Sunteți pe pagina 1din 0

R-Biopharm Rhne

Micotoxine
Manual Tehnic
G
B
0
2
/
V
1
2 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
3
Acesata publicatie nu poate reprodusa, salvata intr-un program pentru a copiata, sau transmisa in orice fel:
electronic, mecanic, fotocopiat, inregistrat etc, fara permisiunea editorului (R-Biopharm Rhne Ltd, Block 10, Todd
Campus, West of Scotland Science Park, Acre Road, Glasgow, Scotland, G20 0XA).
Limita de incredere/ Garantie:
Autorul a depus eforturi mojore in pregatirea acestui manual, dar nu garanteaza in totalitate acuratetea sau
completitudinea continutului si nu-si asuma responsabilitatea pentru eventuale erori. Reprezentantii de vanzari
nu ofera garantie materialelor scrise. Sfaturile si strategiile continute nu pot i indeplinite in ecare situatie; ar
trebui consultat un profesionist in asemenea cazuri. Autorul nu poate condamnat pentru orice costuri sau daune
comerciale, incluzand incidente sau alte daune.
Pentru informatii generale despre produse si servici sau suport tehnic, va rog sa ne contactati:
Sau distribuitorul:
Diamedix Impex SA
Str. Intrarea Sectorului nr. 20
Bucuresti
Tel/Fax: 021/66.888.66/ 67 / 68 / 69 / 70
Mobil: 0723955223
ofce@diamedix.ro
www.diamedix.ro
4 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Continutul
1. Micotoxine - Introducere 5
2. Testarea Micotoxinelor 6
2.1 Legislatie 6
2.2 Prelevarea probelor 6
2.3 Detectia micotoxinelor 7
2.4 Principiul coloanelelor de
imunoanitate 7
2.5 Principiul derivatizarii 8
2.6 Derivatizarea aatoxinelor 8
2.7 Produse disponibile la
R-Biopharm Rhne 9
3. Introducere la Terminologia Utilizata
in Detectia Micotoxinelor 10
3.1 Prescurtari utilizate in detectia
micotoxinelor 10
3.2 Nivelul micotoxinelor 10
3.3 Greutate 11
3.4 Volum 11
3.5 Dilutii 12
4. Manipularea Micotoxinelor 13
4.1 Risc 13
4.2 Decontaminare 13
5. Curbe de Calibrare 14
5.1 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia aatoxinelor 15
5.2 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia deoxinivalenolului 16
5.3 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia fumonisinelor 17
5.4 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia ochratoxinei 17
5.5 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia toxinelor T-2 si HT-2 18
5.6 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia zearalenonei 18
6. Cum Se Fortica O Proba 19
7. Raportarea Rezultatelor 20
8. Determinarea Concentratiei
Toxinei Prezente 21
8.1 AFLAPREP Un exemplu 22
8.2 DONPREP Un exemplu 22
8.3 EASI-EXTRACT AFLATOXIN
Un exemplu 22
8.4 EASI-EXTRACT T-2 & HT-2
Un exemplu 22
8.5 EASI-EXTRACT ZEARALENONE
Un exemplu 23
8.6 FUMONIPREP Un exemplu 23
8.7 OCHRAPREP Un exemplu 23
9. Validarea unei Metode 24
9.1 Precizia 24
9.2 Repetabilitatea (r) 24
9.3 Reproductibilitatea (R) 24
10. Imbunatatirea Recuperarii 25
11. Imbunatatirea Cromatogramelor 26
11.1 Zgomot de fundal crescut 26
11.2 Contaminarea fazei mobile 26
11.3 Contaminarea de la pompa 26
11.4 Reproductibilitatea scazuta a ariei
varfurilor 26
11.5 Extinderea si impartirea varfurilor 26
11.6 Varfuri fantoma 27
12. Probleme la HPLC 28
12.1 Introducere 28
12.2 Cand se ajusteaza faza mobila 29
12.3 Solventi si faza mobila 30
12.4 Pompa 31
12.5 Coloana si incalzirea coloanei 33
12.6 Detector 33
12.7 Indepartarea bulelor din celula de
detectie 35
12.8 Curatarea celulei de detectie fara
dezasamblare 35
12.9 Prevenirea bulelor de aer 36
12.10 Mentenanta detectorilor de
uorescenta 36
13. Glosar 37
5
Micotoxine - Introducere
Micotoxinele sunt compusi chimici produse de
anumiti fungi. Producerea are loc in anumite
conditii de umiditate si temperatura si sunt
in general asociate cu recolta contaminata cu
mucegaiuri. Nu toti fungii produc mucegaiuri;
chiar si aceia care produc micotoxine se intampla
sa nu le produca uneori.
Exista multe micotoxine, dar numai o parte din
ele se gasesc in alimente si furaje. Majoritatea
micotoxinelor sunt stabile din punct de vedere
chimic lucru care le permite supravietuirea in
timpul depozitarii si procesarii la temperaturi
inalte, sau la inghet. Cele care apar in alimente
au un impact major asupra sanatatii oamenilor
si pot cauza pierderi economice semnicative in
agricultura sau in cresterea animalelor.

Micotoxinele sunt responsabile de o multime de
efecte toxice datorita structurilor chimice diferite.
Efectele acute apar in urma consumarii alimentelor
puternic contaminate si aceste incidente apar
in special in tari slab dezvoltate unde controlul
toxinelor este limitat. Efectele cronice sunt
cauzate de acumulari ale toxinelor in organism
de-a lungul unei perioade de timp indelungate si
pot dauna sanatatii populatiei. O parte din cele
mai cunoscute micotoxine sunt cencerigene,
genotoxice sau pot afecta rinichii, catul sau
sistemul imunitar.
1
6 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Testarea Micotoxinelor
2.1 Legislatie
Legislatia pentru micotoxine este in continua
schimbare in ceea ce priveste modul de prelevare a
probelor, metoda de testare si precizia rezultatelor.
Numarul de produse si micotoxine acoperite de
legislatia EU este in continua crestere.
2.2 Prelevarea probelor
Micotoxinele sunt distribuite heterogen in
produsele contaminate. Principalul scop al
prelevarii este obtinerea unei probe reprezentative
pentru lotul din care a fost recoltata. Pentru a
obtine o proba reprezentativa este recomandata
prelevarea unui numar mare de probe de greutate
mica ca in imaginea de mai jos.
Acestea sunt cateva din sursele de variatie atunci
cand se preleveaza o proba pentru analiza
micotoxinelor:
Prelevarea si sub-prelevarea
Pregatirea probei
Analiza
Pentru mai multe informatii cu privire la planul de
prelevare: http://eur-lex.europa.eu/en/index.htm.
Exista si un Sampling Advice booklet for
Mycotoxins disponibil la Food Standards Agency
in UK, care pune la dispozitie un ghid simplu
pentru prelevarea probelor de cereale, fructe
uscate, nuci, condimente, cafea, sucuri de fructe si
vin si informatii despre inregistrarea si interpretarea
rezultatelor.
Numar Mic de Probe = Variatie Mare

Numar Mare de Probe = Variatie Mica
Fotograile cu modul de prelevare au fost furnizate de catre:
Kim Esbensen
Applied Chemometrics, Analytical Chemistry, Applied
Biotechnology, Bioenergy & Sampling Research Group,
University of Aalborg Esbjerg, Denmark

2
7
Testarea Micotoxinelor
2.3 Detectia micotoxinelor
Cantitatile de micotoxine din alimente sunt mici,
de aceea identicarea si cuanticarea lor necesita
prelevare sosticata, pregatire, extractie si tehnici
de analiza precum:
Cromatograe lichida de inalta presiune (HPLC)
Imunoanaliza (ELISA)
Lateral Flow (Teste Rapide Imunocromatograce)
Carduri cu membrana
Spectroscopia de masa (MS)
Cromatograa in strat subtire (CSS)
Cromatograa de Gaz (GC)
LC-MS/MS
2.4 Principiul coloanelelor de
imunoanitate
Coloanele de imunoanitate R-Biopharm Rhne
contin anticorpi monoclonali legati de un suport
solid. Utilizarea anticorpilor monoclonali fac
testul foarte specic pentru micotoxina tinta si
ofera sensibilitate imbunatatita. Coloanele de
imunoanitate au avantajul ca pot utilizate
pentru analiza multor matrici.
Dupa extractia cu solventul corespunzator, diluare
si ltrare, proba este trecuta prin coloana de
imunoanitate. Toxina prezenta in proba se va
lega de anticorpul din coloana de imunoanitate.
Coloana se spala cu PBS sau apa si toxina este
eliberata folosind solventul necesar. Eluatul poate
analizat cu ajutorul sistemului HPLC. Extractia si
curatarea dureaza aprox. 30 minute.
Produsele R-Biopharm Rhne sunt dezvoltate,
fabricate, testate si expediate sub Sistemul de
Management al Calitatii ISO 9001 si ISO 13485,
garantand un produs sigur care indeplineste
specicatiile de performanta.

SAMPLE WASHING ELUTION
The sample extract
(containing the toxin) is
passed through the
column
The antibody isolates and
concentrates the toxin and
retains it in the column
Passage of pure methanol
through the column
denatures the antibody and
releases the toxin
2
Proba Spalare Elute
Extrasul probei
(continand toxina)
este trecut prin
coloana.
Anticorpii izoleaza si
concentreaza toxina si
o retin in coloana.
Trecerea prin
coloana a metanol
100 % denatureaza
anticorpul si elibereaza
toxina.
Micotoxine Alte Materiale

8 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Testarea Micotoxinelor
2.5 Principiul derivatizarii
Unele toxine nu au orescenta naturala si de
aceea necesita o derivatizarea inainte de injectia
in sistemul HPLC. Derivatizare este tehnica care
transforma compusul chimic intr-un produs similar
din punct de vedere al structurii chimice pentru a
permite detectia. In general, in timpul derivatizarii
este tintit un grup functional specic din compus.
Compusul chimic rezultat este mai usor de detectat
si poate utilizat pentru cuanticare.
2.6 Derivatizarea aatoxinelor

Atunci cand se testeaza aatoxinele, doar aatoxina
B2 si aatoxina G2 prezinta lumina uorescenta
in UV si pot usor detectate de HPLC cu un
detector de uorescenta. Aatoxinele B1 si G1 nu
au orescenta asa puternica si de aceea trebuie
derivatizate. KOBRA CELL este un sistem unic
de derivatizare pentru aatoxine. Este o celula
electrochimica compusa dintr-un electrod de
platina si un electrod din otel inoxidabil auxiliar.
Aceste straturi sunt prinse intre 2 suporti din
plastic. KOBRA CELL este xata intre coloana si
detector si genereaza agentul de derivatizare,
bromura, in concordanta cu bromura de potasiu
si acidul nitric prezenti in faza mobila. Rezultatul
derivatizarii este cresterea semnalului orescent
ale aatoxinelor B1 si G1 permitand o detectie
imbunatatita folosind detectorul de uorescenta.
2
Derivatizare fara KOBRA CELL Derivatizare cu KOBRA CELL
9
2 Testarea Micotoxinelor
2.7 Produse disponibile la
R-Biopharm Rhne
Coloane de imunoanitate pentru analiza
cantitativa a una sau mai multe micotoxine prin
HPLC :
Afatoxinele B1, B2, G1 si G2
Afatoxina M1
Deoxinivalenol
Fumonisina B1, B2 si B3
Ochratoxina A
T-2 si HT-2
Zearalenona
Standarde si materiale de referinta:
R-Biopharm Rhne produce o serie de standarde
de micotoxine pentru utilizarea cu sistemul HPLC si
un numar mare de materiale de referinta.
KOBRA CELL pentru derivatizarea aatoxinelor
B1 si G1:
Singura celula electrochimica recomandata de
standarde CE si utilizata de clienti importanti
(IISPV, DSVSA Constanta, DSVSA Bucuresti, DSVSA
Timis, etc.), producatori de alimente si laboratoare
guvernamentale din toata lumea.
Alte produse:
R-Biopharm Rhne va pune la dispozitie si o serie
de teste rapide si kituri ELISA pentru determinarea
micotoxinelor.
10 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
3 Introducere la terminologia utilizata in detectia micotoxinelor
3.1 Prescurtari utilizate in detectia
micotoxinelor
micro
n nano
m mili
L litru
g gram
ppb parti per bilion
ppm parti per milion
ppt parti per trilion
IAC coloane de imunoanitate
dH
2
O apa distilata/deionizata
MeOH metanol
ACN acetonitril
PBS tampon salin
AA acid acetic
r repetabilitate
R reproductibilitate

3.2 Nivelul micotoxinelor
Atunci cand se vorbeste de micotoxine se utilizeaza
parti per lucru care ajuta la descrierea unei portii
de valoare in cantitati masurabile. Cele mai utilizate
sunt ppm, ppb si ppt.
Parti per milion:
1 parte per 1,000,000 parti sau o parte in 10 la
puterea a 6-a
g / ml = mg / l
g / ml = mg / L
g / g = g / ml = ng / mg
1 g in 1.000 g or 1 kg = 1,000 ppm
Ex. : daca avem 1mg/g acest lucru reprezinta 1,000
x g/g = 1,000 ppm
Parti per bilion:
1 parte per 1,000,000,000 parti sau o parte in 10
la puterea a 9-a
g / L = ng / ml
ng / g = g / kg
1 g in 1,000 g or 1 kg = 1 ppb
Pentru transformare:
1 ppm = 1,000 ppb = 1,000,000 ppt
0.001 ppm = 1 ppb = 1,000 ppt
0.000001 ppm = 0.001 ppb = 1 ppt
1 ppm = 1,000,000 ppt
Sumar:
ppm --> ppb --> ppt
(ecare diferenta are factorul 1,000)
11
Introducere la terminologia utilizata in detectia micotoxinelor
3.4 Volum
Litrul este unitatea de volum cel mai des utilizata
pentru a masura un material lichid.
Pentru a transforma litri in mililitri:
1 L = 1,000 ml (L x 1,000 = ml)
1 ml = 0.001 L (ml / 1,000 = L)
Pentru a transforma litru in microlitru:
1 L = 1,000,000 l (L x 1,000,000 = l)
1 l = 0.00001 L (l / 1,000,000 = L)
Pentru a tranforma mililitri la microlitri:
1 ml = 1,000 l (ml x 1,000 = l)
1 l = 0.001 ml (l / 1,000 = ml)
Sumar:
L --> ml --> l
(ecare diferenta are factorul 1,000)
3
3.3 Greutate
Gramul este o unitate a masei si este cea mai utili-
zata unitate de masurare pentru materiale solide.
Pentru a transforma grame si miligrame:
1 g = 1,000 mg (g x 1,000 = mg)
1 mg = 0.001 g (mg / 1,000 = g)
Pentru a transforma grame si micrograme:
1 g = 1,000,000 g (g x 1,000,000 = g)
1 g = 0.00001 g (g / 1,000,000 = g)
Pentru a transforma grame si nanograme:
1 g = 1,000,000,000 ng (g x 1,000,000,000 = ng)
1 ng = 0.000000001 g (ng / 1,000,000,000 =g)
Pentru a transforma miligrame la micrograme:
1 mg = 1,000 g (mg x 1,000 = g)
1 g = 0.001 mg (g / 1,000 = mg)
Pentru a transforma miligrame la nanograme:
1 mg = 1,000,000 ng (mg x 1,000,000 = ng)
1 ng = 0.000001 mg (ng / 1,000,000 = mg)
Pentru a transforma micrograme la nanograme:
1 g = 1,000 ng (g x 1,000 = ng)
1 ng = 0.001 g (ng / 1,000 = g)
Sumar:
g --> mg --> g --> ng
(ecare diferenta are factorul 1,000)
12 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Introducere la terminologia utilizata in detectia micotoxinelor
3.5 Dilutii
Urmatoarele exemple sunt pentru pregatirea
solutiilor pentru testarea micotoxinelor:
1 % Solutie Bicarbonat de Sodiu
1 g bicarbonat de sodiu in 100 ml apa.
2 % Solutie Bicarbonat de Sodiu
2 g bicarbonat de sodiu in 100ml apa.
60 % Metanol
60 ml metanol plus 40 ml apa.
80 % Metanol
80 ml metanol plus 20 ml apa.
2 % Acid Acetic 98 % Metanol
2 ml acid acetic plus 98 ml metanol.
1 in Dilutie 2 sau Dublul Dilutiei sau Dilutii
Seriale
Se poate folosii tehnica dilutiilor seriale pentru a
obtine solutiile si este folosita in mod normal in
efectuarea curbelor de calibrare. Spre exemplu:
Eprubeta 1 contine 2 ml metanol 100 %. Se ia
1 ml si se adauga in eprubeta 2.
Eprubeta 2 contine 1 ml apa plus 1 ml metanol
100 % din eprubeta 1. Acum are 50 % metanol.
Se ia 1 ml si se adauga in eprubeta 3.
Eprubeta 3 contine 1 ml apa plus 1 ml metanol
50 % din eprubeta 2. Acum are 25 % metanol.
Se ia 1 ml si se adauga in eprubeta 4.
Eprubeta 4 contine 1 ml apa plus 1 ml metanol
25 %. Acum are 12.5 % metanol.
3
13
Manipularea Micotoxinelor
4.1 Risc
Micotoxinele sunt substante de mare risc. Aceste
analize pot efectuate doar de laboratoare
bine instruite. Trebuie sa se foloseasca halate
corespunzatoare, manusi din plastic, ochelari de
protectie.
Coloanele contin 0.01 % v/v timerosal. In caz ca
o picatura cade pe piele sau ajunge in ochi este
recomandata spalarea imediata cu cantitati mari de
apa.
4.2 Decontaminare
Toate materialele utilizate trebuie decontaminate
prin imersarea 30 minute in solutie de hipoclorit
de sodiu (aprox. 5 %) urmata de adaugarea de
acetona 5 % timp de 30 minute. Apoi se efectueaza
spalarea normala.
4
14 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Curbe de Calibrare
Curba de calibrare este utilizata pentru
determinarea concentratiei unei substante dintr-o
proba necunoscuta comparand necunoscutul la un
set de probe standard de concentratii cunoscute.
Curba de calibrare este un grac dupa raspunsul
aparatului, asa numitul semnal analitic, care se
schimba in functie de schimbarea concentratiei
analitului. Sunt pregatite o serie de standarde
de concentratii diferite, de preferat prin dilutie
seriala, cu concentratia standardului din mijloc
asemanatoare cu concentratia de interes.
Analizarea ecarui standard folosind tehnica
potrivita va produce o serie de citiri. Pentru
majoritatea analizelor, un grac de raspuns versus
concentratie va crea o relatie liniara. Raspunsul
necunoscutului poate masurat utilizand caurba
de calibrare.
Curba de calibrare ar trebui sa e liniara si deviatia
acestei drepte sa dea o indicatie asupra preciziei
rezultatului. Ex. O corelatie de >98 % va indica
ca toate standardele formeaza o dreapta si ofera
un rezultat destul de sigur. Cu o corelatie <98 %
rezultatele nu vor asa de sigure.
Pentru efectuarea unei curbe trebuie sa se
urmareasca urmatorii factori:
Este recomandat crearea unei curbe din 3 - 6
puncte.
Construirea unei curbe trebuie facuta astfel incat
concentratia tinta sa e cuprinsa la mijlocul
curbei
5
15
Curbe de Calibrare
5.1 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia aatoxinelor
Se iau 5 ml metanol si se pun intr-o eprubeta de
5 ml.
Se iau 400 l.
Se adauga 400 l de standard de aatoxine
1,000 ng/ml pentru a obtine o concnetratie de
80 ng/ml.
Standard 4 HPLC
Se iau 2.5 ml solutie 80 ng/ml si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 2.5 ml apa pentru a obtine un
standard de 40 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 1 ng per aatoxina
(4 ng total) per 100 l injectie.
Standard 3 HPLC
Se iau 2.5 ml standard 4 si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 2.5 ml 50 % metanol pentru a obtine
un standard de 20 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 0.5 ng per aatoxina
(2 ng total) per 100 l injectie.
Standard 2 HPLC
Se iau 2.5 ml standard 3 si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 2.5 ml 50 % metanol pentru a obtine
un standard de 10 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 0.25 ng per aatoxina
(1 ng total) per 100 l injectie.
Standard 1 HPLC
Se iau 2.5 ml standard 2 si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 2.5 ml 50 % metanol pentru a obtine
un standard de 5 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 0.125 ng per
aatoxina (0.5 ng total) per 100 l injectie.
5
16 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Curbe de Calibrare
5.2 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia DON
Diluent metanol : apa 9.5 : 90.5.
Standard 5 HPLC
Se iau 5 ml diluent si se pun intr-o eprubeta de
5 ml.
Se iau 400 l.
Se adauga 400 l de solutie DON 50 g/ml
pentru a obtine 4 g/ml (4 ppm = 4,000 ng/ml)
standard.
Acesta este echivalent cu 400 ng per 100 l
injectie.
Standard 4 HPLC
Se iau 2 ml standard 5 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 25 ml diluent pentru a obtine un
standard de 2 g/ml (2 ppm = 2,000 ng/ml).
Acesta este echivalent cu 200 ng per 100 l
injectie.
Standard 3 HPLC
Se iau 2 ml standard 4 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 2 ml diluent pentru a obtine un
standard de 1 g/ml (1 ppm = 1,000 ng/ml).
Acesta este echivalent cu 100 ng per 100 l
injectie.
Standard 2 HPLC
Se iau 2 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 2 ml diluent pentru a obtine un
standard de 0.5 g/ml (0.5 ppm = 500 ng/ml).
Acesta este echivalent cu 50 ng per 100 l
injectie.
Standard 1 HPLC
Se iau 2 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 2 ml diluent pentru a obtine un
standard de 0.25 g/ml (0.25 ppm =
250 ng/ml).
Acesta este echivalent cu 25 ng per 100 l
injectie.
5
17
Curbe de Calibrare
5.3 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia fumonisinelor
Se iau 7.5 ml 1 : 1 : 2 acetonitril : metanol : apa si
se pun intr-o eprubeta de 10 ml.
Se iau 200 l.
Se adauga 200 l de standard de fumonisin
150,000 ng/ml pentru a obtine o colutie de
4,000 ng/ml.
Standard 3 HPLC
Se iau 500 l solutie 4,000 ng/ml si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 1.5ml 50 % metanol pentru a obtine
un standard de 1,000ng/ml.
Acesta este echivalent cu 100 ng per 100 l
injectie.
Standard 2 HPLC
Se iau 1 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 1 ml 50 % metanol pentru a obtine
un standard de 500 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 50 ng per 100 l
injectie.
Standard 1 HPLC
Se iau 1 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 1 ml 50 % metanol pentru a obtine
un standard de 250 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 25 ng per 100 l injectie.
5.4 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia ochratoxinei
Se iau 5 ml 100 % metanol se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se iau 500 l.
Se adauga 500 l de standard de ochratoxina
1,000 ng/ml pentru a obtine o solutie de
100 ng/ml.
Standard 4 HPLC
Se iau 100 l solutie 100 ng/ml si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 1.4 ml acid acetic : metanol 2 %.
Se adauga 1.5ml apa pentru a obtine
3.33 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 0.33 ng per
100 l injectie.
Standard 3 HPLC
Se iau 1.5 ml standard 4 si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 750 l acid acetic : metanol 2 %.
Se adauga 750 l apa pentru a obtine
1.67 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 0.167 ng per 100 l
injectie.
Standard 2 HPLC
Se iau 1.5 ml standard 3 si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 750 l acid acetic : metanol 2 %.
Se adauga 750 l apa pentru a obtine
0.833 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 0.0833 ng per 100 l
injectie.
Standard 1 HPLC
Se iau 1.5 ml standard 2 si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 750 l acid acetic : metanol 2%.
Se adauga 750 l apa pentru a obtine
0.416 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 0.0416 ng per 100 l
injectie.
5
18 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Curbe de Calibrare
5.5 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia toxinelor T-2 si HT-2
Standard 3 HPLC
30 l solutie standard T-2 & HT-2 de 10 g/ml se
pun intr-o eprubeta.
Se evapora, se derivatizeaza conform IFU. Se
reconstituie in 2 ml faza mobila pentru a obtine
un standard de 15 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 15 ng per 100 l
injectie.
Standard 2 HPLC
Se iau 1 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 1 ml faza mobila pentru a obtine un
standard de 75 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 7.5 ng per 100 l
injectie.
Standard 1 HPLC
Se ia 1 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 1 ml faza mobila pentru a obtine un
standard de 37.5 ng/ml.
Acesta este echivalent cu 3.75 ng per 100 l
injectie.
5.6 Un exemplu de curba de calibrare
pentru detectia zearalenonei
Se iau 3 ml acetonitril si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se iau 1.8 ml.
Se adauga 1.8 ml standard de zearalenona de
1,000 ng/ml pentru a obtine o solutie de
600 ng/ml.
Standard 4 HPLC
Se iau 2 ml solutie 600 ng/ml si se pun intr-o
eprubeta de 5 ml.
Se adauga 2 ml apa pentru a obtine
300 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 30 ng per 100 l
injectie.
Standard 3 HPLC
Se iau 2 ml standard 4 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 2 ml 50 % acetonitril pentru a obtine
150 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 15 ng per 100 l
injectie.
Standard 2 HPLC
Se iau 2 ml standard 3 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 2 ml 50 % acetonitril pentru a obtine
75 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 7.5 ng per 100 l
injectie.
Standard 1 HPLC
Se iau 2 ml standard 2 si se pun intr-o eprubeta
de 5 ml.
Se adauga 2ml 50 % acetonitril pentru a obtine
37.5 ng/ml standard.
Acesta este echivalent cu 3.75 ng per 100 l
injectie.
5
19
Cum Se Fortica O Proba
R-Biopharm Rhne va pune la dispozitie o serie
de materiale de referinta. Puteti fortica o proba
urmand urmatoarea procedura:
C1 x V1 = C2 x V2
C1 = Concentratia standardului utilizat pentru
forticare
V1 = Volumul standardului care se adauga in
proba
C2 = Concentratia necesara a probei
V2 = Volumul necesar al probei
40 ml lapte forticat la 25 ppt folosind standard de
40 ng/ml:
C1 x V1 = C2 x V2
40 ng / ml x V1 = 25 ppt (0.025 ppb) x 40 ml
40 ng / ml x V1 = 0.025 ng / ml x 40 ml
40 ng / ml x V1 = 1 ng
V1 = 1 ng / 40 ng / ml
V1 = 0.025 ml
25 g boia forticata la 5 ppb folosind standard de
1,000 ng/ml:
C1 x V1 = C2 x V2
1,000 ng / ml x V1 = 5 ppb x 25 g
1,000 ng / ml x V1 = 5 ng / ml x 25 g
1,000 ng / ml x V1 = 125 ng
V1 = 125 ng / 1,000 ng / ml
V1 = 0.125 ml
5 g porumb forticat la 2 ppm folosind standard
de 1,000 ng/ml:
C1 x V1 = C2 x V2
1,000 ng / ml x V1 = 2 ppm (2,000 ppb) x 5 g
1,000 ng / ml x V1 = 2,000 ng / ml x 5 g
1,000 ng / ml x V1 = 10,000 ng
V1 = 10,000 ng / 1,000 ng / ml
V1 = 10 ml
Se cantareste proba blank cunoscuta. Se adauga
volumul calculat de standard si se lasa la intuneric
peste noapte.
Daca proba este contaminata natural va
recomandam sa nu o forticati. In caz ca trebuie
s-o forticati (ex. teste FAPAS) va recomandam sa
forticati proba de 10 ori nivelul de contaminare.
6
20 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Reportarea Rezultatelor 7
Toate rezultatele trebuie raportate parti per si
trebuie sa se tina cont de orice pierdere din timpul
metodei pentru a raporta un rezultat corect. Va
recomandam sa lucrati in paralel cu proba dvs.
o proba de referinta de aceeasi natura cu proba
dvs. si s-o treceti prin coloana de imunoanitate.
Recuperarea obtinuta cu proba forticata poate
utilizata pentru a corecta rezultatul obtinut pentru
proba.
Ex.
Valoarea probei de referinta este de 10 ppb, iar
valoarea obtinuta de la HPLC este de 8 ppb. Asta
inseamna o recuperare de 80 %. Pentru probele
viitoare, similare cu standardul de referinta, puteti
adauga 20 % la rezultat. Ex. Daca obtineti o valoare
de 2 ppb si se stie ca recuperarea este de 80 %, se
adauga la rezultat 20 % si inseamna ca proba are
2.5 ppb.
Legislatia in viguare arma ca rezultatele sa
e acceptate, recuperarile trebuie sa intre in
urmatoarele limite:
Produsele R-Biopharm Rhne sunt dezvoltate,
fabricate, testate si expediate sub Sistemul de
Management al Calitatii ISO 9001 si ISO 13485,
garantand un produs sigur care indeplineste
specicatiile CEN de recuperare cuprinse intre
70 -110 %.
Matrice Nivelul
Total De
Contaminare
Limita De
Recuperare
Acceptata
Toate
Alimentele
<1.0 ppb 50 - 120 %
1 - 10 ppb 70 - 110 %
>10 ppb 80 - 110 %
21
Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente
Atunci cand se raporteaza un rezultat, acesta
trebuie exprimat in parti per. Totusi, in
majoritatea sistemelor HPLC rezultatul este
exprimat in nanograme per injectie. De aceea,
trebuie sa transformam nanograme in parti per.
Pentru a face acest lucru trebuie sa stim
echivalentul gramului din proba care a fost injectat
in sistemul HPLC. De aici se poate calcula factorul
de inmultire pentru a transforma nanograme per
injectie in parti per.
Exemplu de rezultat HPLC:
Nr. Proba Numele Probei Timpul De
Retentie
Minute G2
Fluorescenta
Aria
mV / *min
G2
Fluorescenta
Inaltimea mV
Fluorescenta
G2
Cantitatea
Ng G2
Fluorescenta
1 STD 1
5 ng / ml
10.687 9.0839 18.98 0.2070
2 STD 2
10 ng / ml
10.340 11.7919 25.06 0.2687
3 STD 3
20 ng / ml
11.376 21.1858 42.71 0.4827
4 STD 4
40 ng / ml
10.987 43.6115 89.53 0.9937
5 unknown 10.139 5.1009 10.89 0.1162
6 unknown 9.998 4.2571 9.13 0.0970
Medie: 10.207 10.845 21.515 0.236
Dev. Std. Rel.: 6.222 % 127.789 % 125.188 % 127.789 %
In exemplul de mai sus s-au injectat 0.05 g proba
care a produs o citire de 0.116 ng aatoxina G2.
Pentru a prezenta aceasta valoare ca ppb
(nanograme per gram de proba) este necesar sa
inmultim valoarea obtinuta pentru G2 (nanograme
per 0.05 g proba injectat) cu un factor de 20
pentru a calcula cate nanograme ar prezente in
1 g proba. In acest caz, vom raporta contaminarea
probei necunoscute ca 0.1162 x 20 = 2.324 ppb
aatoxina G2.
8
22 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente
In urmatoarele paragrafe va sunt prezentate
cateva exemple pentru determinarea factorului de
inmultire pentru transformarea nanogramelor per
injectie in parti per milion.
8.1 AFLAPREP

Un exemplu
50 g proba --> 500 ml tampon de extractie.
1 g proba <-- 10 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 2ml.
1 g proba --> 2ml.
0.05 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.05 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 20.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.05 g = factorul 20.
ng obtinute x 20 = ppb.
8.2 DONPREP

Un exemplu

25 g proba --> 200 ml tampon de extractie.
0.25 g <-- 2 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 1.5 ml.
Se evapora la sec.
0.25 g proba --> se reconstituie in 1 ml.
0.025 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.025 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 40.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.025 g = 40.
ng obtinute x 40 = ppb.
8.3 EASI-EXTRACT

AFLATOXIN
Un exemplu

50 g proba <-- 100 ml tampon de extractie.
1 g proba <-- 2 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 3 ml.
1 g proba --> 3 ml.
0.033 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.033 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 30.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.033 g = 30.
ng obtinute x 30 = ppb.
8.4 EASI-EXTRACT

T-2 & HT-2 Un exemplu



25 g proba --> 200 ml tampon de extractie.
0.25 g <-- 2 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 1.5 ml.
Se evapora la sec.
0.25 g proba --> se reconstituie in 1 ml.
0.025 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.025 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 40.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.025 g = 40.
ng obtinute x 40 = ppb.
8
23
8.5 EASI-EXTRACT

ZEARALENONE
Un exemplu

25 g proba --> 125 ml tampon de extractie.
4 g <-- 20 ml ltrat si diluat cu PBS.
1 g <-- 25 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 3 ml.
1 g proba --> 3 ml.
0.033 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.033 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 30.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.033 g = 30.
ng obtinute x 30 = ppb.
8.6 FUMONIPREP

Un exemplu
25 g of sample --> 125 ml tampon de extractie.
2 g <-- 10 ml ltrat si adus la 50 ml.
2 g --> 50 ml.
0.4 g --> ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 3 ml.
0.4 g of proba --> 3 ml.
0.009 g <-- 70 l proba pentru derivatizare.
0.009 g <-- 140 l volum total dupa derivatizare.
0.006 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.006 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 166.67.

1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.006 g = 166.67.
ng obtinute x 166.67 = ppb.

8.7 OCHRAPREP

Un exemplu
Exemplul 1:

50 g proba --> 200 ml tampon de extractie.
1 g <-- 4 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 3 ml.
1 g proba --> 3 ml.
0.033 g <-- 100 l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de 0.033 g
pentru analiza. Pentru a raporta rezultatul in ppb,
acest rezultat trebuie inmultit cu 30.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.033 g = 30.
ng obtinute x 30 = ppb.
Exemplul 2:
10 g proba --> 200 ml tampon de extractie.
0.25 g <-- 5 ml ltrat si trecut prin IAC.
Se elueaza in 3 ml.
0.25 g proba --> 3 ml.
0.0083 g <-- 100l injectata in HPLC.
S-au injectat un total estimativ de proba de
0.0083 g pentru analiza. Pentru a raporta
rezultatul in ppb, acest rezultat trebuie inmultit cu
120.
1 ng / g = 1 ppb.
1 g / 0.0083 g = 40.
ng obtinute x 120 = ppb.
Determinarea Concentratiei Toxinei Prezente 8
24 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Validarea Unei Metode
Pentru a valida o metoda este necesar utilizarea
materialului de referinta pentru a determina
recuperarea, precizia, repetabilitatea si
reproductibilitatea. R-Biopharm Rhne recomanda
utilizarea a minim 10 coloane pentru a valida o
metoda.
9.1 Precizia
Precizia este calculata ca repetabilitate (r) si
reproductibilitate (R).
9.2 Repetabilitatea (r)
Se exprima precizia sub aceleasi conditii de operare
in decursul unui interval scurt de timp. Este astfel o
masura de precizie utilizand:
Acelasi analist.
Acelasi aparat.
Timpi apropiati intre analizele replicatilor.
Aceiasi reactivi.
Acelasi laborator, etc.
Spre exemplu, validarea unei metode implica
testarea a 10 coloane in aceasi zi.
9.3 Reproductibilitatea (R)
Exprima precizi dintre laboratoare diferite.
Implica:
Analisti diferiti.
Laboratoare diferite.
Echipamente diferite.
Surse diferite de reactivi.
Spre exemplu, o validare implica testarea aceleiasi
metode de catre mai multe laboratoare.
9
25
Imbunatatirea Recuperarii
Specicatiile CEN arma ca recuperarile trebuie sa
e intre 70 - 110 %. Daca recuperarea dvs. este mai
mica de 70 % va rugam sa urmati urmatorii pasi:
Se verica pH-ul probei, acesta ar trebui sa e
intre 7.0 7.8. Un pH in afara acestor limite
poate afecta performantele anticorpului.
Se verica volumul trecut prin coloana. Trecerea
probei prin coloana nu trebuie sa depaseasca
30 minute. Daca este necesar, se poate ltra sau
centrifuga proba dupa dilutia cu PBS pentru a
indeparta orice precipitat. Expunerea
anticorpului la un volum scazut de solvent
de-a lungul unei perioade lungi poate avea
efecte adverse.
Se verica concentratia solventului care se trece
prin coloana de imunoanitate. Nu trebuie sa se
depaseasca urmatoarele concentratii:
Aatoxine metanol 30 %
acetonitril 2.5 %
Ochratoxina acetonitril 5 %
Zearalenona acetonitril 15 %
Fumonisin metanol 5 %
acetonitril 5 %
T-2 & HT-2 metanol 18 %
Trebuie utilizate aplicatiile recomandate de catre
producator pentru pregatirea probelor.
Pentru aatoxine se utilizeaza derivatizarea cu
ajutorul KOBRA CELL.
Se utilizeaza standardele furnizate de catre
R-Biopharm Rhne.
10
26 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Imbunatatirea Cromatogramelor
11.1 Zgomot de fundal crescut
Se opreste pompa.
Daca zgomotul dispare, pompa este cauza
(sectiunea 12 sau contactati furnizorul sistemului
HPLC).
Daca zgomotul persista, detectorul este cauza
(sectiunea 12 sau contactati furnizorul sistemului
HPLC).
11.2 Contaminarea fazei mobile
Se mareste lungimea de unda a detectorului.
Daca curentul persista este o problema cu faza
mobila.
Se pregateste faza mobila proaspata.
11.3 Contaminarea de la pompa
Se indeparteaza instrumentul contaminat.
Daca linia de fundal se stabilizeaza, se curata
instrumentul.
11.4 Reproductibilitatea scazuta a ariei
varfurilor
Daca reproductibilitatea timpului de retentie este
normala nu este cauza pompei.
Cauza poate auto-sampler-ul.
Datorita deteriorarii probei.
11.5 Extinderea si impartirea varfurilor
Probleme cu rezolutia varfurilor indica:
Faza mobila necorespunzatoare (se ajusteaza
faza mobila).
Deteriorarea coloanei.
Un tub infundat.
Injectarea excesiva a probei.
11
27
Imbunatatirea Cromatogramelor
11.6 Varfuri fantoma
Un varf fantoma este un varf care apare dintr-o
injectie anterioara sau din cauza contaminarii
aparatului sau a fazei mobile.
Cauza Metoda De Conrmare Ce Sa Facem
Contaminarea pompei sau
a celorlalte componente din
pompa
Se curata utilizand un acid sau
solutie alcalina
Acid : acid nitric 4 - 6 N
Alcalin : sodium hydroxide 5 - 10 %
Contaminarea fazei mobile Se folosesc solventi de puritate mai
mare
Contaminarea auto-sampler-
ului
Se urmaresc varfurile
fantoma atunci cand se
injecteaza faza mobila
Se curata echipamentul
11
28 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic

Probleme La HPLC
12.1 Introducere
Criterii critice pentru o analiza HPLC de succes:
Faza mobila corecta.
Coloana analitica si coloana guard in conditii
bune (a se schimba la ecare 2 - 3 luni).
Lampa detectorului in conditii bune (< 1000 ore
de utilizare)
Odata ce conditiile analizei HPLC au fost optimizate
urmatorul pas critic este pregatirea probei. Pentru
a optimiza efectul de curatare prin coloana de
imunoanitate, toate probele trebuie analizate
utilizand un protocol recomandat in manualul de
aplicatii. Acest lucru este esential pentru probele
cu un nivel mare de pigmenti ( condimente si
fructe uscate).
Nota: R-Biopharm Rhne recomanda urmatoarea
informatie ca ghid general in problemele cu sistemul
HPLC. Pentru infromatii suplimentare va recomandam
sa contactati producatorul HPLC-ului.
12
Stativ pentru solvent si rezervoare
Pompa
Auto-sampler
Cuptor de coloana si coloana
Detector
29
Probleme La HPLC
12.2 Cand se ajusteaza faza mobila
Trebuie sa se adauge mai multa apa:
Daca linia de baza dintre varfuri nu separa bine
varfurile. Acest lucru va permite elutia completa
a primei toxine inainte de inceperea elutiei celei
de-a doua toxine. Tmpul de analiza va creste,
dar separarea varfurilor este esentiala pentru
cromatograme corecte.
Daca toxinele sunt eluate prea repede si se
contopesc cu solventul. Toxinele vor retinute
pe coloana pentru mai mult timp si permit
liniei de fundal sa se stabilizeze inainte de elutia
toxinelor.
Contaminarea varfului de matice.
Trebuie sa se adauge mai mult solvent:
Varfurile sunt prea late (incep sa se
contopeasca).
Timpul de retentie este prea mare.
Contaminarea varfului de matice.
Ajustarea fazei mobile nu este intotdeanu de
succes. Pregatirea probei si curatarea trebuie
optimizate pentru a imbunatatii cromatograa
HPLC.
12
30 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Probleme La HPLC
12.3 Solventi si faza mobila
Solventi care nu se amesteca se vor separa
rezultand indepartarea completa a solventului
original din sistemul HPLC. Atunci cand se schimba
faza mobila trebuie sa se foloseasca urmatoarea
secventa de solventi:
Solutie Tampon sau Solutie de Sare
Solventi Aposi
Solventi Organici
Acetonitril sau Metanol
Etanol IPA (sau Acetona)
Apa
Cloroform sau Acetat de Etil
n-Hexan sau ISO-Octan
12
31
Probleme La HPLC
12.4 Pompa
Presiunea de operare anormala a pompei poate
observata si poate :
Prea mare
Prea mica
Variabila
Presiunea Pompei Prea Mare
Cauza Metoda De Conrmare Ce Sa Facem
Partea de jos a pompei este
infundata. Ex. In auto-
sampler, coloana, ltru, tub,
sigurante.
Se scoate si se examineaza
instrumentul si / sau partile care pot
infundate in sistemul de curgere.
Se apeleaza la manual.
Filtrul de linie este infundat
(din spatele pompei).
Se lucreaza cu pompa fara a
conectata la ltrul respectiv. Daca
presiunea este 20 kg/cm patrat sau
mai mare cand se pompeaza la
10 ml/minut, atunci ltrul este
infundat.
Se inlocuieste ltrul.
Tuburile din pompa
infundate.
Se indeparteaza ltrul din spate
si solventul din pompa. Daca
presiunea este 20 kg/cm patrat
sau mai mare cand se pompeaza
la 10 ml/minut, atunci ltrul este
infundat.
Se apeleaza la persoanele de
la servis.
12
32 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Probleme La HPLC
Presiunea Pompei Prea Mica
Cauza Metode De Conrmare Ce Sa Facem
Capul pompei contine bule
de aer.
Se indeparteaza parghia valvei
si se indeparteaza bulele de aer.
Oriciul ltrului este blocat
(utilizarea solutie tampon
duce la blocari).
Atunci cand se deconecteaza
solventul picura in loc sa curga
uent din oriciu.
Se inlocuieste ltrul.
Sigiliul sondei curge. Se strang suruburile capului
pompei.
Se inlocuieste sigiliul sondei.
Tubul interior de ajustare
curge.
Se strang tuburile de la pompa.
Consultati manualul.
Scurgeri la partea de jos
a pompei ( auto sampler,
coloana, sigurante).
Deteriorarea capului pompei.
Se efectueaza testul presiunii ( se
pune surubul in oriciul pompei, la
0.1 ml/min presiunea ar trebuie sa
e 500 kg/cm patrat).
Se curata capul pompei cu acid
sau solutie alcalina.
Variatii in Presiunea Pompei
Cauza Metode De Conrmare Ce Sa Facem
Capul pompei contine bule. Se deschide valva si se
indeparteaza bulele.
Filtrul de linie este infundat. Se inlocuieste ltrul.
Degazare insucienta a
solventului.
Se degazeaza solventul.
Tubul de xare din interior
curge.
Se strange tubul.
Sigiliul sondei curge. Se strang suruburile capului
pompei.
Se inlocuieste sigiliul sondei.
Deteriorarea capului pompei. Se efectueaza testul presiunii. Se curata capul pompei
folosind acid sau solutie
alcalina.
Miscare anormala a sigiliului. Se aude un zgomot de metal pe
metal.
Se slabesc usor suruburile
capului pompei.
12
33
Probleme La HPLC
12.5 Coloana si incalzirea coloanei
Se utilizeaza intotdeauna incalzirea coloanei pentru
a prevenii:
Ingramadirea periodica a liniei de baza.
Marirea timpului de retentie.
Micsorarea timpului de retentie.
Reproductibilitatea scazuta a timpului de
retentie.
12.6 Detector
Zgomote:
Sursa Metode De Conrmare Ce Sa Facem
Bule in celula

Se monitorizeaza linia de fundal.
Bulele provoaca linii de fundal
anormal de mari cand nivelul de
scurgere este schimbat.
1. Indepartati aerul din solvent
folosind un degasser.
2. Instalati o coada de presiune.
Solutie in celula

Se foloseste o oglida pentru
marire pentru a examina celula.
Se verica din nou linia de
fundal.
Spalati celula: se spala sau se
dezasambleaza.
Lichid care curge din celula

Se indeparteaza celula din
instrument. Se examineaza
celula si partea laterala a
instrumentului.
1. Spalati si strangeti
conectiunile.
2. Inlocuiti celula sticata.
Reducerea energiei

Daca diferenta este >0.4 V la
250 nm, s-au deteriorat lampa
sau oglinda.
Se inlocuieste lampa (1,000
ore) sau oglinda (5,000 ore).
Absorbtia solventului sau
contaminarea ferestrei celulei

1. Folositi solvent mai puternic.
2. Vericati lungimea de unda.
3. Spalati celula.
12
34 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Probleme La HPLC
Zgomote electrice.

Se pune instrumentul jos.
1. Absobtia solventului.
2. Contaminarea ferestrei celulei.

1. Folositi solvent mai puternic.
2. Curatati celula.
3. Echilibrati coloana.
1. Cresterea bulelor.
2. Contaminarea coloanei.
3. Reducerea scurgerii
solventului.

Folositi metoda de conrmare ca
la 'Bule in celula'.
1. Eliminati aerul din solvent
folosind un degasser.
2. Instalati o coada de presiune.
3. Spalati / schimbati coloana.
4. Vericati pompa si / sau
tuburile blocate.
Scaderea bulelor

Folositi metoda de conrmare ca
la Bule in celula.
1. Eliminati aerul din solvent
folosind un degasser.
2. Instalati o coada de presiune.
12
35
Probleme La HPLC
12.7 Indepartarea bulelor din celula de
detectie
Se mareste curgerea pompei.

Daca bulele raman:
Se conecteaza partea de iesire a pompei direct la
inlet-ul celulei si pompati la 2 ml/minute.
Daca bulele raman:
Se ataseaza un tub din otel la partea de iesire a
celulei si acoperiti cu un tub de teon.Bulele pot
comprimate si trecute prin celula daca se aplica
presiune in interiorul celulei. Se aplica presiune
siringii si in mod continuu indoiti si reveniti tubul
de teon.Daca linia de fundal o ia in directia
negativa marimea bulelor din celula scade.
Continuati pana ce bulele au trecut prin celula.




















12.8 Curatarea celulei de detectie fara
dezasamblare
Contaminarea peretilor celulei poate indepartata
trecand urmatorul solvent organic sau acid nitric
puternic prin celula.Cand aceasta metoda nu da
rezultatele dorite, dezasamblati si curatati celula.
Inlocuiti solventul din celula cu apa distilata.
Treceti acid nitric concentrat prin celula.
(4 N, 1 ml/minute sau 30 min)
Treceti apa distilata prin celula.
(1 ml/minute timp de 30 min)
Treceti acetona prin celula.
(1 ml/minute timp de 30 min)
Treceti apa distilata prin celula.
(1 ml/minute timp de 30 min)
Atentie: Se deconecteaza coloana inainte de a utiliza
aceasta metoda.
12
36 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Probleme La HPLC
12.9 Prevenirea bulelor de aer
Aparitia bulelor poate prevenita folosind
intotdeauna un degasser.
Absobtia de solvent poate prevenita folosind
intotdeauna solvent gradat de HPLC.
Suspensiile si blocarea tuburilor poate
prevenita spaland sistemul cu apa dupa ce s-a
utilizat o faza mobila care continea sare.
Cand se foloseste spalarea cu metanol inainte
sau dupa o faza mobila care contine sare
asigurati-va ca sarea este solubila in metanol.
Daca nu sunteti siguri folositi apa inainte si dupa
faza mobila.
Un protocol de spalare bun este 30 minute apa
la 1 ml/minut urmat de 30 minute metanol la
1 ml/minut.
Cand aveti de-a face cu o faza mobila organica
inlocuiti solventul din celula cu un solvent care
se amesteca cu faza mobila organica sau cu apa.
Nu amestecati lichide care nu pot amestecate.
(ex. cloroform si apa). Folositi metanol ca solvent
care se amesteca cu ambele.
12.10 Mentenanta detectorilor de
uorescenta
Lampa trebuie schimbata la ecare 1,000 ore.
Acest lucru poate facut in laborator. Puteti
chema si inginerul de servis.
Inainte de schimbarea lampei programati
aparatul la 400 nm extinctie si emisia la 500 nm,
memorati valorile extinctiei si emisiei (V). Aceste
valori trebuie sa creasca cand este instalata noua
lampa.
Filtrele de praf trebuie si ele schimbate odata
cu lampa pentru a impiedica acumularea
prafului in detector. Cand ltrele de aer sunt
infundate ecienta racirii lampei este redusa,
contribuind la deteriorarea lampei.
Cel mai bun mod de curatare a prafului din
interior este folosirea unei pompe de aer si
suarea prafului.Astfel se evita atingerea partilor
componente si provocarea unor daune.
12
37
Glosar
Analist: O persoana care efectueaza analiza unei probe.
Analit: Substanta care trebuie separata in timpul cromatogramei.
Anticorp: Se gasesc in sange si sunt utilizati de sistemul imunitar pentru identi-
carea corpurilor straine.
Antigen: O substanta care promoveaza producerea anticorpilor si poate produce
un raspuns imunitar.
Linie de baza: Este numele dat unei parti din cromatograma care reprezinta orice
perioada de timp in care prin detector trece numai faza mobila.
Matrice: Substante precum cerealele, condimentele etc care trebuie testate.
Concentratie: Concentratia este masura care prezinta cat dintr-o anumita substanta
este amestecata cu alta substanta.
Cromatograma: Este prezentarea vizuala a unei cromatograme. In cazul unei separari
optime, varfuri diferite corespund cu anumite componente din
amestecuri separate.
Cromatograe: Denitia IUPAC: Cromatograa este o metoda zica de separare, in
care componentele care urmeaza sa e separate sunt distribuite intre
2 faze, din care una este stationara in timp ce cealalta se misca intr-o
directie bine denita.
Zgomot de detector: Este o schimbare in linia de fundal care nu este asociata cu solutia
eluata.
Extractie: Metoda de separare a componentelor.
Sistem gradient: Poate livra mai multi solventi in sistemul HPLC.
HPLC: Cromatograe lichida de inalta peformanta sau cromatograe lichida
de inalta presiune este o forma de cromatograe care aplica presiune
foarte mare pentru a trece mai repede o solutie prin coloana.
Sistem izocratic: Sistem HPLC cu un solvent.
Matrice: Substante precum cerealele, condimentele etc care trebuie testate
(marfa).
13
38 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
Glossary
Faza mobila: Faza care se misca intr-o directie bine denita transportand proba prin
sistemul HPLC.
Micotoxine: Toxina produsa de fungi.
Contaminata natural: Toxina care se gaseste in mod natural in proba.
Pompa: Elibereaza un impuls continuu fazei mobile in injector, coloana si detec-
tor.
Precizie: Caracterizeaza gradul de intelegere mutuala intre o serie de rezultate
individuale.
Recuperare: Procentul de toxina detectat care poate calculat prin testarea unei
probe cunoscute.
Repetabilitate: Variatia intre masuratorile efectuate de o singura persoana sau
instrument pe acelasi produs si in aceleasi conditii.
Reproductibilitatea: Este abilitatea unui test sau experiment sa e reprodus cu precizie, sau
replicat, de altcineva lucrand in mod independent.
Timp de retentie: Timpul necesar unui anume analit sa treaca prin sistem (de la coloana
la detector) in anumite conditii.
Proba: Substanta analizata in cromatograma. Poate constituita dintr-un
singur component sau un amestec.
Solutie: Se refera la componentele probei.
Solvent: Lichidul care dizolva un solid sau solutie.
Proba forticata: O proba care a fost contaminata cu o concentratie cunoscuta de toxina.
Solutie de forticare: Solutie de concentratie cunoscuta care se adauga probei pentru a
forma proba forticata.
Curba standard: Este un instrument de cercetare cantitativ, o metoda de desenare a unor
date de analiza utilizata in determinarea concentratiei unei substante.
13
39
40 R-Biopharm Rhne Mycotoxine Manual Technic
R-Biopharm Rhne Ltd
Mycotoxin
Technical Manual
August 2008
R-Biopharm Rhne Ltd
Block 10 Todd Campus
West of Scotland Science Park
Acre Road, Glasgow G20 0XA
Phone: +44 (0) 141 945 2924
Fax: +44 (0) 141 945 2925
www.r-biopharm.com