Diagnosticul molecular

Diagnosticul molecular
Tehnici diagnostice ce urmaresc identificarea unor modificari la nivelul moleculelor de ADN sau ARN: - mutatii - polimorfisme - fragmente exogene - amprenta ADN medicina legala Obiective: Diagnostic pre- si postnatal Diagnostic presimptomatic Identificare heterozigoti Identificare purtatori de premutatii (mutatii dinamice)
-

Metode directe mutatii cunoscute Metode indirecte identificarea unor markeri genetici inlantuiti cu alele morbide

Tehnici de baza

Izolarea ADN genomic Utilizarea enzimelor de restrictie Electroforeza (agaroza, PAGE, camp electric pulsatil) Amplificarea in vitro prin PCR Secventarea ADN Hibridizarea fragmentelor de ADN cu probe specifice marcate

Izolarea ADN genomic principiu/etape

Liza celulara Liza nucleara Digestia moleculelor de ARN (optional) Precipitarea proteinelor (inhibitori ai reactiei PCR) Precipitarea (izolarea) ADN in solutie alcoolica Spalarea (purificarea) cu alcool 70% Rehidratare

Stocare la congelator >>>>>

Reactia PCR

Amplificarea fragmentului dorit in miliarde de copii (modelul replicarii ADN in vivo) pentru a putea fi ulterior analizat Necesar reactie PCR ADN ul tinta (genomic sau fragment de ADN obtinut din amplificare anterioara nested PCR) Taq-polimeraza Mix dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Primeri (amorse) specifice, complementare pe cele doua catene (Fw si Rev) MgCl2 Buffer pentru Taq polimeraza Termocycler

Etape PCR

Denaturarea initiala a ADN 94-95 grade 5-10 min.

Cicluri (30-40) de reactie de amplificare: Denaturare 94-95 grade Legarea amorselor (annealing) 50-65 grade Elongarea (sinteza) <Taq-polimeraza> - 72 grade

Elongare finala 72 grade 5-10 min. Stocare ampliconi la 4 grade sau congelator pana la prelucrare ulterioara sau direct electroforeza http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangerseq.html (Ctrl Right, apoi Open Hyperlink)

Copies at cycle n = Initial copy # x 2n PCR permite obtinerea unei cantitati analizabile, specifica a regiunii determinate de catre amorse Southern si VNTR : 1 g, PCR si STR : 1 ng

Tehnica PCR-RFLP

Digestia cu enzime de restrictie a fragmentului amplificat urmata de electroforeza in gel