Craiova Medical

Vol 9, Nr 4, 2007

Studiu de farmacie
Testarea in vitro a unor structuri de tip implant
J. NEAMU, P.G. ANOAICA, O. CROITORU, I. VIAU-BOLOCAN, L. BEJENARU, MARIANA TTUCU
Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie din Craiova

The testing in vitro of implant - type structures

REZUMAT Ceramicile ce au la baz fosfaii de calciu
sunt foarte des utilizate n aplicaiile medicale, n special pentru implanturile ortopedice, dar i n chirurgia maxilo-facial, n implanturile dentare. Acoperirea implanturilor de titan cu hidroxiapatita de calciu (HA) asigur posibilitatea integrrii proprietilor mecanice ale Ti cu cele ale osteoconductivitii HA. Testarea biomaterialelor n ceea ce priveste potenialul lor bioactiv se realizeaza in vitro, prin imersare n soluii anorganice ce simuleaz fluidele biologice (SBF). De aceea aceast lucrare prezint msurtori FTIR, ale unor structuri de tip implant introduse n soluii SBF pe durata a trei saptmni. n acelai timp s-a efectuat i spectroscopie ICP asupra soluiilor gazd.

ABSTRACT Ceramics which have as base the

calcium phosphates are usually used in the medical applications, specially for orthopedic implants, maxilofacial surgery or dental implants. The cover of titan implants with calcium hidroxyapatite (HA) assures the possibility of integration for mechanic property of Ti with the ones of HA osteoconductivity. The testing of biomaterials, regarding their bioactive potentially, is achieved in vitro through immersion in inorganic solution which simulate the biologic fluid (SBF). Considering these, the paper presents FTIR measurements of implant type structure immersed in the SBF solutions during three weeks period. In the same time was made the ICP spectroscopy fort host solutions

CUVINTE CHEIE ceramic, implant, biomateriale,

bioactivitate

KEY WORDS ceramics, implants, biomaterials,

bioactivity

Introducere
Evoluia tehnologic a metodelor de depunere de materiale anorganice a avut un mare impact n domeniul implanturilor medicale cu aplicaii ortopedice i dentare. Cerinele impuse dispozitivelor implantate sunt: netoxicitatea, biocompatibilitatea, bioactivitatea i rezistena la uzura mecanic. Acoperirile implanturilor din Ti cu ceramici ce au la baz fosfatul de calciu asigura posibilitatea integrrii proprietilor mecanice ale titanului cu proprietile osteoconductive ale fosfailor de calciu i mbuntirea legturii ntre esut i metalul implantat [1-4]. Succesul unui implant (dentar sau ortopedic) depinde de fixarea sa puternic n esutul nconjurtor ce-i permite s suporte solicitrile mecanice permanente la care este supus. Numeroi factori, printre care enumeram tehnicile chirurgicale, designul implantului i topografia suprafeei sale, sunt cunoscui ca factori ce au o influen major asupra integrarii implantului. Posibilitatea cresterii coeziunii ntre esutul osos i implant cu ajutorul acoperirii implantului cu un strat de hidroxiapatit (HA) a fost demonstrat pe larg n ultimii ani. De asemenea, tehnicile de depunere clasice pentru acest tip de depunere induc deseori tensiuni reziduale la interfaa metal/hidroxiapatit, precum i nonuniformiti structurale i o aderen slab, factori ce stau la originea delaminrii filmului ceramic. Aceast decoeziune se afl deseori la originea defuncionalizrii implantului, acesta necesitnd a fi extras dupa o anumit perioad din organism. De aceea, n ultimii ani, s-au intensificat cercetrile privind gsirea unor noi metode de depunere a fosfailor de calciu pe structuri metalice . Acoperirea implanturilor metalice cu HA se realizeaz prin diverse metode cum ar fi pulverizare n plasm [5], depunere chimic i electrolitic [6], depunere laser pulsat (PLD) [7] sau pulverizare n radiofrecven (RF-MS) [8]. Hidroxiapatita de calciu (HA) Ca10(PO4)6(OH)2 este un material care se dezvolta n mod natural n esutul osos ; de exemplu, osul uman cortical matur conine aproximativ 70% HA cristalin n volum. Rezultatele experimentale [9-10] arat c atunci cnd un astfel de implant (titaniu acoperit cu HA) este introdus intr-un mediu biologic, la suprafaa sa se formeaz un strat de hidroxiapatit carbonatat (HCA) sau apatit bilogic cu o compoziie chimic mai apropiat de cea a osului. De fapt, de acest strat se leag att implantul ct i materialul osos iar punerea lui n eviden este o condiie necesar pentru ca materialul din care este realizat implantul s fie considerat bioactiv. Testarea biomaterialelor n ceea ce privete potenialul lor bioactiv a fost realizat pentru prima oar de Kokubo i colaboratorii [11], prin

Prof Univ Dr Johnu Neamu, Disciplina Fizic farmaceutica, Facultatea de Farmacie, UMF Craiova

361

J Neamu i colab: Testarea in vitro a unor structuri de tip implant

imersie n soluii anorganice ce simuleaz fluidele biologice (SBF). Aceste soluii au compoziii i concentraii ionice similare cu plasma uman sanguin i sunt folosite pentru a testa potenialul bioactiv al materialelor utilizate la realizarea protezelor ortopedice i stomatologice. Astfel, inducerea in vitro a unui strat HCA la suprafaa implanturilor, dup introducerea lor n SBF este o condiie necesar pentru ca acestea s se menin bioactive i la implantarea in vivo [12]. Scopul studiului experimental raportat n aceasta lucrare este analiza modificrilor fizicochimice ce au loc la suprafaa unor structuri de tip implant, atunci cnd sunt introduse n soluii SBF. Depunerile de HA au fost realizate ntr-o instalaie de cercetare pentru depunere de filme subiri. prin pulverizare n radiofrecven. Detalii privind aceasta tehnica de depunere au fost prezentate anterior acestui studiu [8]. Astfel HA este presat sub forma unui disc, numit int, iar asupra ei se trimite un fascicul de radiofrecvent (1.78MHz) ce determin nclzirea, topirea, vaporizarea i depunerea HA pe un substrat aflat la 30 mm de int. Procesul se desfoar ntr-o camer de iradiere n care se gsete argon la presiunea de 23 mTorr. Rata depunerii prin acest procedeu este de 1 m/h iar dup iradiere depunerile sunt supuse unor tratamente termice la temperatura de 550 C timp de o or, ntr-o atmosfer mbogit cu vapori de ap. Analizele de difracie XRD efectuate dup aceste tratamente arat c prin acest procedeu se obin straturi de HA cristaline . Folosind aceast metod au fost raportate depuneri de HA pe substrat de Ti-5Al-2.5Fe, staturile depuse fiind aderente i uniforme . Pentru a evita fenomenele de oxidare i de difuzie a atomilor de titan ctre interfaa HA - soluie SBF am utilizat substrai monocristalini de siliciu de tip (100). Modificrile fizico - chimice ce au loc la suprafaa structurilor au fost analizate prin spectroscopie cu transformat Fourier n infrarou (FTIR). Procesele ce au loc n soluiile fiziologice au fost urmrite prin spectroscopie ICP.

n ap distilat a urmtorilor reactivi: NaCl, NaHCO3, KCl, K2PO4 3H2O, CaCl2, Na2SO4. Ele au fost stabilizate la un pH = 7,4 cu HCl (1M) i trihidroximetil aminometan (CH2OH)3CNH2 [13].
Tabelul 1 Concentraiile ionice (mM) ale plasmei sanguine i ale soluiei SBF

Ion SBF Plasm Na+ 142.0 142.0 K+ 5.0 5.0 2+ Mg 1.5 1.5 Ca2+ 2.5 2.5 Cl 147.8 103.0 HCO3 4.2 27.0 2 HPO4 1.0 1.0 SO42 0.5 0.5 Depunerile obinute prin RF-MS au fost introduse n soluii i meninute pe o perioad de trei sptmni la temperatura de 37C. La intervale de 48 de ore probele au fost analizate prin spectrofotometrie de transmisie n IR. n acelai timp prin spectroscopie ICP s-au urmrit i concentraiile ionilor de calciu i fosfor din soluie. Analiza spectrofotometric n infrarou este o metod rapid i eficient n caracterizarea fizicochimic a suprafeei acestor structuri. Chiar dac acest compus HA nu are benzi foarte intense, prin utilizarea unui spectrofotometru cu transformat Fourier pot fi puse n eviden modificrile frecvenelor de vibraie ce pot apare prin introducerea probelor n SBF. n felul acesta analiza FTIR a suprafeei probelor este o metod foarte eficient n detectarea formrii apatitei biologice la suprafaa implantului. Prin folosirea unei probe din siliciu, identice cu substratul folosit la realizarea depunerilor, s-a ncercat eliminarea din spectrul nregistrat a benzilor de absorbie caracteristice substratului.

Rezultate i discuii
ntr-o prim etap s-a efectuat analiza FTIR a pulberii de HA folosit la realizarea depunerilor. Spectrul acesta este prezentat n Figura 1. El a fost nregistrat cu un aparat Nicolet Avatar la o rezoluie de 4cm-1. Pentru obinerea unui raport semnal / zgomot cat mai bun au fost nregistrate 32 de spectre, pe ntreg domeniul spectral al aparatului: 4000 400cm-1. Din Figura 1 se observa ca spectrul FTIR al pulberii conine toate benzile caracteristice modurilor de vibraie ale gruprii fosfat [14]. Acestea sunt: -banda vizibil la 1090 cm-1 ce este caracteristic modului de vibraie 3, ntindere

Material i metod
Investigaiile in vitro ale structurilor de tip implant au loc att n culturi de celule, n care se urmrete rspunsul biologic al celulelor, dar i n soluii ionice ale cror concentraii sunt similare fluidelor biologice. n aceste soluii se urmresc de fapt modificrile fizico-chimice ale implantului datorit interaciunii acestuia cu fluidele din zona de implantare. Soluiile SBF, ale cror concentraii ionice sunt aproximativ egale cu cele ale plasmei umane vezi Tabelul 1 au fost preparate prin dizolvarea

362

Craiova Medical asimetric. Intensitatea acestei benzi este, n acest caz, relativ moderat. Acelai mod de vibraie este caracteristic i benzii intense de la 1041 cm-1. Prezena ambelor benzi este caracteristic fazei cristaline HA. -banda de mic intensitate vizibil la 960 cm-1 ce prezint i un umr la 950 cm-1. Acestea sunt caracteristice modului de vibraie 1 ntindere simetric. -dou benzi situate la 596 cm-1 respectiv 568 -1 cm , caracteristice modului de vibraie 4 deformare asimetric.
68 66 64 628 62 60 58 %T 960 56 54 52 568 50 48 46 44 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 1090 950 596

Vol 9, Nr4 , 2007 detecteaz un zgomot interferenial n regiunea 1400-2000 cm-1 datorat reflexiilor multiple n lama de Si. Ele nu influeneaz ns benzile de interes ale HA. Dup aceste analize iniiale, straturile de tip implant au fost introduse n soluiile fiziologice i meninute pe durata a 3 sptmni la o temperatur de 37C. La intervale de 24 de ore aceste probe au fost scoase din soluii, curate n alcool i ap deionizat, uscate i apoi analizate din nou prin spectroscopie FTIR. Astfel dup aproximativ 48 de ore, analiza spectral FTIR a pus n eviden apariia unei benzi de slaba intensitate centrat pe 877 cm-1, ce aparine unui mod de vibraie a gruprii carbonat Figura 2 b. Aceast band crete n intensitate pe durata meninerii acestor probe n SBF, Figura 3, ceea ce nseamn c aceste structuri sunt bioactive.
6

aria relativa

1041

Wavenumbers (cm-1)

Fig. 1: Spectrul pulberii HA din care s-au realizat intele

1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Spectrul mai conine i o band situat la 628 cm-1 ce este caracteristic modului de vibraie al gruprii hidroxil.
120 110 100 90 %T 80 70 60 50 1031 a 1084 628 571 599 958

timp , zile

Fig.3: Variaia n timp a ariei relative A/Ainitiala a benzii de la 877cm-1

628 100

80 877 %T 60 b 1084 958 40 571 599

20 4000 3500 3000 2500 cm-1 2000 1500

1031 1000 500

Fig. 2: Spectrul FTIR al probelor depuse prin RFMS nainte (a) i dup (b) meninerea pe durata a 3 sptmni n SBF

Pentru a pune n eviden modificrile ce au loc la suprafaa depunerilor de HA, introduse n soluiile fiziologice, spectrele IR ale acestor structuri au fost nregistrate nainte i dup introducerea n soluiile SBF, Figura 2 a, b. n spectru Figura 2.a se observ toate modurile de vibraie ale gruprii fosfat. Benzile sunt ascuite, despicate ceea ce arat c depunerile sunt cristaline. n plus aceste depuneri nu sunt contaminate cu impuriti. De asemenea se

De asemenea are loc i o modificare a benzilor de absorbie ale gruprii fosfat. Astfel aria acestor benzi crete de aproximativ trei ori dup meninerea n SBF. Acest aspect mpreun cu modificarea morfologiei suprafeei, pus n eviden prin microscopie electronic (SEM) [15] demonstreaz c are loc un proces de cretere chimic a unei noi structuri. Analiza spectrofotometric arat c aceast structur este de fapt HCA. Pentru a elucida mecanismul formrii acestei structurii am urmarit prin spectroscopie ICP variaiile n timp ale concentraiilor ionilor de calciu i fosfor din soluiile gazd. Aa cum se observ n primele 48 de ore valorile acestora cresc, Figura 4, ca urmare a existenei unui proces de dizolvare al filmului de HA. Acest proces va determina o suprasaturare la interfaa soluie - HA. Ulterior ionii de calciu i fosfor din soluie sunt adsorbii la suprafaa filmului, proces ce va sta la baza depunerii unei noi faze de HA pe suprafaa structurii iniiale. Acest aspect este pus in evidenta prin scderea n timp a concentraiilor ionilor de Ca si P din soluie, Figura 4.
363

J Neamu i colab: Testarea in vitro a unor structuri de tip implant

Menionam c principalele canale ce stau la baza acestei depuneri chimice sunt: HPO42- PO43- + H+ (1) H+ + HCO33- H2O + CO2 (2) 10Ca2+ + 6PO43- + 2HO- Ca10(PO4)6(OH)2 (3) sau Ca2+ + HPO42- + 2 HO- CaHPO4 2H2O (4) Astfel, primele dou reacii nu modifica pH-ul soluiei, protonii rezultai din descompunerea HPO42-fiind consumai n reacia de oxidare a ionului HCO33- n timp ce ultimele reacii stau la baza creterii chimice a unei noi faze de HA.
7

performane corespunztoare utilizrii acoperirile implanturilor metalice .

Bibliografie
1. Hench LL, Wilson J - (1993), editors, An introduction to bioceramics, vol 1. Singapore: World Scientific. 2. Geesink RGT, de Groot K, Klein CPAT - (1987) Chemical implant fixation using hydroxyl-apatite coatings, Clin. Orthop., 225:147-170. 3. Cooper SL, Peppas NA - (1982) editors, Biomaterials: Interfacial Phenomena and Applications, volume 199 of Advances in Chemistry Series, American Chemical Society. 4. Legeros RZ - (1991) Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine, volume 15 of Monographs in Oral Science, Karger, Basel, Switzerland. 5. Ferraz MP, Monteiro FJ, Serro AP, Saramago B, Gibson IR, Santos JD - (2001) Biomaterials, 22:3105. 6. Ban S, Hasegawa J - (2002) Biomaterials, 23:2965. 7. Nelea V, Ristoscu C, Chiriescu C, Ghica C, Mihailescu IN, Coenet A - (2000) Appl.Surf.Sci., 168:127. 8. Nelea V, Morosanu C, Iliescu M, Mihailescu IN (2003) Microstructure and mechanical properties of hydroxyapatite thin films grown by RF magnetron sputtering, Surf. Coat. Technol., 173:315-322. 9. Hata K, Kokubo T - (1995) Growth of a bonelike apatite layer on a substrate by a biomimetic process, J. Am. Ceram. Soc., 78:1049-1053. 10. Ducheyne P, Qiu Q - (1999) Bioactive ceramics: the effect of surface reactivity on bone formation and bone cell function, Biomaterials, 20:22872303. 11. Kokubo T, Kushitani H, Sakka S, Kitsugi T, Yamamuro T - (1990) Solution able to reproduce in vivo surface-structure changes in bioactive glassceramic A-W, J. Biomed. Mat. Res., 24:721-734. 12. Kokubo T, Ito S, Huang ZT, Hayashi T, Sakka S, Kitsugi T, Yamamuro T - (1990) Ca, P-rich layer formed on high-strength bioactive glass-ceramic AW, J. Biomed. Mat. Res., 24:331-343. 13. Hench L, Wilson J - (1999) An introduction to bioceramics, World Scientific Publishing Co., Pte. Ltd. 14. Elliot JC - (1994) Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates, volume 18 of Studies in Inorganic Chemistry., Elsevier Science B.V. 15. J. Neamtu, G.E. Stan, C. Morosanu, C. Ducu, I. N. Mihailescu Chemical growth of calcium phosphate layers in simulated body fluid trimisa pentru publicare la Journal of Material Science :Materials in Medicine ;

P
6 5 4 3

1.0

0.8

Ca, mM

0.4 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.2

0.0 20

zile

Fig.4. Variaia n timp a concentraiei ionilor de fosfor i calciu din soluiile SBF

Ulterior ionii de carbonat din soluie pot ocupa poziiile ionilor hidroxil i fosfat din noua structur HA ducnd n final la obinerea unui compus chimic ce poate fi reprezentat prin formula general: Ca10-x(PO4)6-x(CO3)x(OH)2-x nH2O

Concluzii
Rezultatele experimentale ale acestui studiu arat c depunerile de HA prin pulverizare n radiofrecvena sunt cristaline i necontaminate cu impuriti. Prin imersie n fluid biologic simulat (SBF), depunerile nu sunt biodegradate iar dup aproximativ dou zile ncepe un proces de carbonatare ce duce la apariia apatitei biologice. De aceea se poate spune c structurile astfel obinute sunt i bioactive, ele avnd astfel

Adresa pentru coresponden Prof. Univ. Dr. Johny Neamu, Disciplina Fizic farmaceutic, Facultatea de Farmacie, UMF Craiova, , B-dul 1 Mai, Nr.66, 200638, j.neamtu@yahoo.com

364

P, mM

Ca

0.6