Espectrometria

de Luminescncia Molecular

Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Qumica Fundamental
Qumica Analtica 12A (Instrumental)
Espectrometria
de Luminescncia Molecular
Fluorescncia Molecular

Fosforescncia

Quimioluminescncia
Fotoluminescncia
Espectrometria de Luminescncia Molecular
a emisso de radiao eletromagntica (na regio UV-Visvel)
proveniente de molculas excitadas voltando ao estado fundamental
Quando a absoro de ftons responsvel pela excitao da
molcula pela elevao de eltrons de valncia de um orbital
menos energtico para um de maior energia
Fotoluminescncia (flourescncia e fosforescncia)
Quimioluminescncia
Est baseada no espectro de emisso de uma espcie excitada
que formada no decorrer de uma reao qumica
Ocorre em sistemas qumicos gasosos, lquidos e
slidos simples bem como em sistemas complexos
Teoria da Fluorescncia e Fosforescncia
Fluorescncia
O estado excitado envolvido singlete, onde o spin do
eltrons no orbital excitado mantm sua orientao.
O retorno ao estado fundamental rpido (10
-5
a 10
-8
s)

Fosforescncia
A orientao do eltrons que foram promovidos ao estado
excitado invertida (estado excitado triplete).
O retorno ao estado fundamental mais lento (10
-4
a 10 s
ou mais) que no caso do singlete.
Teoria da Fluorescncia e Fosforescncia
A fluorescncia um fenmeno luminescente
mais comum que a fosforescncia
observada em temperatura
ambiente e diretamente em
soluo o que torna o
procedimento
experimental fluorimtrico,
bastante simples
Fluorescncia
observada apenas em
baixas temperaturas em
meios altamente viscosos,
ou em molculas que esto
absorvidas em superfcies
slidas
Fosforescncia
Estados Excitados que Produzem
Fluorescncia e Fosforescncia
Spin Eletrnico
Princpio de Excluso de Pauli
Quaisquer dois eltrons em um tomo no podem ter os mesmos
valores dos quatro nmeros qunticos.
No mais de dois eltrons podem ocupar um orbital e devem ter
spins opostos (spins emparelhados).
A maioria das molculas no apresenta campo magntico intrnseco
sendo denominada de diamagntica (no atrada nem repelida por
campos magnticos estticos).
Os radicais livres, que contm eltrons desemparelhados, tm
momento magntico e so atrados por um campo eltrico.
Eles so paramagnticos.
Estados Excitados Singlete e Triplete
Singlete
Estado eletrnico molecular no qual todos os spins eletrnicos esto
emparelhados e nenhuma separao de nveis de energia ocorre quando a
molcula exposta a um campo magntico.
Triplete
Estado eletrnico molecular no qual os spins eletrnicos esto
desemparelhados e so paralelos
Dublete
Estado fundamental para um radical livre onde, o eltron isolado pode ter
duas orientaes em um campo magntico, o que d energias diferentes.
Estados Excitados Singlete e Triplete
As propriedades de uma molcula no estado excitado triplete
diferem muito daquelas do estado singlete
Molcula paramagntica no estado triplete e diamagntica
no estado singlete
Transies singlete/triplete ou triplete/singlete (que tambm
envolvem mudanas de estado eletrnico) so menos provveis
que uma transio singlete/singlete correspondente
Estado Excitado Tempo de vida mdio, s
Triplete 10
-4
a vrios segundos
Singlete 10
-5
a 10
-8
Excitao produzida por radiao de uma molcula no estado
fundamental ao estado triplete tem pouca probabilidade de
ocorrer e os picos decorrentes desse processo so muito menores
que as transies singlete/singlete
Diagrama de Nveis de Energia
de Molculas Fotoluminescentes

Nveis excitados
de energia
S = singlete
T = triplete
Estado
fundamental
singlete
Estado
excitado
singlete
Estado
fundamental
triplete
Excitao no
significativa
Devido a mudana
de multiplicidade
Emisso Fluorescncia
Fosforescncia
10
-5
a 10
-9
s
10
-4
a 10 s
ou mais
<10
-9
s
Tempo de vida mdio de uma espcie excitada
Tempo de vida mdio de uma espcie excitada
Velocidades de Absoro e Emisso
t (10
-14
a 10
-15
s)
t
estado excitado
o 1/c
(pico de absoro)

(vida)
t (10
-7
a 10
-9
s)
M + hv M*
vel. altssima
M* M
reemisso
vel. menor
absoro
fluorescncia fosforescncia
No h mudana
de spin
(t. curto)
H mudana
de spin
(t. longo)
10
-4
a 10 s 10
-5
a 10
-8
s
Processos de Desativao
M* M
reemisso
vel. menor Molcula
excitada
Molcula
no estado
fundamental
Etapas Mecansticas da volta ao Estado Fundamental
Fluorescncia
Fosforescncia
Emisso de um
fton de radiao
Processos radiativos
Processos no-radiativos
No h emisso de
fton de radiao
Relaxao Vibracional
Processos de Desativao
A trajetria favorecida aquela que minimiza o
tempo de vida do estado excitado
Se a fluorescncia mais
rpida que os processos
sem radiao
Se a trajetria no-radiativa
tem constante de velocidade
mais favorvel
Emisso por fluorescncia
No h fluorescncia
ou pouco intensa
Etapas Mecansticas da volta ao Estado Fundamental
Processos de Desativao
Relaxao Vibracional
A banda de fluorescncia para uma dada transio eletrnica est
deslocada para freqncias mais baixas ou comprimentos de onda
maiores em relao a banda de absoro
Como a relaxao vibracional muito rpida,
no h emisso
consequncia
A transio ocorre a partir de um nvel vibracional
mais baixo de um estado eletrnico excitado

Nveis excitados
de energia
S = singlete
T = triplete
Cruzamento interno
(10
-13
a 10
-11
s)
Processos de Desativao
No h emisso
t. de vida do
estado excitado
(10
-7
a 10
-9
s)
t. de vida do
estado excitado
(10
-4
a 10 s)
Relaxao Vibracional

r
produz
r
Processos de Desativao
Converso Interna
Descreve processos intermoleculares pelos quais uma
molcula passa para um estado eletrnico de energia
menor sem emisso de radiao
A converso interna parece ser eficiente quando dois nveis
eletrnicos de energia esto prximos o suficiente para que
haja uma superposio de nveis de energia vibracionais
Quando as energias potenciais dos dois estados
excitados so idnticas, a transio muito eficiente
Processos de Desativao
Converso Interna
A converso interna explica o fato de no haver banda de
fluorescncia proveniente de uma transio de S
2
S
0
A transio acontece de S
1
S
0
A fluorescncia ocorre somente em
3
, no
importando qual radiao de comprimento de
onda
1
ou
2
foi responsvel pela excitao


Nveis excitados
de energia
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativao
Converso Interna S
1
S
0

Processos de Desativao
Exemplo de Converso Interna
Quinino
Processos de Desativao
Converso Interna S
1
S
0

Os nveis vibracionais do estado fundamental podem
se sobrepor aos do primeiro estado eletrnico excitado

A desativao ocorrer rapidamente pelo
mecanismo S
1
S
0
Compostos alifticos tm esse comportamento e por isso,
no fluorescem. A desativao vibracional muito mais
rpida que a desativao por fluorescncia
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativao
Converso Interna S
1
S
0


Nveis excitados
de energia
Processos de Desativao
Converso Externa ou supresso (extino) por coliso
a desativao de um estado eletrnico excitado que
envolve interao ou transferncia de energia entre a
molcula excitada e o solvente ou soluto

M* solvente ou soluto
hu
A reduo do nmero de colises (baixa temperatura e
alta viscosidade) aumentam a fluorescncia.

S = singlete
T = triplete
Processos de Desativao
Converso Externa S
1
S
0


Nveis excitados
de energia
Processos de Desativao
um processo no qual o spin de um eltron excitado invertido
resultando em uma mudana de multiplicidade da molcula

A probabilidade dessa transio aumentada se os nveis
vibracionais dos dois estados se interpenetram.
Cruzamento Intersistema S
1
T
1
O cruzamento intersistema mais comum em molculas que
contm tomos pesados, como iodo ou bromo
A presena de espcies paramagnticas como o oxignio,
facilita o cruzamento intersistema decrcimo da fluorescncia
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativao

Nveis excitados
de energia
Cruzamento Intersistema S
1
T
1
Processos de Desativao
Depois do cruzameto intersistema para um estado triplete, uma
desativao interna pode ocorrer, seja por converso interna ou
seja por fosforescncia

Uma transio triplete singlete muito menos provvel que
pela converso singlete/singlete . O tempo de vida mdio do
estado triplete em relao emisso varia de 10
-4
a 10 s ou mais
Fosforescncia

As converses interna e externa competem de tal modo bem-
sucedido com a fosforescncia que esse tipo de emisso
normalmente observado apenas em baixas temperaturas em meios
altamente viscosos, ou em molculas que esto absorvidas em
superfcies slidas
S = singlete
T = triplete
Processos de Desativao

Nveis excitados
de energia
Fosforescncia

Variveis que afetam a
Fluorescncia e a Fosforescncia
Rendimento Quntico
Tipos de transies na Fluorescncia
Eficincia Quntica e Tipos de transies na Fluorescncia
Fluorescncia e a Estrutura
Efeito da Rigidez Estrutural
Efeito do Solvente e da Temperatura
Efeito do pH na Fluorescncia
Efeito do Oxignio Dissolvido
Efeito da Concentrao na Intensidade da Fluorescncia
Rendimento Quntico ou
Eficincia Quntica (|)
a razo no nmero de molculas que fluorescem
pelo nmero total de molculas excitadas

Para a fluorescena, a eficincia
quntica se aproxima da unidade

f = fluorescncia
i = cruzamento intersistema
ce = converso externa
ci = converso interna
pd = pr-dissociao
d = dissociao
Tipos de Transies de Fluorescncia
Radiao muito energtica pode causar desativao dos
estados excitados.

Algumas ligaes da maior parte das molculas orgnicas
podem ser rompidas.
Fluorescncia devido a transies o* o dificilmente
observada
A fluorescncia dificilmente resulta da absoro ultravioleta
de comprimento de onda menores que 250 nm.
Ligante
Ligante
No-ligante
Antiligante
Antiligante
Tipos de Transies de Fluorescncia
Ligante
Ligante
No-ligante
Antiligante
Antiligante
Emisso fica restrita aos processos menos energticos
transies t* t e t* n

Eficincia Quntica e Tipo de Transio
Empiricamente:
|
t* t
> |
t* n

Fluorescncia
transio de menor energia
t t*
transio de menor energia
n t*
c
t* t
= (100 a 1000) x c
t* n

t
vida(
t* t)
= 10
-7
a 10
-9
s t
vida(
t* n)
= 10
-5
a 10
-7
s
Eficincia Quntica e Tipo de Transio
Concluso
A fluorescncia est mais comumente associada a
transies t t* porque apresentam tempo de vida
mdio menores (k
f
maior) e porque os processos de
desativao que competem com a fluorescncia so
de ocorrncia menos provvel
Fluorescncia e Estrutura
A fluorescncia mais intensa em compostos contendo grupos
funcionais aromticos com nveis de transio t t* de baixa energia
Estruturas com
anis condensados
apresentam
fluorescncia
Heterocclicos
simples no
apresentam
fluorescncia
transio n t*
O tempo de vida do
anel benzeno menor
Fluorescncia e Estrutura
Efeito do tomo
pesado
Efeito da Rigidez Estrutural
A fluorescncia favorecida em molculas que
possuem estrutura rgida
|= 1,0 |= 0,2
grupo
metileno
Efeito da Rigidez Estrutural
Certos agentes quelantes orgnicos tem sua fluorescncia
aumentada quando complexam com um on metlico
N
O
Zn
2
N
OH
8-hidroxiquinolina
Intensidade da fluorescncia
complexo de Zn
com 8-hidroxiquinolina
<
Efeito do Solvente e da Temperatura
O aumento da temperatura aumenta a freqncia
de colises aumentando a probabilidade de desativao
por converso externa
A fluorescncia de uma molcula diminuda por
solventes contendo tomos pesados ou outros solutos
com tais tomos em sua estrutura
Ex.de solventes:Tetraboreto de carbono e iodeto de etila

Efeito do pH na Fluorescncia
A anilina tem vrias formas ressonantes.
As formas ressonantes adicionais tornam o primeiro estado
excitado mais estvel.
O on anilnio apresenta somente uma forma ressonante
Exemplo do efeito do pH na Fluorescncia
Titulao cido/base da forma fenlica
do cido 1-naftol-4-sulfnico
A fluorescncia da forma fenlica do cido 1-naftol-4-sulfnico
no detectada visualmente porque ocorre no ultravioleta.
Uma vez convertido a forma de fenolato por adio de base, o
pico de emisso se desloca para comprimentos de onda no
visvel onde pode ser visto.
A constante de dissociao cida da forma excitada diferente
daquela da mesma espcie no estado fundamental
Efeito do Oxignio Dissolvido
A presena de oxignio dissolvido frequentemente reduz a
intensidade de fluorescncia de uma soluo
Razes plausveis:
Resultado da oxidao da espcie fluorescente, induzida
fotoquimicamente
A supresso acontece como consequncia das propriedades
paramagnticas do oxignio molecular
Promove cruzamento intersistema convertendo as molculas
excitadas em estado triplete
OBS. Outras espcies paramagnticas tambm tendem a
suprimir a fluorescncia
Efeito da Concentrao na Intensidade
da Fluorescncia
( ) P P K F =
0
' bc
P
P
c
=10
0
( ) ( )
|
|
.
|

\
|
+ = ...
! 3
303 , 2
! 2
303 , 2
303 , 2
2 2
0
'
bc bc
bc P K F
c c
c
( )
bc
P K F
c
= 10 1
0
'
05 , 0 303 , 2 < = A bc c
0
'
3 , 2 bcP K F c =
Kc F =
cte P =
0
Expanso do termo exponencial em srie de Maclaurin:
Efeito da Concentrao na Intensidade
da Fluorescncia
( ) ( )
|
|
.
|

\
|
+ = ...
! 3
303 , 2
! 2
303 , 2
303 , 2
2 2
0
'
bc bc
bc P K F
c c
c
grande c
importantes
05 , 0 303 , 2 > = A bc c
A linearidade perdida:
F situa-se abaixo de uma extrapolao da parte linear
Efeito da Concentrao na Intensidade
da Fluorescncia
grande c
Auto-supresso
Auto-absoro
Resultado de colises de molculas excitadas. Ocorre uma
transferncia no-radiativa talvez de modo semelhante
a transferncia para molculas do solvente na converso externa
Ocorre quando o comprimento de onda de emisso se sobrepe
a um pico de absoro. A fluorescncia diminui na proporo que
a emisso atravessa a soluo e reabsorvida por molculas
fluorescentes.
Espectros de Excitao e Emisso
Intensidade de luminescncia
medido em fixo
de excitao varivel
A intensidade de emisso
registrada em funo de
Na fluorescncia e fosforescncia
de excitao fixo

excitao
<
fluorescncia
<
fosforescncia
Espectrometria
de Luminescncia Molecular

Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Qumica Fundamental
Qumica Analtica 12A (Instrumental)
Instrumentos para medida de
Fluorescncia e a Fosforescncia
Componentes de um Fluormetro ou
Espectrofluormetro
1
2
1 (excitao)
2 (emisso)
Componentes de um Fluormetro
ou Espectrofluormetro
Fontes
Lmpadas
Vapor de mercrio de baixa presso:
Linhas teis para excitar fluorescncia
(254, 302, 313, 546, 578, 691, e 773 nm)

Lasers
Laser de corante sintonizado bombeado
com laser de nitrognio pulsado ou laser
Nd:YAG
O isolamento da linha adequada feito
com filtros de absoro ou interferncia
Componentes de um Fluormetro
ou Espectrofluormetro
Fontes
Desvantagem:
As fontes com Lasers so mais caras que as com
lmpadas
Vantagem:

Melhor para amostras muito pequenas
Excelente para sensoreamento remoto(deteco de radicais
hidroxila na atmosfera)
Ideal quando necessrio uma excitao essencialmente
monocromtica (minimiza os efeitos de fluorescncias
interferentes)

Componentes de um Fluormetro
ou Espectrofluormetro
Filtros e Monocromadores
Filtros de absoro
e
Filtros de Interferncia
Seleo do feixe
de excitao
Seleo da radiao
Fluorescente resultante
Transdutores
Fotomultiplicadoras
Detectores com arranjo de diodos
(Diode array)
Componentes de um Fluormetro
ou Espectrofluormetro
Clulas e Compartimentos de Clulas
Clulas cilndricas e retangulares fabricadas com vidro
ou slica
Deve-se proteger o compartimento contra a radiao
espalhada
Evitar impresses digitais na clula porque as gorduras
da pele fluorescem
Instrumentos para medida de
Fluorescncia e a Fosforescncia
Projetos de Instrumentos
Fluormetros de Filtro
Simples
Baixo custo (US$ 5.000)
Projetos de Instrumentos
Espectrofluormetros
Caractersticas dos Espectros
de Espectrofluormetros
Os espectros de emisso variam de
aparelho para aparelho e no
podem ser comparados entre si
A informao de sada depende:
Intensidade da fluorescncia do analito

Caractersticas da lmpada

Transdutor

Monocromadores
Projetos de Instrumentos
Espectrofluormetros baseados
em Arranjos de Transdutores (diodos)
Projetos de Instrumentos
Sensores de Fluorescncia de Fibra ptica
(Optrodos ou optodos)
Consistem de uma fase reagente imobilizada na extremidade de
uma fibra ptica.
A interao do analito com o reagente provoca uma mudana na
absorbncia, reflectncia, fluorescncia ou luminescncia.
Projetos de Instrumentos
Fosformetros
Dispositivo para Excitar e Observar a Fosforescncia
A medida da fosforencncia
realizada com um atrazo de
tempo para poder distinguir
a fluoresccia (t
vida
curto) da
fosforescncia (t
vida
longo)
Frasco Dewar
com N
2
liq.
Padronizao de Instrumentos
necessrio realizar uma calibrao dos fluormetros
e espectrofluormetros
A calibrao feita com soluo de sulfato de
quinino ~10
-5
M
A excitao feita por radiao em 350 nm e a
emisso da radiao se d em 450 nm
Existe um conjunto de 6 padres slidos dissolvidos
em matriz de plstico que podem ser usados
indefinidadmente (fabricante - Perkin Elmer)
A bc
P
P
0
= = log
Kc F =
P
0
= cte
Aplicaes e Mtodos de Fotoluminescncia
Espectrofotometria Fluorimetria
Sensibilidade Faixa mais alta
de concentrao
Faixa mais baixa
de concentrao
(1 a 3 vezes mais
sensvel)
Dependncia
da potncia da
fonte (P
0
)
existe No existe



Preciso e
Exatido
Melhor

Pior
(2 a 5 vezes pior)
Ctions que formam Quelatos Fluorescentes
ons de metais de transio no formam
quelatos fluorescentes
A maioria dos ons so paramagnticos
cruzamento intersistema (triplete)
Complexos de metais de transio caracterzam-se
por muitos nveis de energia pouco espaados
converso interna (triplete)
ons de outros metais que no so de transio
formam quelatos fluorescentes
So menos susceptveis aos efeitos acima
Reagentes Fluorimtricos
Reagentes Fluorimtricos
e Aplicaes
Medidas de Tempo de Vida
de Fluorescncia
Sada da fonte em
funo do tempo
Decaimento do sinal de
fluorescncia (decaimento da fonte
e decaimento do sinal
de emisso do analito)
Sinal de fluorescncia
verdadeiro obtido
por deconvoluo
da contribuio da
fonte para o sinal
experimental
Determinao Fluorimtrica de
Espcies Orgnicas
Compostos orgnicos,
Enzimas,
Coenzimas,
Agentes medicinais,
Produtos de plantas,
Esterides
Vitaminas
Mais de 200 substncias podem ser
analisadas por fluorimetria
Produtos para alimentos,
Frmacos
Amostras Clnicas
Produtos Naturais
Aplicaes mais
importantes