nero, n jurul anului 50 AD, a realizat cea mai veche clasificare cunoscut a plantelor i animalelor toxice Studiile medicale i toxicologice au evoluat pe vremea lui Galen (131-200AD) Paracelsus (1493-1541) a pus bazele dezvoltrii toxicologiei moderne prin recunoaterea relaiei dozrspuns

(1700) a publicat lucrarea Bolile muncitorilor i de aceea este considerat printele medicinii ocupaionale n 1761 Hill a observat o corelaie ntre cancerul nasal i prizarea tutunului n 1775 Percival Pott a stabilit o corelaie ntre ocupaia de coar i cancerul de scrot Orfila, un spaniol care a activat la Sorbona, este tatl toxicologiei moderne i a publicat n 1815 lucrarea: Un sistem general al toxicologiei sau Tratat asupra otrvurilor prezente n regnurile mineral, vegetal i animal, considerate n relaia lor cu fiziologia, patologia i jurisprudena medical Recunoaterea situsului de aciune al substanei numite curara de Claude Bernard (1813-1878) a constituit nceputul studiului modern al mecanismelor aciunii toxicelor
Ramazini

Curara- sub aceast denumire se gsesc trei tipuri de substane gsite n anumite plante din America de Sud. INGESTIE-nici un efect

PARENTERAL- n cantiti mici relaxant muscular n chirurgie

- n cantiti mari otrav Mecanism: blocheaz receptorii nicotinici (tip de receptori colinergici) din membrana postsinaptic a jonciunii neuromusculare

Ulterior cercetrile s-au dezvoltat exponenial, crescnd nivelul cunotinelor despre: chimia compuilor toxici, tratamentul otrvirilor, analiza toxicitii, modul de aciune a toxicelor i procesele de detoxifiere i evenimente moleculare specifice n procesul de otrvire
n 1962, Rachel Carson a publicat cartea The Silent Spring prin care s-a iniiat era modern a toxicologiei mediului

Definiie

Toxicologia este tiina care se ocup cu studiul substanelor toxice, adic acele substane care produc efecte duntoare atunci cnd sunt administrate accidental sau programat unui organism viu. Prin convenie, aceast tiin studiaz i vtmrile cauzate de efecte fizice ca: radiaii de diferite tipuri i zgomote. Toxicitatea nu este un eveniment molecular unic, ci o cascad de evenimente ncepnd cu expunerea, continund cu distribuia i metabolismul i sfrind cu interacia cu biomacromoleculele ( de regul proteine i acizi nucleici) i expresia toxicitii. Aceast secven poate fi micorat prin excreie i procesele reparatorii din organism.

Un efect advers este definit ca o modificare anormal, nedorit i duntoare ce urmeaz expunerii la o substan potenial toxic. Un efect poate fi considerat duntor atunci cnd produce: vtmri anatomice sau funcionale, modificri ireversibile n homeostazie sau susceptibilitate crescut la alte stresuri biologice i chimice, inclusiv bolile infecioase. Afectarea este influenat de starea de sntate a organismului. Se poate realiza o adaptare a organismului expus astfel nct s triasc normal, n ciuda unui efect ireversibil.

Conceptul de substan toxic este unul cantitativ, aproape orice substan fiind duntoare la unele doze i fr effect la doze mai sczute. ntre aceste limite exist o gam de efecte posibile, de la toxicitate cronic pe termen lung, la letalitate imediat. Aspirina (acidul acetilsalicilic) este un medicament relativ sigur i la dozele recomandate este utilizat de milioane de oameni. n acelai timp, folosirea cronic poate cauza efecte vtmtoare asupra mucoasei gastrice iar o doz n jur de 0,2-0,5 g/kg este fatal. Aproximativ 15% din morile accidentale prin otrvire accidental la copii se produc prin ingestie de aspirin. Importana dozei este bine ilustrat de metale care sunt eseniale n diet dar sunt toxice la doze ridicate. Astfel, fierul, cuprul, magneziul, cobaltul, manganul i zincul pot fi prezeni la nivele prea sczute (deficien), la un nivel adecvat (meninere) sau la nivele foarte ridicate (toxicitate).

Problema relaiei doz rspuns este fundamental n toxicologie. Pe de alt parte toxicitatea implic i aspecte biologice calitative, pentru c un compus poate fi toxic pentru o specie i relativ inofensiv pentru o alta. De exemplu tetraclorura de carbon este un hepatotoxic puternic pentru multe specii i relativ inofensiv pentru puii de gin, de asemenea unele rase de iepuri pot mnca Belladona fr probleme pe cnd alii nu pot.

Toxicitatea poate fi acut sau cronic i poate varia de la un organ la altul, dar i cu vrsta, motenirea genetic, sexul, dieta, starea fiziologic sau starea de sntate a organismului. Spre deosebire de animalele de experien, care sunt consangvinizate, variaia genetic este un factor foarte important n toxicitatea uman, deoarece populaia uman nu este consangvinizat i manifest o variaie genetic extins.

Doza letal medie (LD50) reprezint doza unic derivat statistic a unui compus chimic care poate cauza moarte n 50% dintr-o populaie data de organisme supuse unui set definit de condiii experimentale.

Ingestie intenionat Expunere ocupaional

Expunere ambiental
Expunere accidental

Cile majore de expunere sunt: cutanat (topic) pulmonar (inhalaie) gastrointestinal (ingestie) n general, pentru o concentraie dat a unei substane la un timp dat, inhalaia este mai nociv dect ingestia, care, n schimb, este mai duntoare dect expunerea topic. Expunerea ochiului poate avea consecine serioase.

Absorbia cutanat
n general subiecii nu realizeaz c produsele chimice pot penetra pielea intact i sntoas. Printre chimicalele ce sunt absorbite prin piele se pot enumera: anilina, acidul ciandidric, unii hormoni sterozi, compuii organomercurici, nitrobenzenul, compuii organofosforici i fenolul. Fenolul i clorura metilmercuric pot fi letale dac sunt absorbite chiar pe suprafee foarte mici de ordinul ctorva cm ptrai. Dac mbrcmintea de protecie este deteriorat i agentul toxic intr n contact cu esutul cutanat, absorbia se va produce i mai repede dect la nivelul pielii neprotejate, pentru c substana nu poate fi nlturat i contactul este prelungit.

Inhalaia particulelor depinde de mrimea i forma lor. Cu ct sunt mai

mici, cu att pot ptrunde mai uor n tractul respirator. Pulberile cu un diametru aerodinamic efectiv ntre 0,5-7 microni pot persista n alveole i bronchiole dup inhalare. Cele cu diametre aerodinamice efective mai mari de 1 micron tind s fie expirate, dar o fracie semnificativ poate persista n alveole i cauza efecte nocive. Particulele inhalate pot penetra n intestine. Diametrul aerodinamic efectiv=diametrul n micrometri al unei particule sferice de densitate unu care circul cu aceeai vitez ca i particula luat n considerare. Pulberile cu diametru de peste 10 microni fie nu penetreaz plmnii, fie intr n brohiole i bronhii unde cilii creeaz un flux de mucus, care le returneaz n faringe i de acolo n esofag. Procesul se numete mecanism de clearance mucociliar. Din esofag pulberile ajung n intestine i pot provoca otrvire ca i cum ar fi fost ingerate. O parte semnificativ de praf inhalat const din microorganisme care pot provoca infecii bacteriene. Prezena fungilor i a sporilor lor poate fi asociat cu rspunsurile de hipersensibilitate sau cu micotoxinele care pot avea o gam larg de efecte incluznd att cancerul ct i cele endocrine. Ca i n cazul hranei, particulele inhalate ajunse n intestin, l pot afecta pe acesta sau pot fi absorbite direct, genernd efecte sistemice.

Iritarea fizic produs de particulele de praf sau fibre poate genera efecte adverse dar cele mau multe efecte depind de solidele dizolvate. De o deosebit importan sunt particulele de azbest, care se pot cantona n plmni i dei sunt insolubile pot provoca fibroz i cancer. Unele particule insolubile ca praful de crbune i de dioxid de siliciu provoac fibroza plmnilor, care conduce la probleme respiratorii i la emfizem. Aceast boal poate surveni consecutiv oricrei inflamaii cronice a plmnilor cauzat de substane iritante cum ar fi srurile metalice. Volumul fluxului (volumul de aer inspirit i expirat cu fiecare respiraie) crete cu exerciiul fizic, astfel c absorbia unui compus toxic este corelat cu intensitatea muncii fizice. De aceea, uneori, citadinii care triesc n aer poluat sunt sftuii s evite activitile fizice pe ct posibil.

Ingestia substanelor potenial toxice din hran, butur sau

medicamente este sub control individual ntr-o oarecare msur i prin folosirea bunului sim putem minimaliza riscurile associate. n acest caz, expunerea poate fi continu, sau poate fi repetat la intervale ntr-o perioad de timp; consecinele diferitelor tipuri de expunere la aceeai cantitate de substan potenial toxic pot varia considerabil n privina gravitii. n general, expunerea continu la un anumit toxic genereaz efecte mai grave dect expunerea intermitent la aceeai concentraie de toxic la intervale separate de suficient timp pentru a permite un grad de recuperare. Totui, indiferent de tipul de expunere la cantiti mici de substane toxice, pot apare efecte grave, ca de exemplu scderea numrului de celule nervoase la persoanele supuse riscului. Un compus chimic se poate acumula atunci cnd absorbia este mai mare dect excreia; aceast situaie se ntlnete n cazul substanelor care manifest un grad ridicat de solubilitate n lipide cu stabilitatea chimic. Ionii de Pb se acumuleaz n oase, unde nlocuiesc ionii de calciu, similari dpdv chimic. Cnd au loc traumatisme osoase sau n timpul sarcinii, ionii de plumb intr n fluxul sanguine i pot otrvi persoana sau ftul, dei iniial nu au produs efecte. Ionii fluorur de asemenea se acumuleaz n oase i de aceea fluorinarea apei trebuie s se fac cu grij.

Toxicitatea poate varia de pn la 10 ori n funcie de ruta de administrare. Metodele experimentale de administrare prin injecie dau rezultate variabile n funcie de tip: intravenous (IV), intraperitoneal (IP), Intramuscular (IM) subcutan (SC)

Termeni utilizai n toxicologie

A. Modurile de aciune ale toxicului Toxicologie biochimic i molecular, care studiaz enzimele care metabolizeaz xenobioticele, generarea intermediarilor reactivi, interacia xenobioticelor sau a altor metabolii cu macromoleculele, expresia genelor i ci de semnalizare n intoxicaie Toxicologie comportamental, studiaz efectele substanelor toxice asupra comportamentului animalelor i oamenilor, care este expresia integrat final a funciei nervoase n animalul intact. Toxicologia nutriional, se refer la efectele dietei asupra expresiei toxicitii i la mecanismele acestor efecte Carcinogeneza studiaz evenimentele chimice, biochimice i moleculare care conduc la apariia cancerului Teratogeneza studiaz evenimentele chimice, biochimice i moleculare care conduc la afectarea dezvoltrii embrionare Mutageneza studiaz efectele toxice asupra materialului genetic i transmiterea acestora la urmai Toxicitatea organelor ia n considerare efectele la nivelul funcionrii organelor (neurotoxicitate, hepatotoxicitate, nefrotoxicitate, etc.).

B. Msurarea nivelului compuilor toxici i a toxicitii Toxicologia analitic este o ramur a chimiei analitice care se ocup cu identificarea i testarea substanelor chimice toxice i metaboliii lor n materialele biologice i ambientale Testarea toxicitii implic folosirea sistemelor vii pentru a estima efectele toxice. Acoper o gam de teste de la cele pe termen scurt pentru genotoxicitate ca testul Ames i tehnicile de culturi celulare pn la folosirea animalelor intacte pentru o serie de teste de la toxicitate acut la toxicitatea cronic pe parcursul vieii. Dei termenul de teste biologice este folosit pentru a descrie folosirea organismelor vii pentru a cuantifica cantitatea unui toxic particular, se folosete frecvent pentru a descrie orice test de toxicitate in vivo. Patologia toxicologic este ramura patologiei care se ocup cu efectele agenilor toxici care se manifest ca modificri n morfologia organelor, esuturilor, celulelor i organitelor Studiile structur-activitate se ocup cu studiul relaiei dintre proprietile fizico-chimice ale unui compus chimic i toxicitate. Aceast relaie se folosete pentru predicia toxicitii Biomatematica i statistica analizeaz datele, determin semnificaia, genereaz modele predictive i estimeaz riscul Epidemiologia se ocup cu relaia dintre expunerea chimic i morbiditatea uman n populaie

C. Toxicologia aplicat. Aceasta include diferite aspecte ale toxicologiei i se aplic la dezvoltarea de noi metodologii sau substane toxice noi. Are mai multe ramuri: 1.Toxicologia clinic-diagnosticul i tratamentul otrvirii oamenilor 2.Toxicologia veterinar-diagnosticul i tratamentul otrvirii animalelor -posibila transmisie a toxicelor la om prin intermediul produselor alimentare 3. Toxicologie legal- se ocup cu aspectele medico-legale, incluznd detecia substanelor toxice n eantioane clinice i de alte tipuri 4. Toxicologia mediului-studiaz dinamica substanelor toxice i a metaboliilor acestora i produii de degradare n mediu i efectul contaminanilor asupra indivizilor i, n special, al populaiilor. 5. Toxicologia industrial este un domeniu specific al txicologiei mediului , care se ocup de mediul de munc i constituie o parte a igienei industriale.

D. Clasele de chimicale utilizate. La ora actual se pune accent pe aspectele toxicologice ale dezvoltrii de noi chimicale de uz commercial. Aceste substane chimice pot fi sintetice sau produi naturali. Acetia din urm pot fi: insecticide, piretrine, medicamente de uz clinic, digitaloide, droguri, etc. Chimicale pentru agricultur: insecticide, ierbicide, fungicite, rodenticide, n care toxicitatea fa de organismele int este de dorit, n timp ce cea fa de speciile neint este de evitat. Medicamentele de uz clinic sunt studiate de chimia i farmacologia farmaceutic Drogurile sunt compui chimici cu aciune n principal psihotic, care produc dependen i toxicitate. Folosirea lor, n general este ilegal, dar unele au semnificaie clinic cnd sunt utilizate sub control medical i correct. Aditivii din hran pot fi toxici. Compui chimici industriali: se controleaz expunerea la cei toxici Compui naturali: fitotoxine, micotoxine i compui naturali existeni n mediu. Folosirea fitoremediilor i a suplimentelor alimentare a devenit ngrijortoare pentru toxicologi i pentru cei ce se ocup de aspectele legale, nu numai pentru eficacitatea uneori discutabil dar i pentru poteniala toxicitate. Produii de combustie. Sunt o clas important de compui toxici, generai din arderea combustibililor i a altor chimicale industriale.

E. Reglementri toxicologice. Se refer la formularea legilor, a reglementrilor legale cu scopul de a minimiza efectul chimicalelor asupra sntii umane i a mediului. Acestea pot mbrca: Aspecte legale : legi, agenii guvernamentale: de protecia mediului, pentru hran i medicamente, pentru siguran i sntate ocupaional, etc. Evaluarea riscului: definirea riscurilor, riscuri poteniale, raportul risc-beneficiu. Evaluarea riscului este urmat de comunicarea acestuia i de managementul riscului.

Efectele adverse pot fi locale sau sistemice.

Efectele locale se nregistreaz la situsul de expunere. Substanele corozive acioneaz ntotdeauna iar cele iritante uneori local. Cele mai multe substane care nu sunt nalt reactive sunt absorbite i distribuite n organismul afectat determinnd apariia unor efecte sistemice, la nivelul unor organe sau esuturi distincte fa de situsulde absorbie. Organul int nu este n mod necesar organul cu maxim acumulare. Unele substane produc att efecte locale ct i sistemice. De exemplu, tetraetilul de plumb produce vtmri ale pielii la contact i este apoi absorbit i transportat la sistemul nervos central unde determin vtmri ulterioare.

Efectele adverse pot apare imediat sau ntrziat. Printre cele mai ntrziate efecte sunt cancerele, carcinogeneza putndu-se desfura timp de 20 de ani i mai bine pn cnd se pot descoperi tumorile. De exemplu, unele femei tinere ale cror mame au luat dietilstilbestrol n timpul sarcinii pentru a preveni avortul dezvolt cancere vaginale. Efectele adverse pot fi reversibile sau ireversibile. La nivelul ficatului, care are o capacitate de regenerare extraordinar, multe efecte adverse sunt reversibile i se poate nregistra recuperare complet. Pentru sistemul nervos central, n care regenerarea tisular este limitat sever, cele mai multe efecte adverse sunt ireversibile iar recuperarea este limitat. Efectele carcinogenice i teratogenice sunt de asemenea ireversibile.

INTERACII CHIMICE Substanele toxice pot s manifeste n organismul uman, n urma interaciilor dintre ele: un efect aditiv: cazul pesticidelor organoclorurate un efect sinergic (multiplicativ): efectul a dou substane chimice ce acioneaz concomitant este mai mare dect suma efectelor lor cnd acioneaz singure. Fibrele de azbest i fumatul acioneaz mpreun crescnd riscul cancerului de plmn cu un factor de 40. un efect de potenare: o substan care nu este toxic, n prezena unui alt compus, l face mai toxic pe acesta din urm. De exemplu: izopropanolul, la concentraii care nu sunt toxice pentru ficat, crete vtmarea ficatului dat de tetraclorur de carbon. un efect antagonic: dou substane toxice ce acioneaz mpreun au efecte mai sczute comparative cu cele individuale

Tolerana este o descretere a sensibilitii fa de o expunere chimic ulterioar sau la o substan nrudit structural. De exemplu, cadmiul produce toleran n unele esuturi prin inducerea metalotioneinei (protein de legare a metalelor). Totui, complexele cadmiu-metalotionein se acumuleaz n rinichi unde determin nefrotoxicitate Rezistena este aproape lipsa de sensibilitate complet la un compus chimic. Aceasta reflect de obicei capacitatea metabolic de a inactiva i elimina compusul chimic i metaboliii si rapid.

Curba clasic doz-rspuns

Clasificarea substanelor n acord cu LD50 este grosier i depinde de condiiile experimentale i ruta de expunere

Acest indice nu furnizeaz informaii despre dozele subletale, despre forma curbei doz-rspuns.

Dozele normale sunt exprimate n mgkg-1corp, dar pot fi exprimate i ca mgcm-2 suprafa a corpului, deoarece n anumite cazuri se poate realiza o extrapolare ntre animale de diferite mrimi i ntre specii de mamifere testate i oameni. Pentru biocide, toxicitatea selectiv este proprietatea cheie, astfel nct s poat omor duntorii cu vtmri minime fa de organismele neint. De aceea se urmrete minimizarea cantitii de pesticide folosite i direcionarea lor aplicativ este crucial pentru a evita afectarea animalelor ne-int. Testarea toxicitii pe animale de laborator s-a fcut pentru extrapolarea rezultatelor la om. Raportat la masa corporal, se consider c oamenii sunt de 10 ori mai sensibili dect roztoarele, iar dac raportarea se face la suprafaa corpului, sensibilitatea este identic cu cea a mamiferelor de laborator. Cunoscnd aceste relaii, este posibil s se estimeze expunerea la un compus care poate fi tolerat de oameni.

Clase de compui toxici compui naturali substane chimice de sintez organice sau anorganice folosite n scop social subproduse i deeuri ale proceselor industriale n comformitate cu cile de expunere, toxicele se gsesc n hran, aer, ap

Dinamica substanelor toxice n mediu

Substanele eliberate n mediu sunt susceptibile la degradarea chimic, proces stimulat de radiaiile ultraviolete. Dei prin diseminarea n mediul abiotic are loc o diluare a toxicelor, prin transferul n organismele vii are loc concentrarea acestora prin bioacumulare. Compuii lipidici cu un grad oarecare de solubilitate sunt preluai de organisme i dac nu sunt metabolizai rapid, persist n esuturi sufficient de mult pentru a putea fi preluai la nivelul trofic urmtor. La fiecare nivel trofic, toxicul lipofil tinde s fie reinut n timp ce hrana este digerat, utilizat metabolic i produii inutile sunt excretai, ceea c educe la concentrarea substanei toxice.

Trasportul substanelor toxice se face prin lanurile trofice acvatice i terestre, dei n primul caz membrii superiori ai lanului, respectiv petii, pot acumula cantiti mari de toxice direct din mediu. Aceast acumulare se produce datorit contactului intim dintre filamentele branhiilor i ap i volumului mare de ap filtrat la nivelul lor. Un compus toxic cu coeficient de partiie mare ntre membranele lipidice i ap este preluat inevitabil

METODE BIOCHIMICE I MOLECULARE N TOXICOLOGIE

Culturi de celule: suspensie i aderente Toxicitatea culturilor pe termen scurt se urmrete prin:

Testarea pe termen lung a toxicitii celulare se face prin: msurarea creterii celulare, apoptozei i/sau necrozei ncorporarea precursorilor radioactivi n ARN, ADN i proteine testarea funciilor celulare specializate

Radioimunoassay ELISA Anticorpii inhibitori sunt folosii n studiul metabolismului xenobioticelor, de regul pentru a estima contribuia unei enzime particulare ntr-un amestec multienzimatic ( de exemplu determinarea contribuiei izoformelor individuale ale cit P450 la metabolismul general al unui xenobiotic n preparate microsomale.