PROCEDEE DE OBINERE I PURIFICARE A NOILOR PREPARATE ANTIOXIDANTE DE ORIGINE PROTEIC DIN BIOMASA CIANOBACTERIEI SPIRULINA PLATENSIS

Efremova Nadejda*, Reva Veaceslav*, Bulimaga Valentina*, Gulea Aurelian**, Chiriac Tatiana***, Rudic Valeriu*** *Centrul de Cercetri tiinice tiine ale vieii, USM **Catedra Chimie anorganic i zic, USM ***Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM Introducere Elucidarea rolului diferitor forme de radicali liberi n apariia i evoluia unor maladii cronice este comparabil cu stabilirea rolului microorganismelor ca ageni patogeni ai bolilor infecioase [3, 18, 22, 24]. n caz de dezechilibru ntre formarea de radicali liberi i sistemul de protecie antioxidant, n celule apare stresul oxidativ, considerat cauza apariiei i evoluiei diferitor maladii [20,24,25,27,32,33,35,36]. Astfel, n ultimele decenii s-a intensicat interesul cercetrilor fa de antioxidani, principii active funcionale responsabile de neutralizarea efectelor negative ale stresului oxidativ asupra organismelor vii [1-2, 8, 17]. n vederea obinerii antioxidanilor naturali, sunt explorate materiile vegetale, dintre care unei valoricri tot mai intense sunt supuse cianobacteriile i microalgele. Este de menionat i faptul c antioxidanii obinui din surse naturale, precum este biomasa de cianobacterii i microalge, sunt mai ecieni n comparaie cu antioxidanii sintetizai pe cale chimic [28]. Cianobacteria Spirulina platensis poate considerat drept o surs valoroas de antioxidani, graie prezenei n spectrul de compui cu activitate biologic nalt pe care l ofer a antioxidanilor de natur proteic (cocianina pigment aposolubil, enzimele: superoxiddismutaza, catalaza, peroxidaza, etc. ) [18, 31]. Enzima superoxiddismutaza (SOD) este reglatorul principal al proceselor de oxidare n celul i poate utilizat pentru tratarea diferitor maladii [15, 16]. Ficocianina, un pigment aposolubil denot capacitatea de a neutraliza radicalul peroxinitrit, hidroxil i peroxil, precum i de a inhiba procesele de oxidare peroxidic a lipidelor, dezvoltnd de rnd cu mecanismul antioxidant i proprieti antiinamatoare, imunomodulatoare [6, 7, 9]. Preparatele antioxidante pe baza substanelor bioactive ale spirulinei pot utilizate i n cosmetologie n calitate de remedii de ncetinire a proceselor de mbtrnire a pielii datorit capacitii de reglare a sintezei colagenului i elastinei, precum i de vindecare a rnilor, arsurilor i de reducere a ridurilor [13]. Scopul investigaiilor a constituit elaborarea procedeelor de obinere i puricare a noilor preparate antioxidante de natur proteic din biomasa cianobacteriei Spirulina platensis. Materiale i metode Obiectul cercetrilor expuse a fost tulpina cianobacteriei Spirulina platensis CNMCB-02, depozitat n Colecia Naional de Microorganisme Nepatogene de pe lng Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM.

137

Biomasa de spirulin surs de cocianin i SOD a fost obinut conform a dou procedee, care au inclus cultivarea spirulinei n decursul a 144 ore pe mediul nutritiv SP - 1 n baloane Erlenmeyer cu volumul suspensiei de 100 ml, cu suplimentarea n a 3-a zi a unuia din compui coordinativi ai Mn(II): [Mn(COO(CHOH)2COO) (C3N2H4)2(H2O)2]nH2O sau Zn(II): [Zn(COO(CH2)4COO)2(C3N2H4)2(H2O)2]nH2O. Pe parcursul cultivrii s-au respectat parametrii: temperatura de 300C, iluminarea de 20003000 luci. Determinarea activitii superoxiddismutazei a fost efectuat conform metodei spectrofotometrice [10]. Coninutul de cocianin n biomasa spirulinei a fost determinat prin metoda spectrofotometric [11]. Coninutul de protein a fost apreciat conform metodei propuse de Lowry O. et al. [23]. Electroforeza n gel de poliacrilamid n prezena SDS a fost efectuat conform metodelor, descrise de Laemmli U. [21]. Chromatograa de schimb ionic (pe coloana de Q Sepharose) a fost realizat conform metodei [30]. Rezultate i discuii Meninerea unui nivel anumit al oxidrii radicallibere a acililor fosfolipidelor membranelor biologice este una din condiiile de baz ale homeostazei celulare. Activarea oxidrii peroxidice a lipidelor membranelor biologice n condiiile stresului oxidativ poate micorat sub aciunea diverselor substane bioactive. n acest aspect, biomasa de spirulin se impune i ca una din sursele non convenionale importante de substane cu rol de atenuare, mpiedicare i reducere a proceselor de oxidare peroxidic, graie faptului, c o mare parte din componentele bioactive ale biomasei de spirulin denot o activitate antioxidant. Printre acestea sunt: cocianina i una din enzimele antioxidante principale superoxiddismutaza. Biomasa de spirulin ofer circa 5% de cocianin, iar activitatea superoxidismutazei este de circa 0,2-0,3 un. conv. Coninutul de cocianin n biomasa de spirulin poate majorat, iar activitatea superoxiddismutazei poate intensicat prin utilizarea de noi stimuleni, precum i prin stabilirea condiiilor optime de producere a lor n condiii dirijate. Procedeele elaborate de noi la cultivarea dirijat a spirulinei asigur sporirea coninutului de cocianin (pn la 9,08 i 13,01 %, respectiv), precum i intensicarea activitii superoxiddismutazei (pn la 0,63 i 0,53 un. conv. , respectiv) n biomas. Biomasa de spirulin obinut conform acestor procedee a fost procesat n continuare pentru obinerea a 2 noi preparate antioxidante de natur proteic care includ separarea biomasei de spirulin de lichidul cultural; distrugerea celulelor prin congelare decongelare repetat; extragerea fraciei proteice ce conine SOD i cocianin cu utilizarea a tamponului fosfatic 0,1M Na, pH 7,8-8,0 (ce conine 10mM EDTA); centrifugarea fraciei obinute i separarea supernatantului; precipitarea izoelectric (pH 3,8 - 4. 0); separarea supernatantului cu coninut de antioxidani de natur proteic (SOD i cocianin); concentrarea i congelarea preparatelor antioxidante obinute SP - SOD/Phyco - 1 i SP - SOD/Phyco - 2. Compoziia preparatelor elaborate a fost stabilit prin electroforeza n gel de poliacrilamid n prezena SDS, electroforegrama ind prezentat n gura 1.

138

Figura 1. Electroforegrama preparatelor antioxidante obinute din biomasa de spirulin. M marcheri proteici; 1 proba preparatului SP - SOD/Phyco - 1; 2 proba preparatului SP - SOD/Phyco - 2; 3 proba martor.

Se tie c cocianina prezint un dimer, ce disociaz n condiiile de SDS electroforez n - i subuniti [26, 31]. Conform electroforegramei, masele moleculare ale subunitilor cocianinei sunt 18 i 19,95 kDa, respectiv. Aceste date sunt comparabile cu unele date de specialitate cunoscute, conform crora masa molecular a subunitilor cocianinei extrase din biomasa de spirulin sunt de 19,5 i 21 kDa [26]. Din studii anterioare, este cunoscut c masa molecular a diferitor tipuri de superoxiddismutaz la cianobacterii variaz n limitele 30 46 kDa [4, 14, 29, 34]. n biomasa cianobacteriilor se conine superoxiddismutaza erocomponent - FeSOD, care prezint un homodimer [14]. Masa molecular aparent a subunitilor SOD stabilit de noi este 28 kDa (g. 1). Se poate conchide deci, c preparatele antioxidante de natur proteic conin nu doar SOD i cocianin, dar i alte reziduuri de proteine. Pentru obinerea unui grad mai nalt de puricare a preparatelor elaborate, a fost efectuat cromatograa de schimb ionic pe coloana de Q - Sepharose (g. 2). Conform cromatogramei, n componena preparatelor cercetate au fost identicate 6 fracii proteice, ind stabilit c SOD se conine n fracia 3 (g. 2). Ficocianina reprezint un pigment de culoare albastr cu maximumul de absorbie la lungimea de und 620nm [5, 6, 9, 12, 31]. Analiza spectrofotometric la lungimea de und 620nm, a relevat prezena cocianinei n fracia 5.

139

Figura 2. Cromatograa de schimb ionic a preparatelor SP SOD/ Phyco 1 /SP SOD/ Phyco 2 Volumul probei- 5 ml; coloana Q - Sepharose; viteza 1 ml/min; soluia tampon : TRIS - HCl 20mM, pH 8,0; soluia tampon : NaCl 1M, TRIS - HCl 20 mM, pH 8,0. _______ - fracii proteice 1-6; - - - - - - - densitatea optic la lungimea de und 620 nm; --- - --- - --- - activitatea SOD.

Pentru determinarea tipului de superoxiddismutaz, fracia 3 a fost supus studiilor suplimentare privind efectul inhibitorilor asupra activitii SOD. Este cunoscut c Cu/ZnSOD este inhibat de KCN, n timp ce FeSOD i MnSOD nu sunt sensibile la cianur. Peroxidul de hidrogen este utilizat pentru a distinge FeSOD i MnSOD [19]. Au fost utilizai urmtorii inhibitori: H2O2, NaN3 i KCN (tabelul 1).
Tabelul 1. Determinarea tipului SOD Inhibitorii 50 KCN 10 H2O2 30 NaN3 Activitatea SOD +

Astfel, activitatea SOD de 100% nu s-a diminuat n prezena KCN, iar la utilizarea H2O2 i NaN3, activitatea enzimei a fost supus inhibiiei complete. n baza rezultatelor se poate presupune deci, c preparatele elaborate de noi conin forma erocomponent a superoxiddismutazei (FeSOD). Pentru determinarea omogenitii fraciilor proteice obinute, dou din aceste fracii (fr. 3 care posed activitate SOD i fr. 5 ce conine cocianin) au fost supuse SDS-electroforezei n gel de poliacrilamid (g. 3).

140

Figura 3. Electroforegrama preparatului antioxidant SP SOD/Phyco 1 /SP SOD/Phyco - 2 dup etapa puricrii prin cromatograe de schimb ionic pe coloana de Q-Sepharose. 3 fracia 3; 5 fracia 5; marcheri proteici

Electroforegrama fraciilor proteice puricate conrm datele obinute anterior, referitor la masele moleculare aparente ale subunitilor SOD (28 kDa) i ale cocianinei (18 i 19,95 kDa). Concluzii: Procedeele de obinere a preparatelor SP - SOD/Phyco - 1 i SP - SOD/Phyco 2 redau schema integrat de obinere a preparatelor antioxidante noi n baza biomasei de spirulin surs de cocianin i SOD. Compoziia preparatelor SP - SOD/Phyco - 1 i SP - SOD/Phyco - 2 se conrm prin metoda electroforetic n gel de poliacrilamid n prezena SDS. Banda proteic cu masa molecular de 28 D denot prezena superoxiddismutazei, iar cele cu masele moleculare de 18 i 19,95 D aparin cocianinei. Referine
1. Abd El-Baky H. , Farouk K. , Gamal S. Production of carotenoids from marine microalgae and its evaluation as safe food colorant and lowering cholesterol agent. // Journal of Agriculture and Environmental Science, 2007, vol. 6, no. 1, p. 792-800. 2. Aboul-Enein A. , Farouk K. , Gamal S. et. al. Antioxidant activity of algal extracts on lipid peroxidation. // Journal of Medical Sciences, 2003, vol. 3, no. 1, p. 87-98. 3. Ames B. , Shigenaga M. , Hagen T. Oxidants, antioxidants and degenerative diseases of aging. // Proc. Nat. Sci. 1993, vol. 90, no. 17, p. 7915-7922. 4. Balakrishnan P. , Jagadeesan P. et. al. Comparative analysis of cyanobacterial superoxide dismutases to discriminate canonical forms. // BMC Genomics, 2007, no 8, p 435. 5. Benedetti S. , Benvenuti F. Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the bluegreen alga Aphanizomenon os-aquae. // Life Sciences, 2004, no. 19, p. 2353-2362. 6. Bhat V. , Madyastha K. M. C. Phycocyanin: a potent peroxyl radical scavenger in vivo and in vitro. // Biochemical Research Communications, 2000, no. 1, p. 20-25. 7. Bhat V. , Madyastha K. Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis. // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, no. 2, p. 262 -266. 8. Blinkova L. Gorobets O. , Baturo A. Biological activity of Spirulina. // J. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol, 2001, no. 2, p. 114-118.

141

9. Boussiba S. , Richmond A. C-phycocyanin of the blue-green algae Spirulina platensis. // Arch. Microbiol. 1998, vol. 125, no. 2, p. 143-147. 10. Brevet de invenie. 3752 G2, MD, C12N9/02. Metod de determinare a activitii superoxiddismutazei. / Valentina Bulimaga, Nadejda Efremova, Lidia Dencicov (MD). Cererea depus 28. 03. 2008, BOPI nr 11/2008. 11. Brevet de invenie. 3781 MD, C12N1/12. Procedeu de obinere a preparatului antioxidant termostabil din biomasa cianobacteriei Spirulina platensis. / Valeriu Rudic, Valentina Bulimaga, Nadejda Efremova (MD). Cererea depus 18. 03. 2008, BOPI nr. 12/2008. 12. Campanella L. , Crescentini P. , Angiello L. Simple procedure for analyzing for phycocyanin Spirulina platensis algae using LPLC and HPLC. // Annali di Chemica, 2000, vol. 90, p. 153-161. 13. Dal Farra C. , Antipois S. , Imbert I. Protection of the skin from glycation stress with a new antioxidant dimmer peptide. // J. of the Acad. of Dermat. , 2008, no. 2, p. 20. 14. Desai K. , Sivakami S. Purication and biochemical characterization of a superoxide dismutase from the soluble fraction of the cyanobacterium Spirulina platensis. // World Journal Microbiology Biotehnology, 2007, vol. 23, no. 11, p. 1661-1666. 15. Esco R. , Valencia J. , Coronel P. et. al. Efcacy of orgotein in prevention of late side effects of pelvic irradiation. // International journal of radiation, oncology, 2004, vol. 60, no. 4, p. 1211-1219. 16. Escribano A. , Garcia-Grande A. , Montanes P. et. al. Aerosol orgotein for the prevention of radiotherapy - induced adverse effects in head and neck cancer patients. // Neoplasma journal, 2002, no. 3, p. 201-208. 17. Estrada P. , Bermejo Bescs P. and Villar Del Fresno A. Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean extracts. // Farmaco, 2001, vol. 56, no. 5, p. 497-500. 18. Flora S. Role of free radicals and antioxidants in health and disease. // Cell Molecular Biology, 2007, vol. 53, no. 1, p. 1-2. 19. Hammouda O. Purication and Identication of the type of superoxide dismutase from Gloeocapsa sp. // Folia Microbiology, 1999, vol. 44, no. 1, p. 32-36. 20. Junqueira V. , Barros S. , Sandra S. Aging and oxidative stress. //Molecular aspects of medicine, 2004, vol. 25, no. 1-2, p. 5-6. 21. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970, vol. 227, no. 5259, p. 680-685. 22. Lawrence M. Oxyradicals and DNA damage. // Carcinogenesis, 2000, vol. 21, no. 3, p. 361370. 23. Lowry O. , Rosebrough N. , Farr A. et. al. Protein measurement with the folin phenol reagent. // J. Biology and Chemistry, 1951, vol. 193, no. 1, p. 265-275. 24. Mc Cord J. The evolution of free radicals and oxidative stress. // Am. J. Med. 2000, vol. 108, no. 8, p. 652-659. 25. Meydani S. Antioxidants and immune response in aged persons: overview of present evidence. // American journal of clinical nutrition, 1995, no. 6, p. 1462-1476. 26. Minkova K. , Techernov A. , Tchorbadjieva M. et. al. Purication of C - phycocyanin from Spirulina (Arthrospira) Fusiformis. // Journal of biotechnology, 2003, vol. 102, no. 1, p. 55-59. 27. Parthasarathy S. Oxidative stress in cardiovascular disease. // Journal of Nuclear Cardiology, 2001, vol. 8, no. 3, p. 379-389. 28. Patra J. , Patra A. , Mahapatra M. et. al. Evaluation of antioxidant and antimicrobial activity of seaweed extract. // Turk. J. Biol. , 2007, vol. 32, no. 2, p. 119-125. 29. Regelsberger G. , Laaha U. , Dietmann D. et. al. The iron superoxide dismutase from the

142

lamentous cyanobacterium Nostoc PCC 7120. // J. of Biol. Chem. , 2004, no. 43, p. 44384-44393. 30. Reva V. , Ciobanu V. , Mueller-Uri F. Strategia i tactica izolrii i puricrii proteinelor. Chiinu, 2001, 186 p. 31. Romay C. , Gonzalez R. , Ledon N. et. al. C-phycocianin: a biliprotein with antioxidant, antiinammatory and neuroprotective effects. // Protein and peptide science, 2003, vol. 4, no. 3, p. 207-216. 32. Soundarapandian S. Phycobiliproteins as a commodity: trends in applied research, patents and commercialization. // J. Appl. Phycol. 2008, no 3, p. 113-136. 33. Valko M. , Rhodes C. , Moncol J. et. al. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stressinduced cancer. // Chem Biol Interact, 2006, vol. 160, no. 1, p. 1-40. 34. Wolf F. L. The role and evolution SOD in algae. New Jersey, 2006, 132 p. 35. . . // . , 2000, no. 5, . 10-14. 36. . . : . // , 2001, no. 4, . 28-48.

ACUMULAREA ASTAXANTINEI N BIOMASA HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS LA CULTIVARE PE MEDIU CU COMPUI COORDINATIVI AI Fe(III) CU AMINOACIZII
Miscu Vera Institutul de Microbiologie i Biotehnologie al AM Microalgele i-au ocupat ferm locul n biotehnologia microbian n calitate de surse de biomas i produse specice. Cele mai recente tehnologii n baza microalgelor sunt cele de producere a astaxantinei pigment carotenoid important cu aplicare nutraceutic, cosmetic i n industria alimentar [11-13, 30, 32]. Microalga verde Haematococcus pluvialis este considerat superproductor de astaxantin i se cultiv cu success pe scar industrial n mai multe ri ale lumii [2, 9, 15, 29, 31]. n celul acest pigment ndeplinete funcia fotoprotectoare, servind n calitate de barier zico-chimic, ce previne deteriorarea lipidelor din componena membranelor funcionale i a ADN-ului de ctre radicalii liberi [14, 35, 38]. Funciile biologice eseniale ale astaxantinei exercitate n organismul uman i animal includ protecia componentelor celulare de procesul de oxidare, formarea rspunsului imun i reglarea expresiei genelor [29]. Efectul benec generalizat al astaxantinei este mediat de capacitatea de ptrundere n plasma sangvin i de mobilitatea moleculelor ei [7, 32]. Carotenogeneza la Haematococcus pluvialis, ca i la toate organismele fotosintezatoare, decurge n mod normal la meninerea condiiilor favorabile de dezvoltare. Intensicarea procesului de acumulare a astaxantinei poate obinut prin modicarea condiiilor de cultivare aa ca iluminarea intens, decitul de nutrieni, stresul oxidativ i stresul salin, temperaturile nalte [2, 16, 24, 33]. Acumularea masiv de astaxantin a fost obinut n cazul cultivrii pe mediu cu insucien de azot i iluminare intensiv - condiii care faciliteaz asimilarea carbonului de catre microalg [10, 21, 25]. Azotul este foarte important n dezvoltarea

143