Sunteți pe pagina 1din 9

BAB III ISI

Sebagian besar penelitian mengenai protein apoptin, dalam pemisahan atau purifikasi apoptinnya menggunakan metode immunoprecipitation. Selain itu, metode yang digunakan adalah affinity chromatography dan knockdown. Berikut akan dijelaskan menganai ketiga metode tersebut berdasarkan prinsip atau teori yang telah ada. Selanjutnya, masing-masing metode akan dijelaskan protokol dan bahan yang digunakan pada aplikasi dalam penelitian-penelitian yang telah dilakukan. Immunopresipitation Sebagai gambaran prinsip dari immunopresipitation, berikut merupakan ilustrasi yang akan dijelaskan. Misalkan ada campuran protein, protein a dan b. Immunoprecipitation menggunakan antibody melawan protein a. Maka akan didapatkan protein b, yang kemudian di analisis menggunakan gel elektroporesis. Protein a dan b akan bereaksi membentuk komlplek protein dan ditambahkan antibody yang melawan protein a. Kemudian menambahkan protein A atau protein G sepharose untuk menangkap semua kompleks (protein a+protein b+antibody). Kemudian, menghilangkan impuriti dengan larutan. Kemudian mengelusi interaksi komplek, ikatan protein a dan protein b. Menganalisis protein yang telah terelusi menggunakan gel elektroporesis. Protein b dideteksi dengan analisis western blot. Penjelasan diatas meerupakan proses immunopresipitation secara sederhana. Pada penelitian, prinsip pemisahan tersebut biasanya dilakukan dengan tahap-tahap yang umum seperti: 1. Melisis cell yang didalamnya mengandung protein yang akan dipisahkan menggunakan buffer 2. Men-sentrifuge lysate dan memisahkan supernatant 3. Mengambil supernatant yang kemudian ditambah dengan antibody 4. Melakukan immunopresipitation Immunopresipitation dilakukan dengan mereaksikan protein yang kita inginkan dengan protein lain, kemudian menambahkan antibody, menambahkan protein A/G dengan segharose, membasuh dengan buffer lain. 5. Setelah di-immunopresipitation, kemudian dilakukan SDS-PAGE 6. Analisis terkahir menggunakan western blot Ada lima jenis immunoprecipitation yaitu: Individual protein immunoprecipitation (IP), Protein complex immunoprecipitation (Co-IP), Chromatin immunoprecipitation (Chip), RNA

immunoprecipitation (RIP), dan Tagged protein. Pada makalah ini, penulis hanya akan menjelaskan tiga diantaranya yaitu IP, Co-IP dan Tagged protein. Individual protein immunoprecipitation (IP) secara tradisional mengisolasi protein tunggal. Menggunakan satu antibody yang spesifik terhadap satu protein yang telah diketahui. IP dilakukan untuk memisahkan protein dari sel yang telah dilisis (cell lysate) sehingga dapat diketahui identitas, struktur, ekspresi, aktivitas atau modifikasi dari sebuah protein. IP juga digunakan untuk mempelajari interaksi protein yang diinginkan dengan protein lain atau asam nukleat.

Co-immunoprecipitation (Co-IP), cara kerja dari metode ini hampir sama dengan IP, namun protein yang terpisahkan adalah protein kompleks. Pada sebuah larutan yang terdapat protein yang ingin kita pisahkan, kedalamnya kita beri antibody yang mengenali salah satu protein yang telah diketahui. Protein tersebut merupakan protein yang berikatan dengan protein-protein lain pada suatu kompleks protein. Ketika sebuah antibody mengenali salah satu dari protein tersebut, maka atibody akan menarik semua protein kompleks sehingga protein-protein yang belum diketahui yang terikat bersama protein yang dikenali antibody juga akan ikut tertarik dan terpisah. Hal diatas akan dapat terjadi jika protein kompleks saling berikatan dengan kuat. Co-IP ini selain digunakan untuk pemisahan protein juga digunakan untuk mempelajari interaksi protein dengan protein. Pada gambar 1. Larutan berisi protein kompleks dan protein-protein lain atau molekul-molekul lain sebagai kontaminan. Kemudian ditambahkan antibody yang mengenali salah satu protein (warna biru muda) dalam protein kompleks. Larutan selanjutnya ditambahkan protein A atau G atau dapat pula berupa magnetic beads yang ukuran molekulnya lebih besar untuk menangkap antibody beserta protein kompleks sehingga terbawa ke bawah ketika dilakukan sentrifugasi (presipitasi). Setelah terendap, endapan yang ternyata merupakan campuran protein yang diinginkan diambil dan kemudian dianalisis dengan SDS-PAGE dan western blot.

Gambar 1.Proses Co-IP dalam campuran yang mngandung protein yang diinginkan Sumber: www.leinco.com/immunoprecipitation Tagged Protein digunakan jika antibody untuk mengikat protein yang ingin dipisahkan tidak tersedia. Para enggineer membuat tag untuk digunakan sebagai umpan yang digunakan untuk menggantikan fungsi dari antibody. Tag-ta ini akan mengikat protein yang diingikan pada C-terminal dan N-terminal. Keuntungan menggunakan tag adalah dapat diguakan pada banyak jenis protein dan dapat digunakan bersama antibody untuk menambah afinitas pengikatan protein. Namun, kekurangannya adalah harga dari tag yang digunakan biasanya lebih mahal daripada menggunakan antibody hasil ekspressi makhluk hidup.

Tag-tag tersebut dapat berupa sekuens pendek peptida atau protein fluorescent, seperti:

Flag; peptide sequence DYKDDDDK c-Myc; peptide seqence EQKLISEEDL Hemagglutinin (HA); peptide sequence YPYDVPDYA Green fluorescent protein (GFP) Glutathione-S-transferase (GST) Poly-His V5

Beberapa tag tersebut dapat membantu kelarutan protein. Berdasarkan survey yang diakukan oleh Labome, dari 1957, 271 diantaranya menggunakan tag sebagai metode purifikasi dan pendeteksian protein. Berikut penggunakan tag pada penelitian yang telah dipublikasikan: Tabel 1. Penggunaan tag dalam penilitian protein yang telah dipublikasikan tag FLAG GFP GST HA HIS C-Myc V5 num 88 60 60 43 41 69 20

Pada tabel hasil survei ditunjukkan bahwa FLAG tag paling banyak digunakan. Anaslisis penulis terkait hasil tersebut adalah dikarenakan FLAG tag memiliki kelebihan dari tag yang lain seperti lebih hidrofilik sehingga tidak mengakibatkan denaturasi protein atau mengakibatkan protein tidak aktif. Jika pada tag lain antibody monoklonal harus diisolasi terlebih dahulu terhadap protein yang ada kemudian epitope (peptida protein) dikarakterisasi untuk digunakan sebagai tag, pada FLAG tag, FLAG didesain terlebih dahulu sehingga antibody monoklonal akan dikenali. Selain itu alasan lain mengapa FLAG tag paling digunakan adalah karena tag ini merupaan tag pertama kali yang telah dipatenkan dan lebih dulu dikomersialkan dari pada tag-tag yang lain. Terlepas dari alasan-alasan itu, penggunaan tag juga dipengaruhi oleh protein yang akan kita pisahkan, keadaan larutan dan sel yang digunakan serta biaya yang akan dikeluarkan. Metode Immunoprecipitation

Langsung dan tidak langsung Immunoprecipiation yang dilakukan secara langsung adalah ketika antibody yang digunakan telah dipasangkan dengan beads (substrat berbentuk padat). Kemudian, campuran protein yang akan dipisahkan ditambahkan ke beads tersebut sehingga protein yang diinginkan akan tertangkap oleh antibody. Immunoprecipitation secara tidak langsung dilakukan dengan menambahkan antibody ke campuran protein. Antibody akan mengikat protein yang sesuai seiring berjalannya waktu. Kemudian kedalam campuran, ditambahkan protein A/G . Protein A/G adalah protein gabungan (fusion proteins) dari IgG dari protein A dan protein G, dari gabungan ini terbentuk protein yang berukuran 50,4 kilo dalton. Dengan adanya protin A/G yang mengikat antibody dan protein yang dinginkan akan menjadikan bentukan yang besar sehingga dapat menuju ke beads dan tertempel. Kedua metode tersebut sebenarnya sama disisi bahan-bahan yang digunakan dan hasil akhir yang didapat. Namun metode secara tidak langsunglebih dipilih ketika konsentrasi protein target rendah dan afinitas antibody yang digunakan lemah. Selain dua alasan tersebut, kinetika pengikatan yang lambat juga menyebabkan metode tidak langsung lebih dipilih.

Batch dan Kolom Pada metode Batch, campuran protein yang biasanya berupa buffer yang didalamnya telah diberi sel lysate dan antibody pengikat protein target, dicampur cemua dalam tabung reaksi (biasanya tabung sentrifuge). Setelah didiamkan beberapa waktu agar terjadi pengikatan antara antibody dengan protein, campuran disentrifuge. Komponen yang menjadi kontaminan yang biasanya berada di fase atas, secara perlahan dipisahkan dengan mengambilnya secara manual dengan pipet. Pada metode Kolom, resin beads disusun pada kolom plastik atau kaca. Campuran dialirkan ke dalam kolom dan diinkubasi beberapa waktu sehingga antibody dapat bereaksi dengan protein. Campuran akan terpisah akibat gaya grafitasi (jika menggunanakan gravity flow) atau pengendapan (jika menggunakan sentrifugasi). Pemilihan metode ini didasarkan pada banyak sedikitnya larutan yang akan dipisahkan. Pada skala yang besar, metode yang dipilih adalah menggunakan kolom. Penggunaan metode batch masih dapat dilakukan untuk pemisahan skala besar, tetapi perlu pegulangan pekerjaan sehinga memakan waktu. Selain itu, pemisahan supernatant yang dilakukan secara manula terkadang tidak akurat sehingga kontaminant masih ikut terbawa sehingga yield yang didapat tidak maksimal.

Tabung microsentrifuge untuk metode batch Sumber: http://www.extragene-web.com

Kolom yang digunakan dalam Immunoprecipitation Sumber: http://www.activemotif.com/catalog/19.html Material yang terlibat Buffer Buffer yang digunakan dalam immunoprecipitation ada tiga jenis. Masing-masing buffer ini memiliki fungsi yang berbeda. a. Lysis Buffer Merupakan larutan yang digunakan untuk melisis sel. Lysis buffer untuk

immunoprecipitation berbeda dengan lysis buffer untuk perlakuan separasi dengan metode lain atau percobaan lainnya. Hal tersebut dikarenakan lysate dari sel yang dibutuhkan akan berbeda hasilnya bergantung dengan buffer yang digunakan. Larutan ini juga akan mempengaruhi kualitas dari sel lysate seperti konformasi bentuk natif protein, , kemampuan menginhibisi aktivitas enzimatik, sisi ikat antibody, denaturasi dan

kemampuan protein keluar dari jaringan sel. Komposisi lysis buffer akan berbeda sesuai dengan protein yang akan kita pisahkan menggunakan immunoprecipitation. Hal ini disebabkan oleh lokasi dari protein di dalam sel,seperti di membran, sitosol atau nukleus, yang menyebabkan kemudahan protein terambil ketika terjadinya lysis. Buffer yang tidak mendenaturasi (non-denaturing buffer) digunakan ketika antigen yang digunakan berupa detergent yang larut dan antibody dapat mengebali bentuk native. Buffer ini mengandung detergent non-ionik seperti NP-40 atau Triton X-100.

Buffer yang mendenaturasi (denaturing buffer) digunakan ketika protein yang akan kita pisahkan sulit untuk diambil dari jaringan sel dan antibody tidak dapat mengenali protein dalam bentuk asli atau natifnya. Oleh karena itu perlu larutan untuk mengubah bentuk protein atau dengan kata lain mendenaturasi. Contoh buffer ini adalah Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA). Buffer ini lebih keras dibandingkan dengan buffer non-denaturinng karena mengandung detergen ionik seperti SDS atau sodium deoxycholate. Buffer ini juga dapat merilis protein nuclear (protein yang berasal dari inti sel). Biasanya buffer iniberupa NaCl dan Tris-HCl dan memiliki pH (7.4 to 8). Selain itu buffer ini bisa hanya terdiri dari EDTA dalam phosphate buffered saline (PBS). Berikut merupakan tabel mengenai kisaran komposisi dari masing-masing komponen untuk mendapatkan buffer yang optimal untuk melisis sel yang akan digunakan untuk immunoprecipitation. Tabel 2. Komponen masing-masing Komponen Detergen non-ionik (NP-40, Triton X-100) Detergen Ionik (SDS, sodium deoxycholate) NaCl (sodium chloride, garam) Kation divalent pH EDTA Kisaran komposisi 0.1 - 2% 0,01- 0,5 % 0 - 1M 0 - 10mM 6-9 0 - 5mM

Sel lysate mengandung protease dan fosfat yang dapat mengubah atau mendegradasi protein yanng kita inginkan. Oleh karena itu, immunoprecipitation banyak dilakukan pada suhu 4oCdan ditambahkan inhibitor protease dan fosfat PMSF, aprotinin and leupeptin sodium orthovanadate atau sodium fluoride.

Gambar. Lysis buffer untuk immunoprecipitation Sumber: http://www.piercenet.com/product/pierce-ip-lysis-buffer b. Buffer pengikat dan pencuci (binding and wash buffer)

Binding buffer digunakan untuk menstabilkan keadaan dimana antibody dan protein yang akan diikat melakukan interaksi hingga terjadinya pengikatan. Interaksi antibody-antigen akan terjadi ketika pH mendekati netral. Buffer yang mengandung kekuatan ion standart seperti PBS dapat mempermudah pengikatan antara antibody dan protein. Setelah terjadi pengikatan, seiring waktu berjalan, pengendapan pada

immunoprecipitation masih tetap berlanjut. Komponen yang tidak diinginkan dan ikut mengendaptersebut harus segera dihilangkan. Penghilangan tersebut dilakukan dengan pemberian buffer seperti dapat dengan PBS itu sendiri atau dengan detergen dengan konsentrasi rendah atau dengan garam dengan konsentrasi moderat. c. Buffer pengelusi Pada prinsipnya, buffer pengelusi ini mendisosiasi interaksi protein-protein atau antibodyantigen agar dapat terelusi. Buffer ini membantu sisa protein yang tertinggal dalam wadah (kolom atau tabung microsentrifuge) sehingga dapat terelusi secara sempurna. Selain itu, bahan kimia yang terdapat dalam buffer ini juga dapat mengatur pH larutan sehingga pH tetap pada range yang diiginkan sehingga struktur molekul yang kita perlukan tidak rusak. Buffer pengelusi yang paling banyak digunakan untuk pemurnian protein menggunakan prinsip interaksi antibody-antigen adalah 0.1 M glycineHCl dengan pH 2.5-3.0. Namun, beberapa antibody dan protein akan rusak pada pH rendah, sehingga sangat dianjurkan untuk menetralisir larutan dengan 1/10th volume buffer alkali seperti 1 M TrisHC pada pH 8.5. Tabel... Macam-macam buffer pengelusi (elution buffer) untuk menggunakan immunoaffinity purifikasi protein

Agarose Beads Resin yang lazim digunakan dalam immunopprecipitation. Bentuk dari beads ini adalah seperti spons. Berukuran 20-150 m. Karena ukurannya yang menjadikannya memiliki permukaan yang luas dan terdapatnya poros, mengakibatkan beads ini memiliki kapasitas pengikatan terhadap antibody lebih besar. Kelebihannya adalah tahan lama dan kuat sehingga dapat tahan terhadap sentrfugasi hingga 5000 x g. Tidak rusak pada tekanan 100 psi, suhu 120 oC dan pH larutan yang ekstrim.

Gambar Bead Agarose Sumber: http://course1.winona.edu/sberg Superparamagnetic Beads Tidak seperti agarose, beads ini memiliki bentuk bulat padat (tidak berporos) dan ukurannya lebih kecil (1-4 m). Maka dari itu kapasitas penempelan antibody lebih kecil. Diperlukan rasio yang tepat antara volume larutan yang isinya ingin dipisahkan dengan volume beads ini. Pada aplikasinya, penggunaan beads ini digunakan pula magnet berkekuatan tinggi sehingga dapat menarik magnetic beads ini ke sisi yang diinginkan. Maka dari itu, dalam penggunaannya tidak diperlukan sentrifugasi yang dapat merusak komponen. Pemisahannya pun lebih efisien. Namun, karena diperlukan peralatan yang lebih canggih, percobaan tidak terlalu sering menggunakan alternatif ini dikarenakan keterbatasan biaya.

Gambar Superparamagnetic (PVA) Beads Sumber: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pola.v46:1/issuetoc Antibody Antibody Sekunder

Strategi Optimasi

Complex binding High Background from Nonspecific Interactions Antibody Contamination

Contoh Aplikasi Dari jurnal: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Affinity Chromatography

S-ar putea să vă placă și