UNIVERSITATEA TEHNIC CLUJ-NAPOCA CENTRUL UNIVERSITAR NORD BAIA MARE

METODE CROMATOGRAFICE DE SEPARARE

Metode de analiza

2013

DETERMINAREA LIPOFILICITII UNOR

ANTIOXIDANI I NDULCITORI PRIN METODE CROMATOGRAFICE I METODE COMPUTAIONALE

- Autor
RODICA DOMNICA BRICIU Cluj-Napoca, 2010

Cuvinte Cheie: Lipofilicitate

Vitamine lipofile Flavonoide ndulcitori Cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC) Cromatografie pe strat subire de nalt performan (TLC) Faze stationare cromatografice impregnate Analiza componentelor principale (PCA)

Introducere
Lipofilicitatea este definit de IUPAC ca fiind afinitatea unei molecule sau a unui amestec de compui pentru un mediu lipofil, determinarea valoric a acesteia fiind o consecin a comportamentului de distribuie ntr-un sistem bifazic, fie lichid-lichid, fie lichid-solid. Importana acestui parametru se regsete n contextul monitorizrii comportamentului n mediu biologic al unui compus dat, ntruct se consider c valoarea lipofilicitii descrie indirect procesul de adsorbie, distribuie, metabolizare i eliminare (ADME). Exist mai multe posibiliti de determinare a lipofilicitii, ns tehnicile cromatografice sunt cu desvrire cele mai reprezentative. Posibilitatea abordrii mai multor tehnici cromatografice n vederea estimrii

lipofilicitii prezint un avantaj semnificativ datorit faptului c rezultatele obinute prin mai multe metode pot s se valideze reciproc.

Scopul lucrrii
Scopul aceste lucrri este s ofere o caracterizare pertinent a unora dintre cele mai importante grupuri de compui cu o importan relevant n domeniul alimentar i farmaceutic. De asemenea, cromatografia de lichide i cromatografia pe strat subire vor fi analizate n contextual investigrii lipofilicitii, determinndu-se particularitile specifice. Un numr larg de indici de lipofilicitate teoretici i experimentali vor fi investigai, caracterizai i comparai ntre ei. Prin intermediul cromatrografiei pe strat subire, folosindu -se posibilitile de impregnare a plcilor normale de silicagel cu diverse uleiuri i grsimi naturale, incluznd aici i grsimea uman, se dorete elucidarea mai corect a modului de aciune biologic a acestor compui. De asemenea, folosindu-se Analiza Componentelor Principale (PCA), se va efectua o analiz pertinent n vederea stabilirii nivelului caracterului lipofil al grsimilor i a uleiurilor, pentru a arta care dintre grsimile i uleiurile studiate sunt mai apropiate de grsimea uman.

Determinrile cromatografice a lipofilicitii au creat un fundament n experimentele QSAR, pornindu-se de la supoziia c fazele staionare inverse pot fi asociate cu membranele biologice reale. Totui, complexitatea real regsit la nivel celular nu poate fi reprodus, fapt ce duce la necesitatea abordrii unor noi alternative. Aceast posibilitate poate veni dintr-un domeniu cromatografic neexplorat n acest domeniu i anume cromatografia pe strat subire, folosindu-se plci impregnate. Posibilitatea de impregnare cu diverse uleiuri i grsimi a plcilor de silicagel vine s susin i s ofere noi alternative. Rezultatele obinute pe grsimea uman vor susine relevana experimentelor realizate. Aceste rezultate, alturi de cele obinute prin HPLC vor crea pentru prima dat o ierarhie real, att a compuilor implicai n acest studiu, ct i a fazelor staionare, inclusiv a uleiurilor, respectiv a grsimilor folosite la impregnare. Literatura de specialitate nu prezint determinri similare sau nrudite, astfel c trebuie apreciat faptul c att clasele de compui investigate, folosirea de plci impregnate cu diverse materiale lipofile, ct i o parte din metodologiile de investigare a rezultatelor obinute au fost aplicate aici pentru prima dat.

Materiale i aparatur

Toate materialele folosite au respectat condiiile de calitate analitice. Cromatografia de lichide a vitaminelor i a flavonoidelor s -a realizat folosindu-se un sistem cromatografic Agilent 1100 Series cuplat cu spectrometru de mas MSD 1100, n timp ce ndulcitorii au fost analizai pe un cromatograf de lichide Agilent 1200 Series cuplat la un spectrometru de mas n tandem 4000 Q TRAP LC-MS/MS.

Cromatografie

1.Vitaminele lipofile Vitaminele lipofile au fost analizate prin HPLC i TLC folosindu -se mai multe tipuri de faze staionare chimic legate, iar n cazul TLC s-au introdus o serie de faze staionare obinute n urma impregnrii cu uleiuri sintetice (parafin i trioxtilamina) i uleiuri vegetale (msline, floarea soarelui i porumb). Condiiile de eluie sunt prezentate n Tabelul 1.

Tabel 1. Sistemele de faz mobil corespunztoare diferitelor faze staionare investigate.

Nr

Faz staionar

Faz mobil MeOH (%) HPLC 86-90: variabilitate de 1% 86-90: variabilitate de 1% TLC 95-99: variabilitate de 1% 89-97: variabilitate de 2% 71-83: variabilitate de 3% 90-94: variabilitate de 1% 92-98: variabilitate de 2% 90-98: variabilitate de 2% 90-98: variabilitate de 2% 90-98: variabilitate de 2%

1 2 1 2 3 4 5 6 7 8

Lichrosphere RP-18e Eclipse XDB-CS RP-18 RP-18W CN Parafin TOA Msline Floarea Soarelui Porumb

2. Flavonoidele Flavonoidele au fost analizate prin HPLC i TLC folosindu -se un numar mare de faze staionare, unele obinute n urma impregnrii cu uleiuri sintetice (parafina i trioctilamina), uleiuri vegetale i produse derivate (msline, floarea soarelui, porumb i margarina) i grsimi animale (ulei de cod, unt, grsime de oaie, grsime de gin, grsime de porc i grsime uman). Sistemele de faze mobile folosite pentru eluia fazelor staionare luate in considerare sunt prezentate n Tabelul 2.
Tabel 2. Sistemele de faz mobile corespunztoare diferitelor faze staionare investigate.

Nr Faz staionar

Faz mobil MeOH (%) HPLC 70-80: variabilitate de 2.5% 70-80: variabilitate de 2.5% 66-70: variabilitate de 1% TLC 65-85: variabilitate de 5% 55-75: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 20-40: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5% 55-75: variabilitate de 5% 55-75: variabilitate de 5% 55-75: variabilitate de 5% 50-70: variabilitate de 5%

1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

LiChrosphere RP-lSe Eclipse XDB-CS Lichrosphere 100CN RP-18 RP-18 W CN NH2 Parafin TOA Msline Floarea Soarelui Porumb Margarina Unt Cod Porc Gin Oaie Om

3. ndulcitorii ndulcitorii au fost analizai n vederea investigrii lipofilicitii prin TLC pe faze staionare chimic legate (RP-18, RP-18W, RP-8, CN i NH2) i faze staionare impregnate (parafin, msline, floarea soarelui, porumb, ricin, margarin, unt, cod, porc, gin, oaie, om). Faza mobil a fost amestecuri de acetonitril (ACN): apa, n care fracia de ACN a variat ntre 85 i 95%, schimbate cu 15 incremente de 2.5%, cu excepia

plcilor de NH2, unde intervalul ales a fost ntre 65 i 85% schimbat cu incremente de 5% pentru fiecare pas. Pentru fazele staionare impregnate procentul de ACN a fost ntre 70 i 90%, schimbate cu incremente de 5%. Analiza HPLC a ndulcitorilor a avut ca scop modelarea reten iei cromatografice a zaharidelor. Pentru aceasta zaharidele au fost analizate pe o coloan cromatografic Supelcosil NH2. Eluiile s-au realizat n mod izocratic cu cinci faze mobile constnd din amestecuri ACN: ap, unde procentul de ACN a variat ntre 80-90%.

Studiul i caracterizarea cromatografic a vitaminelor, a flavonoidelor i a ndulcitorilor

1.Vitamine lipofile

Figurile 1-4.Reprezentarea grafic a variabilitii valorilor log k i n funcie de concentraia modificatorului organic. A: HPLC RP-18, B: RP-18W, C: TOA, D: Msline.

Se observ clar faptul c -carotenul i licopenul au de departe cele mai ridicate valori ale lipofilicitii. Structura simetric a acestor dou molecule i faptul c prezint o mas molecular mare i fr gruprii funcionale polare le susine ca fiind cele mai lipofile.

Chiar dac mrimea moleculelor este asemntoare carotenilor, prezena oxigenului n molecul cauzeaz un efect polar puternic, care rezid n valorile indicilor de lipofilicitate. Dintre compuii studiai n acest experiment, retinoidele prezint cel mai sczut caracter lipofil. Aceasta este o consecin a mrimii moleculei i a prezenei gruprilor funcionale hidroxil, carboxil i carbonil din molecule. Tendina compuilor de a interaciona sau nu cu faza staionar i implicit variaia parametrilor cromatografici odat cu schimbarea procentului de modificator organic din faza mobil se poate observa din extrasul din figurile de mai sus. Analiznd n detaliu graficele expuse se observ c nu exist anomalii n comportamentul cromatografic, acesta fiind unul liniar, respectnduse o cretere proporional a valorilor logk i modificator organic din faza mobil. n funcie de fracia de

2. Flavonoide

Flavonoidele studiate au fost compui metil, metoxi i hidroxi deriva i. Indici de lipofilicitate obinui indic faptul c derivai metil sunt cei

mai lipofili, urmai de cei metoxiderivai i de compui hidroxi derivai. Compui poli-hidroxi derivai sunt mult mai hidrofili.

C
Figurile 5-8. Reprezentarea grafic a variabilitii valorilor log k i RM n funcie de concentraia modificatorului organic: A: HPLC RP-18, B: RP-18, C: Porumb, D: Om.

Comportamentul cromatografic al flavonoidelor odat cu schimbarea raportului de faz mobil s-a artat a fi unul echilibrat, mecanismul de retenie fiind unul unitar pe tot intervalul de 25 faz mobil ales, indiferent dac fazele staionare au fost foarte diferite, remarcndu-se

similariti ntre fazele staionare chimic legate i cele obinute prin impregnare.

Figura 9-12. Profilele de corelaie a valorilor RM0 obinuti prin TLC.

Se remarc similitudini ridicate intre diversele faze staionare, nsa cele mai asementoare sunt uleiurile i grsimile, inluznd aici i grsimea uman. Diagramele obinute permit remarcarea unui comportament diferit al compuilor pe plcile impregnate cu TOA,

care a facilitat interaciuni puternice cu flavonoidele ce prezint grupri funcionale metoxil i metil, i interaciuni mult mai slabe cu derivai hidroxil. Acest comportament observat susine nc odat aprecierile prezentate pentru vitamine.

Concluzii

Vitaminele lipofile Indicii de lipofilicitate obinui pentru vitaminele lipofile au avut valori foarte mari, distingndu-se dintre acetia carotenii ca fiind cei mai lipofili (-caroten > licopen), urmai de tocoferoli (tocoferol > -tocoferol > -tocoferol), xantofile (lutein zeaxantin > astaxantin) i retinoide (all-trans retinal 9-cis retinal > acid retinoic > retinol). Lipofilicitatea vitaminelor depinde n foarte mare msur de prezena gruprilor funcionale polare (hidroxil) n molecul, de numrul i respectiv poziia acestora. Cei mai reprezentativi indici de lipofilicitate obinui au fost mediile parametrilor de retenie i scorurile dup primele

componente principale obinute n urma analizei componenetelor principale. Hrile de lipofilicitate folosite pentru gruparea i estimarea caracterului lipofil al vitaminelor lipofile au condus la grupuri i clusteri liniari care sunt n mare concordan cu particularitile structurale ale compuilor.

Flavonoidele

Flavonoidele au fost investigate din punct de vedere al lipofilicitii prin cromatografie de lichide de nalt eficien (RP18, RP-8 i CN) i prin cromatografie pe strat subire, folosindu-se plci chimic legate (RP-18, RP-18W, CN i NH2) i plci impregnate cu uleiuri sintetice (ulei de parafin i TOA), uleiuri vegetale i produse derivate (ulei de msline, ulei de floarea soarelui, ulei de porumb i margarin) i grsimi animale (unt, ulei de cod, grsime de om, grsime de porc, grsime de oaie, grsime de gin). Comportamentul cromatografic al flavonoidelor pe toate fazele staionare a fost unul uniform de cretere odat cu creterea concentraiei modificatorului organic din fazele staionare, excepie fcnd comportamentul observat pe plcile NH2 unde

derivaii hidrozil au artat un comportament cresctor, n timp ce derivai metoxilai i cei metilai au condus la valori mai mici ale parametrilor de retenie. Flavonoidele studiate au condus la indici de lipofilicitate grupa i n funcie de tehnica folosit (HPLC sau TLC) i n funcie de natura fazelor staionare (chimic legate sau impregnate). Plcile impregnate cu TOA folosite la investigarea vitaminelor lipofile i a flavonoidelor au condus la un comportament pu in diferit fa de restul plcilor investigate. S-a remarcat faptul c interaciunea compuilor cu faza staionar variaz foarte mult odat cu creterea numrului de grupri hidroxil din molecule.

Bibliografie selective

http://goldbook.iupac.org/LT06965.html 2. J. Sangster, Octanol-water partition coefficients of simple organic compounds J. Phys. Chem. Ref. Data 1998, 18, 1111-1229. 3. D. Casoni, A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Srbu, Lipophilicity data for some preservatives estimated by reversed-phase liquid chromatography and different

computation methods, J. Chromatogr. A, 2009, 1216, 2456-2465. 4. R.D. Briciu, A. Kot-Wasik, J. Namiesnik, C. Srbu, A comparative study of the molecular lipophilcity indices of citamins A and E and of some precursors of vitamin A, estimated by HPLC and by different computation methods, Acta Chromatogr. 2009, 21, 237-250. 5. L.R. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd Ed. John Wiley and Sons, New York, USA, 1979. 6. R.D. Briciu, D. Casoni, Lipophilicity estimation of some flavonoids by reverse phase thin-layer chromatography, Acta Universitatis Cibiniensis, Serie F Chemia, 2008, 11, 71-81. 7. D. Casoni, R.D. Briciu,Lipophilicity of parabens estimated by reverse-phase high performance thin-layer chromatography and different computation methods, Acta Universitatis Cibiniensis, Serie F Chemia, 2008, 11, 71-81. 8. R. Kalizsan, Structure and Retention in Chromatography: A Chemometric Approach, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997. 9. P. Haber, T. Bauczek, R. Kaliszan, L.R. Snyder, J.W. Dolan, C.T. Wehr, Computer simulation for the simultaneous optimization of any two variables and any chromatographic procedure, J. Chromatogr. Sci. 2000, 38, 386-392. 10. K. Valko, R.L. Snyder, J.L. Glajch, Retention in reversed-phase liquid chromatography as a function of mobile-phase composition, J. Chromatogr. A, 1993, 656, 501-520. 11. T. Kowalska, K Kaczmarski, W. Prus, Theory and mechanism in thin-layer chromatography, In J. Sherma, B. Fried (Eds.), Handbook of Thin Layer Chromatography, Marcel Dekker, New York, USA, 2003, pp. 47-80.

12. E.C. Bate-Smith, R.G. Westall, Chromatographic behavior and chemical structure I. Some naturally occuring phenolic substances, Biochem. Biophys. Acta 1950, 4, 427-440. 13. E. Soczewinski, C.A. Wachtmeister, The retention between the composition of certain ternary two-phase solvent systems and RM values, J. Chromatogr.A. 1962, 7, 311-320. 14. K. Valk, P. Segel, New chromatographic hydrophobicity indices (0) based on the slope and the intercept of log k versus organic phase concentration plot, J. Chromatogr. A 1993, 631, 49-61. 15. C.M. Du, K. Valk, C. Bevan, D. Reynolds, Rapid gradient RP-HPLC method for lipophilicity determination: A solvation equation based comparison with isocratic methods, Anal. Chem. 1997, 70, 4228-4234. 16. I.V. Tetko, Prediction of phisicochemical properties, In S. Ekins (Eds.), Risk Assessment for Pharmaceutical and Environmental Chemistry, John Wiley and Sons, New Yersy, USA, 2007, pp. 241-275. 17. R. Mannhold, G.I. Poda, C. Ostermann, I.V. Tetko, Calculation of molecular lipophilicity: State of the art nd comparison LogP methods on more than 96000 compounds, J. Pharm. Sci. 2009, 98, 861-893. 18. G.L. Biagi, A.M. Barbaro, M.C. Guerra, G. Gantelli-Forti, M.E. Fracasso, Relation between 33. 19. H. F. Pop, C. Srbu, A new fuzzy regression algorithm, Anal. Chem. 1996, 68, 771-778. 20. A. G. Gonzles, M. A. Herrador, A. G. Asuero, Intra-laboratory testing of methos accuracy from recovery assays, Talanta, 1999, 48, 729-736. and RM values of sulfonamides, J. Med. Chem. 1974, 17, 28-