FACTORII CARE INFLUENEAZ VITEZA PROCESELOR DE FERMENTAIE Metaboliii sunt rezultatul reaciilor enzimatice din cadrul diferitelor ci metabolice.

Viteza reaciilor enzimatice, ca i viteza reaciilor chimice, este influenat de o serie de factori, dintre care cei mai importani sunt: Compoziia mediului de cultur i concentraia substratului limitativ; Temperatura i p !ul mediului; Concentraia o"i#enului dizolvat; $ntensitatea amestecrii. Cunoaterea modului de acionare %cu alte cuvinte efectul acestor factori& asupra reaciilor enzimatice permite stabilirea condiiilor optime pentru desfurarea procesului fermentativ. ' caracteristic important a proceselor fermentative const (n faptul c modificarea unui sin#ur parametru atra#e dup sine modificarea celorlali, put)nd avea o influen profund asupra desfurrii procesului. a. Influena concentraiei substratului limitativ i compoziia mediului de cultur $nfluena concentraiei substratului limitativ asupra vitezei de cretere este redat de ecuaia Monod: C = ma" S K S + CS *n variaia vitezei specifice de cretere funcie de concentraia substratului limitativ se pot deosebi trei cazuri: +. concentraia substratului limitativ, (n mediu sau celul, este foarte mare comparativ cu constanta de asimilare a substratului, adic C S K S , ceea ce are ca efect e#alitatea dintre viteza specific de cretere i viteza ma"im, e#alitate care se menine p)n c)nd are loc o scdere drastic a concentraieisubstratului limitativ; ,. concentraia substratului limitativ are valori comparabile cu valoarea constantei de asimilare a substratului, adic C S K S = ma" , -. concentraia substratului limitativ este foarte mic, C S K S viteza procesului fiind ma" CS . proporional cu concentraia substratului limitativ, = KS Variaia concentraiei de produs %metabolit& funcie de concentraia substratului limitativ este redat (n fi#ura +. .e remarc faptul c la adu#area continu de substrat se evit ocul provocat de adu#area (n trepte, oc datorat inhibiiei de substrat. /le#erea variantei de adu#area continu presupune folosirea unui biosenzor adecvat, care s funrnizeze informaii referitoare la concentraia substratului limitativ din mediu de fermentaie, (n scopul meninerii acestuia (n limitele prescrise.

Fig.1. Influena modului de furnizarea a substratului limitativ asupra procesului fermentativ $nfluen semnificativ asupra vitezei reaciilor enzimatice au i electroliii din mediu, care re#leaz permeabilitatea membranei celulare, natura sursei de carbon, concentraia componenilor mediului de cultur, care influeneaz viteza de cretere, de respiraie , respectiv de producere de metabolit. *n multe cazuri, orientarea biosintezei spre un anumit produs se face cu a0utorul precursorilor prezeni (n mediul de cultur. 1e e"emplu, dac se dorete obinerea de 2enicilin 3 drept precursor se utilizeaz acid fenilacetic, (n schimb pentru 2enicilina V este necesar prezena acidului feno"iacetic. b. Influena temperaturii Temperatura este unul dintre cei mai importani parametri fizici care intervin (n procesele biochimice, deoarece influeneaz puternic activitatea microor#anismelor i a enzimelor implicate, iar modificrile vitezei de reacie au loc (ntr!un interval limitat de temperaturi. Viteza reaciilor enzimatice se poate dubla la o diferen de temperatur de +4 4C, cu condiia ca (n acest interval enzima catalizatoare s nu se dezactiveze.reaciile biochimice au o temperatur optim, corespunztoare activitii enzimatice ma"ime, temperatur care difer funcie de natura enzimei, aa cum reiese din fi#ura ,.

Fig.2. Efectul temperaturii asupra activitii enzimatice .e remarc faptul c activitatea enzimatic este prezent (ntr!un interval redus de temperaturi %apro".,44C&. 5"istena unei temperauri optime este rezultatul a dou procese contrare, dar care se produc simultan cu creterea temperaturii, i anume: ! creterea vitezei reaciei biochimice, prin creterea valorii constantei de vitez, 6 i ! creterea vitezei de inactivare termic a enzimei, datorit denaturrii proteinelor, a apoenzimelor ce intr (n componena enzimelor.

Temperatura optim a reaciilor biochimice depinde de natura enzimelor care catalizeaz reacia. .pre e"emplu, pentru obinerea de antibiotice valorile optime ale temperaturii sunt: 1enumire Micror#anism Temperatura Temperatura de inactivare, 4 antibiotic productor optim,4C C 2enicilin enicillium notatum ,7 -4 .treptomicin Streptomices griseus ,8 -4 9ifamicin Streptomices rifam!ces +: ,; Temperatura optim a transformrilor biochimice poate depinde i de etapa procesului biochimic. .pre e"emplu, (n cazul enicillium c"r!sogenum, temperatura optim (n etapa de cretere celular este de -4 4C, (n timp ce (n etapa de producere este ,<,;4C. *n practica industrial separarea fazelor fiziolo#ice este aproape imposibil, ceea ce face ca procesele s fie conduse la valori de compromis ale temperaturii, care nu permite atin#erea valorilor ma"ime pentru viteza specific de cretere, respectiv de producere, dar conduc la performane acceptabile. *n cazul fun#iilor enicillium productoare de 2enicilin, temperatura de operare este de ,7=+4C. Temperaturi de lucru sub valoarea optim pot conduce la o pierdere reversibil a activitii enzimatice, (n timp ce temperaturile superioare induc un proces ireversibil prin denaturarea proteinelor ce intr (n componena enzimelor. *n cazul proceselor de bioconversie, care se desfoar (n prezena enzimelor %biocatalizatori&, performanele difer pentru enzima liber respectiv cea imobilizat, prin imobilizare cresc)nd stabilitatea termic. >n e"emplu (n acest sens este redat (n fi#. -.

Fig.#. Efectul temperaturii asupra glucoamilazei 1eoarece mofdificarea temperaturii (n procesele industriale este e"trem de redus, influena acesteia asupra parametrilor fizici %densitate, viscozitate, cldur specific etc&este foarte redus, put)ndu!se ne#li0a. c. Influena pH-ului $nfluena p !ului este comple", deoarece activitatea enzimatic este ma"im la o anumit valoare a p !ului mediului. /baterile de la valorile optime pot conduce la pierderea activitii prin denaturarea ireversibil a proteinelor. Variaiile mici ale p !ului acioneaz reversibil asupra activitii. Valoarea optim este determinat de natura enzimei, temperatura de lucru, compoziia mediului, prezena inhibitorilor. *ntr!un ciclu de fermentaie, valoarea optim a p !ului (n faza de cretere este diferit de cea din faza de producere de metabolit. 1in aceste considerente, (n cazul proceselor continue fermentaia trebuie realizat cel puin (n dou stadii, (ncare s se asi#ure valori optime pentru temperatur i p , (n vederea obinerii unor productiviti ma"ime.

d. Influena oxigenului '"i#enul 0oac un rol esenial (n metabolismul aerob de producere a ener#iei, ca acceptor final de electroni i protoni rezultai (n urma reaciilor biochimice de o"idare. Totalitatea reaciilor (n trepte carea realizeaz transportul electronilor (n final la o"i#en %(n cazul proceselor aerobe& sau la unele substane or#anice %(n cazul proceselor anaerobe& alctuiesc mecanismul de respiraie celular. Cel de!al doilea mecanism productor de ener#ie este fermentaia, care const (n procese biochimice redo" (n care diferii compui or#anici acioneaz at)t ca donori c)t i ca acceptori finali de electroni. Ca urmare, metabolismul ener#etic se poate realiza (n prezena sau absena o"i#enului; funcie de coninutul de o"i#en al mediului, cele dou forme ale metabolismului ener#etic %respiraie i fermentaie& se desfoar cu intensiti diferite %fi#ura <&. ?a un coninut de o"i#en mai mic de -@ din concentraia de saturaie au loc numai procese de fermentaie, (n timp ce la concentraii mai mari de +4@ numai prin respiraie.

Comportarea diferitelor micro!or#anisme fa de o"i#en depinde de tipul metabolismului ener#etic i ofer indicaii cu privire la Figura $. Forme ale metabolismului energetic enzimele pe care le posed. 2e l)n# microor#anismele aerobe i anaerobe e"ist o cate#orie de microor#anisme facultativ aerobe, care au capacitatea de a!i modifica metabolismul (n funcie de coninutul de o"i#en al mediului de cultur. *n acelai timp, metabolismul aceluiai microor#anism poate varia de la etapa de acumulare de biomas %cretere celular& la cea de producere de metabolit, atr#)nd dup sine modificarea naturii procesului biochimic i a necesarului de o"i#en. Aecesarul de o"i#en al unei culturi microbiene depinde pe l)n# natura microor#anismului i de natura sursei de carbon i ener#ie. >n e"emplu (n acest sens este redat (n tabelul urmtor: Microor#anism .ubstrat Aecesar de o"i#en, # ',B+44 # celule bacterii n!parafine +:, levuri n!parafine +:; #lucide 7; Consumul de o"i#en poate fi e"primat cu a0utorul vitezei de consum de o"i#en 9',, care reprezint cantitatea de o"i#en consumat (n unitatea de timp i pe unitatea de mas microbian sau pe unitatea de volum de mediu de cultur. Viteza de consum al o"i#enului depinde de natura, v)rsta i morfolo#ia microor#anismelor, natura substratului i condiiile de fermentaie. C)teva e"emple sunt date (n urmtorul tabel: Microor#anism mmoli ',BlCh mmoli ',B# celuleCh Esc"eric"ia coli 8!D Streptom!ces griseus +8 -,4 enicillium cr!sogenum ,4!-4 -,: %spergilllus niger -,4 ! pentru acid citric ,D ! pentru E!amilaz 87

%cetobacter sp. :4 %zobacter sp. +4!+8 Sacc"arom!ces cerevisiae D,4 Viteza de consum a o"i#enului este minim (n etapa de la#, dup care, crete atin#)nd valoarea ma"im (n faza de cretere e"ponenial rm)n)nd la aceast valoare p)n la atin#erea fazei staionare c)nd redevine minim. Viteza de cretere a numeroase microor#anisme este accelerat semnificativ de intensificarea aerrii, p)n la o anumit valoare %fi#.8.&, dup care are loc o sta#nare sau chiar o reducere, fenomen e"plicat prin inhibiia produs de o"i#enul din mediu %la concentraii mari& asupra unor procese metabolice. Cunosc)nd dependena dintre activitatea microor#anismelor i concentraia de o"i#en dizolvat, acumularea de biomas poate fi favorizat prin modificarea pro#ramat a #radului de aerare.

Figura &. Influena aerrii asupra vitezei de cre'tere a microorganismelor 1ac se consider c i o"i#enul este un substrat, viteza specific de cretere a masei celulare funcie de concentraia de o"i#en solubilizat se poate e"prima cu a0utorul ecuaiei: C( , = ma" K ( , + C( , 2entru valori ale concentraiei de o"i#en mai mici de o anumit valoare %definit concentraie critic C',critic& = ma" C ( , critic K (, .cderea concentraiei de o"i#en dizolvat sub valoarea critic are ca efect perturbarea metabolismului microbian. Valoarea concentraiei critice este specific fiecrui microor#anism i este funcie de comdiiile de cultur, aa cum reiese din tabelul urmtor: Microor#anism T,4C C', critic, mmolBl Esc"eric"ia coli +8.8 4.44-+ -;.4 4.44D -;.D 4.44D%zobacter sp -4 4.4-8 Sacc"arom!ces sp ,4 4.44-; -4 4.44<4 -<.D 4.44<7 enicillium ,< 4.4,, cr!sogenum Ca i in cazul influenei temperaturii sau a p !ului, necesarul de o"i#en (n etapa de acumulare de biomas poate s difere semnificativ de necesarul din etapa de producere de metabolit. >n e"emplu elcovent (n ceea ce privete efectul pe care (l poate avea concentraia de o"i#en dizolvat asupra unui microor#anism este cazul bacteriei )revibacterium flavum pentru care concentraia cristic de o"i#en este de 4,4+ m#Bl. 1ac o"i#enul este absent, adic se lucreaz (m condiii anaerobe, microor#anismul produce acid lactic, la o foarte slab aerrar alturi de acid lactic se

obine i acid succinic. 2entru o concentraie mai mic dec)t concentraia critic se obin un amestec de aminoacizi %fenilalanin, valin, izoleucin& (n timp ce dac se lucreaz la o concentraie mare de o"i#en se obin acid #lutamic i acid E!ceto#lutaric. >n alt indicator al modului de desfurare al procesului de biosintez este coeficientul de respiraie %C9&, care reprezint raportul molar dintre dio"idul de carbon format i o"i#enul consumat (n reacia biochimic. Coeficientul de respiraie %C9& este o variabil important a proceselor aerobe. Valori ale coeficientului de respiraie pentru o"idarea complet a principalelor surse de carbon sunt redate (n urmtorul tabel: .ursa de carbon Formula brut n C9 idrai de carbon Cn ,n'n n +,4 /lcani Cn ,nG, n ,nB-nG+ C < + 4,8 C+4 ,, + 4,78 4 /lcooli Cn ,nG,' n 4,7; C -' + 4,7; C, 8' , 4,7; /cizi carbo"ilici Cn ,n', n ,nB-n!+ ! C, -' , , 4,D C- 8'!- 4,;8 ! ?actat C- 8' +,4 ! Citrat C7 ;' ; +,-'"alat C, '!< <,4 3licerin C- D'4,;8 Comparativ cu valoarea acestui raport corespunztor unei anumite reacii biochimice de o"idare a substratului, o valoare mai mic dec)t C9 indic faptul c o"i#enul s!a consumat nu numai datorit respiraiei, ci i (ntr!o serie de reacii secundare de formare a unor compui o"i#enai. ' valoare mai mare dec)t C9 su#ereaz faptul c o parte din o"i#enul necesar este furnizat de substratul utilizat. ' cultur de microor#anisme consum (n procesul de respiraie o cantitate de c)teva ori mai mare dec)t cea corespunztoare concentraiei de saturaie %echilibru&; de aceea se impune transferul continuu de o"i#en din faza #azoas (n mediul de cultur. Viteza procesului de transfer este (n multe cazuri un factor determinant (n proiectarea reactoarelor biochimice. Aecesarul de o"i#en al culturilor de microor#anisme pune problema dizolvrii o"i#enului (n mediu cu o vitez care s corespund vitezei ma"ime de cretere. 1eoarece solubilitatea o"i#enului (n ap este redus, (n vederea intensificrii dizolvrii, barbotarea aerului se combin cu amestecarea mecanic. Viteza de dizolvare a o"i#enului crete cu turaia a#itatorului, respectiv cu debitul de aer barbotat. 9olul amestecrii este de a dispersa bulele de aer (n masa de fermentaie, intensific)nd transferul de mas al o"i#enului la biomas. 1ei turaia a#itatorului are o influen benefic, valoarea acesteia este limitat, datorit pericolului de distru#ere mecanic a celulelor de microor#anisme. Viteza cu care microor#anismul consum o"i#enul dizolvat este dependent de #radul de dezvoltare a biomasei, viteza de cretere a celulelor, natura i concentraia sursei de carbon i ener#ie, a sursei de azot i microelemente, cu alte cuvinte de compoziia mediului de cultur i de nivelul concentraiei de o"i#en. 1ac o"i#enul dizolvat se afl (n concentraia mai mare dec)t concentraia critic, viteza de consum nu depinde de concentraia o"i#enului dizolvat, dac (ns concentraia este mai mic dec)t cea critic, scderea vitezei de consum va fi semnificativ. 5ficiena aeraiei se poate msura fie (n funcie de acumularea de biomas, fie funcie de viteza de eliberare a dio"idului de carbon.