SEMINAR

Sem 1. 1 Introducere i prezentarea obiectului Micropropagrii. Baze de date. Organisme i organizaii profesioniste 2. nfiinarea unitii de Micropropagare 3. Sterilizarea. Metode de dezinfecie i asepsizare 4. Prepararea unui mediu de cultur 5. Metode de laborator: analiza optic a tipurilor de esuturi utilizate n Micropropagare. 6. Cultura de protoplasti/ Resurse de informare. Cum citim un articol stiintific 7. Colocviu

2: nfiinarea unei uniti de micropropagare

Un laborator-unitate de culturi de esuturi vegetale, destinat doar scopurilor de multiplicare, nu trebuie s fie scump. Unitatea de micropropagare trebuie s dein ns obligatoriu un numr de ncperi separate, cu destinaie precis, elemente eseniale pentru reuita operaiunilor. Amenajarea corect, ntr-o ordine logic i eficient, asigur nu numai meninerea asepsiei dar i un nivel de standard ridicat al muncii. Amplasarea unei uniti de producie trebuie s in cond de gsirea unei locaii potrivite, de aproximativ 150 mp. Aceast locaie trebuie s fie amplasat ntr-o zon, luminoas, izolat de trafic, s mpiedice transmiterea contaminrilor de la o ncpere la alta, s dein un sistem de control al temperaturii, s fie legat la o surs de ap permanent i de calitate, precum i la o structur de alimentare cu curent electric (minimum 100 amp). Instalaiile electrice trebuie realizate de electricieni de profesie, (majoritatea firelor cerute fiind de 110 voli). De asemenea, pentru asigurarea securitii este indicat instalarea unor sisteme de detectare a incendiilor i a controlului temperaturii, conectate la o linie telefonic pentru intervenie urgent. Pentru situaii incidentale se recomand i instalarea unui generator de curent independent. Este recomandat ca unitatea de micropropagare s fie construit ca spaiu independent. Chiar dac aceasta implic cheltuieli suplimentare, izolarea este o garanie a meninerii condiiilor de curenie i asepsie. n prezent exist posibilitatea utilizrii prefabricatelor, disponibile n mrimile dorite, materiale care pot reduce costurile de nfiinare ale unitii. La instalarea unuei uniti de producie trebuie luat n vedere obinerea autorizaiei, amplasarea separat i la distan fa de zonele care reprezint surse de contaminare (zona de transfer postaclimatizare, zona de pregtire a amestecurilor de pmnt, zona de depozitare a

pesticidelor, ngrmintelor sau a altor substane chimice). n interior este obligatoriu utilizarea gresiei i a faianei pentru realizarea unor suprafee uor de curat. Asigurarea cureniei permanente este un principiu de baz. Contaminarea datorat murdriei poate duce la pierderi de la 1% pn la 50%. Avnd n vedere valoarea plantelor multiplicate in vitro nu pot fi acceptabile pierderi datorate murdriei mai mari de 1%. Sistemul de nclzire trebuie s permit realizarea unor temperaturi constante mai ales pe timpul iernii (min. 25C), iar pe timpul verii este necesar utilizarea unui sistem de ventilaie pentru controlul temperaturilor prea ridicate. Suprafaa total a unitii de micropropagare este compartimentat ntr-o camer destinat splrii vaselor, o ncpere pentru pregtirea i pstrarea mediilor de cultur i a soluiilor stoc prevzut cu o incint, separat exclusiv pentru autoclav, o camer steril pentru inoculri, camere de vegetaie i uniti pentru aclimatizare. Camera pentru pregtirea i pstrarea mediilor de cultur i a soluiilor stoc, precum i zona de splare a sticlriei trebuie amplasate separat de camera de inoculare i de cea de vegetaie. Zonele cele mai curate trebuie s fie camera de vegetaie i camera de inoculat. Aceste dou sectoare trebuie s fie amplasate astfel nct intrarea s nu se fac direct din afara cdirii. Mai mult, ele trebuiesc separate i ntre ele prin instalarea unor ui, cu rolul de reducere a traficului.

Camera destinat splrii vaselor Camera pentru splarea sticlriei trebuie s fie dotat cu surs permanent de ap rece i cald, de calitate, cel puin un bazin-chiuvet mare cu evi din materiale rezistente la soluii acide i alcaline, rafturi i dulapuri pentru uscarea i pstrarea sticlriei, aparatele pentru producerea apei distilate i deionizate.

Camera pentru pregtirea i pstrarea mediilor de cultur i a soluiilor stoc Camera pentru preparat mediile de cultur i a altor soluii trebuie s fie lng camera de splat, avnd astfel acces direct la sursa de ap distilat i la vase. Aceast ncpere este prevzut cu console sau mese de lucru foarte stabile. Suprafaa lor trebuie s fie din materiale rezistente i uor de curat. Camera trebuie s fie ncptoare deoarece n aceast zon se gsete majoritatea echipamentelor cerute n unitatea de micropropagare. Necesarul de echipamente se stabilete n funcie de mrimea unitii de producie i se completeaz adecvat dac n aceast unitate se realizeaz i activiti de cercetare.

Din tot necesarul de nfiinare, cele mai costisitoare sunt aparatele, pentru un laborator de culturi fiind necesar achiziionarea a minimum urmtoarelor echipamente:

Cantitate 100 buc.

Descriere produs

Utilizare produs

sticlrie
Vase de cultur din sticl, Vesel pentru autoclavabile, cu posibilitate meninerea de inchidere ermetic materialului vegetal prin subculturi Capace pentru vasele de nchiderea ermetic a cultur, autoclavabile, cel mai vaselor de cultur indicat din polipropilen Cutii Petri sau plci de faian Suprafa steril autoclavabile pentru fasonarea explantelor n timpul transferului pe mediu proaspt Sticle cu capac pentru ap, Ap steril pentru autoclavabile (500 mL) cltire Vas Erlenmeyer, 1000 mL Pregtirea mediului/soluii Vas Erlenmeyer, 2000 mL Pregtirea mediului/soluii Vas Erlenmeyer, 4000 mL Pregtirea mediului/soluii Vas Erlenmeyer, 6000 mL Pregtirea mediului/soluii Sistem de filtrare cu pomp de Sterilizarea soluiilor vacuum, pentru lichide, din stoc fierbini polistiren; 200 mL; 47 mm n diametru/ membrane filtrante de nailon cu pori de 0,22 m Cilindru de sticl/plastic Preparare soluii stoc gradat; 10 mL Cilindru de sticl/plastic Preparare soluii stoc gradat; 100 mL Cilindru de sticl/plastic Preparare soluii stoc gradat; 1000 mL Pipete gradate, 1 mL, sterile Msurare soluii stoc sau autoclavabile Pipete gradate, 5 mL, sterile Msurare soluii stoc sau autoclavabile Pipete gradate, 10 mL, sterile Msurare soluii stoc sau autoclavabile Pipete gradate, 25 mL, sterile Msurare soluii stoc

100 buc.

15 buc

10 buc. 1 buc. 1 buc. 1 buc. 1 buc. 1 cutie

1 buc. 1 buc. 1 buc. 100 buc. 100 buc. 100 buc. 10 buc.

500 buc.

sau autoclavabile eprubete

Iniierea (Etapa 1)

culturii

echipamente
1 buc. Sistem de purificare a apei; apa trebuie s aib o rezisten de cel puin 200.000 ohms/cm Balan electronic (cu trei zecimale, max.200 g capacitate) pH-metru (scara 0-140,01; conversie automat n funcie de temperatur (0-60C), cu 12 valori de calibrare Plit electric cu agitator magnetic; valoarea de nclzire pn la 400 C; vitez variabil de agitare (50150 rpm); rezistent chimic Combin frigorific pentru temperaturi de 2-6C n frigider i respectiv, -20C n congelator Autoclav cu operare la 121C, cu control presiune i durat Oal sub presiune cu operare ntre 116-126 C; 10-20 psi Etuv 120V (S636) sau 240V (S637) Cronometru electronic, cu alarm Stereo-lup prevzut cu surs de luminare Aparat fotografiat Purificarea apei pentru mediul de cultur Cntrirea substanelor chimice Msurarea i corectarea valorii pH a soluiilor Amestecarea i nclzirea mediului de cultur /soluii stoc

1 buc.

1 buc.

1 buc.

1 buc.

1 buc.

1 buc.

1 buc. 1 buc. 1 buc. 1 buc.

Pstrarea soluiilor stoc, mediilor, hormonilor, substanelor chimice Sterilizarea mediilor, soluiilor, sticlriei, instrumentarului Sterilizarea volumelor mici de mediu, soluii, obiecte mici Presterilizare, sterilizare uscat Alarm i cronometrare Observare material biologic Observare material biologic

chimicale
1L 1L 4L Splarea vaselor de sticl Dezinfectant (hipoclorit) Sterilizarea suprafeei explantului Alcool 70 % Pentru sterilizarea suprafeelor de lucru i a instrumentarului solutii standard de calibrare Calibrarea pHpentru valorile 4,0 si 7,0 metrului Detergent

Vat, tifon

Uz general

instrumentar
3 buc. 2 buc. 100 buc. 2 buc. 2 buc. 1 buc. 1 buc. 2-3 buc. 1 rol 1 pereche Foarfece din inox, autoclavabil Bisturiu din inox, autoclavabil, Lame bisturiu Nr. 11 Spatul mare Fasonat explante Fasonare explante

1 rol

2-3 buc.

2-3 buc. 25 buc. 1000 buc. 100 coli 1 rol

1 buc.

25 buc.

Fasonare explante Msurare volume mari de substane chimice Spatul mijlocie, 30 Msurare volume mari de cm lungime substane chimice Micropipet i vrfuri Msurare volume mici 0-20 l Micropipet i vrfuri Msurare volume mici 20-1000 l Marker colorat, 2-3 Etichetarea culturilor culori Parafilm(4``x250 ft) Sigilare vase de cultur Mnui de protecie Pentru manevrarea n pentru autoclav siguran a autoclavului i a vaselor fierbini Folie aluminiu Pentru mpachetarea instrumentarului n vederea autoclavrii Magnei de agitare ( Amestecarea soluiilor pe pentru volume de 250 agitator magnetic mL, 1000 mL, 2000 mL) Perie de sticl Splare eprubete i vase de sticl Suport eprubete Suport eprubete n camera de vegetaie erveele Pot fi sterilizate , sau pentru uz general n laborator Hrtie Pentru mpachetat, la sterilizare Band adeziv pentru Marcare autoclavare, autoclav, se etichetare difereniaz dup 15 min. de expunere la 121 C Termometru -20 /+150 Msurare temperatura C lichidelor sau n camera de vegetaie Tvie pentru Cntrirea substanelor cntrire, volume chimice diferite

n categoria echipamentelor opionale, n funcie de bugetul alocat dotrii, se pot achiziiona i altele, cum este cazul unui cuptor cu microunde- necesar pentru dezghearea rapid sau pentru topirea rapid a mediilor de cultur ce trebuie suplimentate postautoclavare cu diferite componente termosensibile; laboratorul poate fi dotat i cu o main de splat vasele de cultur, un sistem automat de dispersie a mediului de cultur, etc.

Camera steril pentru inoculri Alturi de camera de preparat mediul de cultur, exist camera steril, destinat inoculrilor, care trebuie s fie cea mai curat i izolat ncpere. Izolarea eficient a acestei ncperi asigur condiii de transfer aseptic i mpiedic circulaia sporilor

microorganismelor. n aceast incint este obligatorie purtarea unui echipament de laborator corespunztor (halat, pantofi, bonet, etc.). n aceast camer sunt montate hotele de suflat aer steril astfel nct toate operaiunile s se execute obligatoriu n condiii de asepsie. Pentru meninerea gradului de steril camera este prevzut cu un sistem de ultraviolete, lumina UV fiind ns utilizat, nainte sau ntre perioadele de inoculare i doar cnd personalul i materialul biologic nu se afl n ncpere. Pentru o protecie sporit a personalului, este indicat s fie avertizat prezena i funcionarea UV-ului iar nchiderea/deschiderea lmpilor UV s fie practicabile din exteriorul camerei, Suprafaa interioar a hotelor trebuie s fie din materiale perfect netede (sticl) pentru a reduce depunerile de praf i eventualele surse de depozitare a microrganismelor, uor de curat i rezistente. Camera trebuie s fie dotat cu surse de curent electric pentru hote, lupe, microscop i aparatele bacto-incineratoare (aparatele de sterilizat instrumentarul).

Camera de vegetaie Camera de vegetaie este locul unde se pstrez materialul vegetal (plante, calus, suspensii, protoplati) n vasele de cultur n intervalul dintre dou subculturi. Elementele caracteristice pentru aceast ncpere sunt definite de temperatur, umiditatea relativ, sistemul de iluminare i tipul de rafturi pentru culturi. Toate aceste elemente se stabilesc n funcie de mrimea camerei, locaie i tipul de cultur pentru care este destinat. Elementul esenial n camera de vegetaie l reprezint temperatura. n funcie de aceasta se stabilesc i ali parametrii cum sunt lumina, umiditatea relativ i tipurile de rafturi (simple, cu oglind sau cu system de rcire) pentru vasele de cultur.Valoarea medie a

temperaturii n camera de vegetaie este cuprins ntre 22 i 25 C. nclzirea camerelor de vegetaie nu prezint o problem n sine; mult mai dificil este ns rcirea i meninerea unei temperature constante aceasta se realizeaz prin instalarea sistemelor de aer condiionat sau a unor ventilatoare. Nu este indicat apelarea la geamuri pentru camerele de vegetaie deoarece aceasta ar spori riscul contaminrii culturilor n timpul verii i ar crea variaii de umiditate n timpul iernii. Unele camere de vegetaie pot fi meninute n ntuneric dar majoritatea culturilor au nevoie de lumin. Camerele de vegetaie sunt prevzute cu sisteme de iluminat neincandescent, asigurndu-se o intensitate medie de 1- 5 klux, aceast valoare fiind stabilit n funcie de specia cultivat i de sistemul de cultur practicat. Calitatea luminii este i ea o component esenial n procesele de culturi de celule i esuturi vegetale : majoritatea culturilor se practic sub lumin florescent alb. Stadiul de dezvoltare a culturii poate necesita ns utilizarea unui spectru variat de lumin. Culturile pot manifesta cerine specifice i fa de fotoperioad astfel nct orice camer de vegetaie va fi dotat cu un sistem automat pentru programarea fotoperioadei. Utilizarea unor surse de lumin de tipul reflectoarelor este limitat deoarece cldura generat de acestea poate determina condensarea sau concentrarea mediilor de cultur. Dac prezena reflectoarelor direct pe vasele de cultur este absolut necesar atunci trebuie s se asigure o circulaie corespunztoare a aerului cu ajutorul ventilatoarelor. Umiditatea relativ este foarte greu de controlat n interiorul vaselor de cultur. Valoarea umiditii relative n camera de vegetaie nu trebuie s scad sub 50 % ; dac valoarea crete peste limitele acceptabile se vor folosi metode de uscare iar pentru situaia invers vor fi folosite cantiti mai reduse de agar la prepararea mediului.

Unitatea pentru aclimatizare Aclimatizarea plantelor nrdcinate in vitro se realizeaz n boxe speciale n care toi factorii de stress post transferului ex vitro s poat fi controlai i adaptai n funcie de necesarul i starea plantulelor

Aspecte economice i comerciale ale unitii de micromultiplicare

Etichetare si pstrarea evidenei

Laboratorul de culturi de celule i esuturi vegetale, organizat pe principii comerciale necesit utilizarea unui sistem eficient de nregistrare a informaiilor care trebuie s asigure toate informaiile simplu i exact prezentate din toate etapele procesului operaional.Aceasta se realizeaz in scopul eficientizrii planificrii produciei i pentru reducerea la minimum, mentinndu-se costuri sczute de producie. Multe dintre informaii pot fi pstrate n registru, dar ideal este utilizarea unei baze de date pe calculator.Utilizarea calculatorului permite organizarea, accesarea, sortarea i clasificarea pe categorii. Exemple de nregistrri: Metode de cultur 1.Protocoale, proceduri, formule de medii 2.Reete de medii i soluii stoc Activitatea experimental 1. Specii recalcitrante, problematica de rezolvat 2. Evoluia experimentelor (detalii pe faze) Comenzi 1. Lista de furnizori (persoana contact, adrese,etc.) 2. Formulare tipizate 3. Informaii legislative pentru produse cu regim special Contabilitatea 1. Conturi 2. Facturi 3. Alte documente Control periodic 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Data verificrii hotelor Filtre schimbate Control biohazard Control instalaie electric Verificare aparate n regim special (autoclav, distilator, pH-metru) Control protecia muncii Control dotri prim-ajutor (acid acetic 2%, acid boric 4%, spirt medicinal, ap oxigenat 3%, bicarbonat de sodiu 2%, comprese sterile, leucoplast, pahar special pentru splat ochii, tinctur de iod, vat hidrofil, fa de tifon)

3: Sterilizarea; asepsizarea metode de sterilizare

Cuvinte cheie:
Sterilizare vs asepsizare, metod i ageni difereniai

Necesar consumabile:
Hipoclorit Alcool 70 % Ap ap steril

Necesar echipamente:
Filtru Millipore Autoclav Etuva

Noiuni teoretice
Prin steril n culturile in vitro se nelege lipsa total a microorganismelor, att de pe suprafaa ct i din interiorul materialului biologic cu care se lucreaz. Aceasta se asigur prin operaiunea de sterilizare sau dezinfecie. Sterilizarea se aplic urmtoarelor categorii de materiale: materialul biologic instrumentar i vase de laborator incintei i suprafeei de lucru.

Termenul de aspsizare este utilizat n cazul sterilizrii materialului vegetal deoarece rezerva de ageni patogeni endogeni nu poate fi eliminat prin tratamentele de splare cu ageni de sterilizare. Sterilizarea/dezinfecia se face cu ajutorul agenilor sterilizani care pot fi fizici sau chimici.

Agenii fizici: 1. Cldura uscat

Flambarea operaiunea de ndeprtare a agenilor patogeni prin inversare n alcool i trecere prin foc timp de cteva secunde. Metoda se aplic instrumentarului i cutiilor Petri folosite n cabinetul steril. Se poate aplica, cu risc, i esutului vegetal flambare uscat fr imersie n alcool, dar numai n cazuri extreme. nclzirea la rou sterilizarea prin supranclzire. Se aplic obiectelor metalice instrumentar. Aer cald etuvarea la 160-180C, timp de 1-3 ore. Se aplic vaselor de cultur (lipsite de mediu) instrumentarului. Uneori are rol de presterilizare i uscare a vaselor splate. i. Etuva este un aparat prevzut cu o incint interioar stratificat sau nu separat de exterior prin doi perei metalici izolai cu plci de azbest, care au rolul meninerii temperaturii constante, fr pierderi de cldur, pe tot parcursul desfurrii procesului de presterilizare. Este prevzut, de asemenea, cu termometru, buton de reglare a temperaturii dorite, temporizator, precum i cu un dulap pentru depozitarea materialelor sterilizate pentru o perioad determinat.

2. Cldura umed
Folosete aburii ca ageni de sterilizare. Are o putere de penetrare mai mare i asigur distrugerea microorganismelor hidratate. Fierbere: Se aplic instrumentarului sau obiectelor mici dopuri, garnituri, capace etc.

a. vapori de ap sub presiune autoclavarea. Orice agent patogen bacterie, ciuperc sau virus, inut timp de 1 or la o temperatur de 120C la o presiune de 1 atm. este distrus n totalitate. Autoclavarea este o etap obligatorie pentru sterilizarea vaselor, a mediilor de cultur i a apei de cltire folosit la limpezirea explantelor vegetale. Durata autoclavrii depinde de materialul care se sterilizeaz, fiind n medie de 20-25 min. pentru mediile de cultur, respectiv 1 or pentru vase, calculat din momentul cnd se obine temperatura, respectiv presiunea, dorit. pentru solide se recomand n medie 15 minute. pentru lichide timpul este n corelaie cu volumul care se sterilizeaz:

ml

25

50 25

100 250 500 1000 2000 28 31 35 40 48

Min. 20

Nu se recomand depirea timpului de autoclavare deoarece aceasta ar duce la degradarea componentelor din mediu. Dup autoclavare, eliberarea presiunii din autoclav trebuie s se fac treptat n cazul lichidelor i rapid, urmat de ciclul de uscare, n cazul solidelor Manipularea autoclavului se face numai de personal autorizat, sub control strict deoarece exist n permanen pericolul de explozie. Principiul autoclavrii const n circuitul vaporilor fierbini (121C) sub presiune (obinuit 1 atm. dar se pot folosi i presiuni mai mari 2-2,5 atm. pn la 7 atm.) ntr-o incint (camera de sterilizare) nchis. nclzirea vaporilor se realizeaz printr-un sistem de termoplonjare, iar circulaia vaporilor se face prin sistem de supape admisie evacuare. Exist mai multe tipuri de autoclave, clasificate dup: tipul de funcionare: cu gaz, electric, automatizat, neautomatizat. capacitate. n funcie de poziia incintei (vertical sau orizontal) Verificarea funcionrii se face periodic, de persoane autorizate sau la diferite intervale prin probe biologice. Pentru aceasta se folosesc culturi bacteriene cu rezistena cunoscut (de ex. Bacillus anthracis este distrus la 115C sau B. stearothermophillus distrus la 121C n 5 minute). (Este identificat numrul de bacterii nainte i dup autoclavare).

b. Pasteurizarea metod imaginat de L. Pasteur aplicabil materialelor care nu rezist la temperaturi foarte ridicate. Principiul metodei const n distrugerea agenilor patogeni prin oc termic: ridicarea la temperatur mare urmat de scderea brusc la temperaturi foarte sczute. Sunt descrise trei tipuri de pasteurizare, n funcie de valoarea medie a temperaturii realizat: joas: 60-65C 30 min., urmat de rcirea brusc la 3C i pstrare la 4C medie: 70-75C 10-20 min. rcire brusc 30C nalt: 85-90 cteva secunde rcire la 3C. c. Tindalizarea principiul metodei const ntr-o sterilizare fracionat. Se realizeaz printr-o nclzire discontinu 30-60C repetat timp de 3 zile consecutiv la interval de 24 ore. Scopul este distrugerea agenilor patogeni n forma lor vegetativ, iar prin rcirea lent asigurarea condiiilor favorabile (36C) pentru germinarea sporilor care vor evolua i astfel vor fi distrui la nclzirea din ziua urmtoare. 3. Razele ultraviolete Este o metod de distrugere a celulelor vegetative i mai puin eficient pentru sporii agenilor patogeni. Se realizeaz cu ajutorul lmpilor UV fixe sau mobile. Se aplic incintelor i suprafeelor de lucru. Nu este recomandat materialului biologic, deoarece poate induce mutaii.

4. Ultrasunetele
Principiul metodei const n folosirea vibraiilor acustice cu frecvene mai mari de 20.000 Hz care asigur dezintegrarea rapid a celulei bacteriene. Se aplic cu succes instrumentarul, folosind aparate speciale care sunt prevzute din construcie cu un cristal de cuar asupra cruia se acioneaz cu impulsuri electrice pentru realizarea vibraiilor. Avantajul metodei const n absena riscurilor i a timpului deosebit de scurt (cteva secunde).

5. Filtrarea
Metod de sterilizare bazat pe trecerea lichidelor prin substraturi poroase care au rolul de a reine elementele nedorite. Principiul se bazeaz pe exploatarea fenomenului de

adsorbie a particulelor la pereii capilarelor ce formeaz porii filtrului astfel c filtrarea nu presupune doar un fenomen mecanic. Exist diferite tipuri de filtre: de sticl, de ceramic, de hrtie sau alte membrane filtrante. Regulile ce trebuiesc avute n vedere la filtrare sunt: a. verificarea strii intacte a filtrului b. verificarea gradului de vscozitate a lichidului de filtrare i s nu conin particule mari n suspensie, ceea ce ar determina o colmatare prematur a filtrului. n caz de vscozitate prea mare se recomand o diluare. c. executarea filtrrii la o presiune corect (de obicei <30-40 mm Hg) i n timp adecvat (la un timp prea scurt i la presiune mare, filtrele se pot sparge, iar la un timp prea lung se pot colmata). d. evitarea variaiilor brute de presiune sau depresiune.

Agenii chimici
Pentru agenii chimici se prefer termenul de ageni dezinfectani celui de ageni sterilizani (pentru a nu se confunda sau suprapune cu metodele de inducere a sterilitii n organismele biologice care folosesc diferite substane chimice n acest scop). n funcie de materialul care urmeaz s fie sterilizat se folosesc diferite substane chimice: a. soluie de sublimat coroziv 0,1% HgCl2 pentru mese, mobilier b. detergeni c. bicromat de potasiu 5% - pentru pipete d. alcool etilic 70 e. formol 40% f. fenol 5% g. ap oxigenat 3% h. permanganat de potasiu 0,1% i. j. tincturi. EtOH 70% pentru suprafee sau 80% pentru instrumentele flambate

k. Hipoclorit de sodiu (NaOCl)

O metod de sporire a eficacitii agenilor sterilizani const n adugarea de surfactani pentru reducerea tensiunii superficiale create la interfaa dintre lichidul de dezinfectat i suprafaa (uneori nu chiar neted) materialului biologic (de ex.Tween 20; 40; 60; 80; Pluronic-F68, Pluronic- F127etc.)

Metode generale de evitare a contaminrii culturilor

a. Evitai circulaia excesiv n camera de inoculat i ntre camera de inoculat i camera de vegetaie sau camera de pregtit mediile de cultur. b. Nu lsai niciodat n camera de inoculat sau n hot vasele contaminate, murdare sau resturi de culturi infectate. Acestea trebuiesc autoclavate i apoi splate cu atenie. c. Pornii hota cu cel puin 20 minute nainte s se nceap operaiunile de inoculare. d. Sterilizai zona cu lampa de UV timp de 30 minute. e. Splai suprafaa hotei cu etanol 70 %. f. Purtarea inelelor, brrilor , a altor bijuterii sau a unghiilor lungi nu sunt indicate. g. Minile se spal cu ap cald i spun. h. Mrii accesul circulaiei aerului steril prin ndeprtarea tuturor obiectelor n surplus sau nefolositoare din interiorul hotei laminare. i. j. Pulverizai cu etanol 70 % toate obiectele ce urmeaz a fi introduse n hot. Meninei zona steril deasupra i n jurul vaselor de cultur deschise.

k. Trecei rapid prin flacr gura tuturor vaselor de cultur nainte de deschidere. l. Lucrai n partea interioar a hotei ct mai aproape de filtrele de sterilizare a aerului.

m. Evitai strnutul, tuitul sau vorbitul n zona steril a hotei i folosii o masc dac este necesar. n. Pstrai o poziie vertical a corpului n timpul lucrului. o. Cnd se toarn lichide sterile pstrai minile ct de departe de deschiderile flacoanelor. p. n hot plasai capacele de flacon, capacele cutiilor Petri n aa fel nct zona de steril s nu ating masa sau alt suprafa. q. Dup fiecare utilizare resterilizai pentru aproximativ 5 secunde toate instrumentele.

Protecie i hazard ntr-un laborator de culturi de celule i esuturi vegetale

a. Nu se pipeteaz cu gura. Pentru pipetare se folosesc Pipetteboy automate sau manuale b. Soluiile de dezinfectare (hipoclorit, Domestos, etc.) nu se expun la radiaii UV deoarece pot produce gaz toxic c. Dup flambare nu reintroducei instrumentul n vasul cu alcool, pericol de aprindere Nu folosii HgCl2 ca dezinfectant deoarece este foarte toxic

Exerciii practice
Exerciiul 1. Microfiltrarea Folosii un microfiltru Millipore de 0,4 m pentru a steriliza o soluie termosensibil: a. activitatea se execut n hota steril. b. ncrcai ntr-o siring soluia nesteril. c. deschidei cu atenie, fr s atingei, filtrul Millipore. d. fixai siringa ncrcat pe filtru. e. filtrai cu atenie (vitez i presiune medie) ntr-un vas colector sterilizat n prealabil. f. dac soluia filtrat trebuie adugat unui mediu lichid aceasta se va face la temperatura camerei iar n cazul mediului solid cnd acesta, dup topire, s-a rcit la 50-55C. Exerciiul 2. Sterilizarea mediilor de cultur Mediile de cultur se sterilizeaz prin autoclavare la temperatura de 121 C, sub o presiune de 1-1,2 atm Durata pentru autoclavare depinde de compoziia mediului i de volumul supus sterilizrii. Pentru reuita autoclavrii este recomandat dispersarea mediului n volume mici pentru evitarea alterrii chimice a componentelor n cazul unei expuneri ndelungate de timp. Practica a demonstrat c o expunere prelungit a mediului pentru sterilizare mpiedic solidificarea mediului dup rcire, avnd i efecte negative asupra creterii esuturilor vegetale.

Volumul mediului/vas (mL) 25 50 100

Timp minim de sterilizare (min) 20 25 28

250 500 1000 2000 4000

31 35 40 48 63

Timpul mininm de autoclavare reprezint timpul minim cerut pentru atingerea temperaturii de autoclavare (121 C), plus nc 15 minute din momentul ajungerii la temperatura de 121 C (Burger, 1988). Unele componente ale mediului sunt considerate ca fiind termosensibile i astfel nu pot fi autoclavate. Aceste substane se adaug mediului de cultur sub form de soluii stoc care se sterilizeaz prin filtrare prin filtru Millipore de 0,22 m, ntr-un vas steril, nchis.. Soluiile filtrate se adaug aseptic, mediului de cultur dup autoclavarea acestuia i rcirea la 35-45 C. Exerciiul 3. Sterilizarea suprafeelor materialului vegetal Suprafaa explantelor vegetale trebuie asepsizat pentru a evita creterea bacteriilor i/sau a fungilor. 1. Se selecioneaz materialul vegetal 2. Se detaeaz fragmente mari de esut (buci de tulpin cu noduri, vrfuri de lstari, boboci florali, frunze sau fragmente mari de frunz, etc.) 3. Se spal explantele sub un jet de ap de robinet pentru a ndeprta grosul de praf, resturi de sol, etc. (plantele ierbacee nu trebuie obligatoriu s fie tratate astfel). 4. Sterilizarea materialului biologic n soluie de Domestos (hipoclorit de sodiu 5%) timp de 15-20 minute sau 2-5 minute n funcie de tipul de esut. 5. Se cltete succesiv n 3-4 bi de ap steril pn la ndeprtarea total a soluiei de Domestos 6. Se fasoneaz explante cu dimensiunea de aproximativ 1 cm2 sau, n cazul tulpinilor, butai uni nodali.n cazul mugurilor fasonarea const n izolarea de meristeme 7. Explantele se plaseaz pe mediul de iniiere, 8. Se eticheteaz flacoanele i se depoziteaz n camera de cretere

4: Prepararea mediului de cultur. Soluii stoc

Cuvinte cheie:
pregtirea soluiilor stoc;. prepararea mediului de cultur MSO; fia de mediu;

Necesar echipamente:
Balan analitic Plit cu agitator magnetic pH-metru Autoclav

Necesar consumabile:
Substane chimice Filtre Millipore Ap distilat

Noiuni teoretice
Raportul ntre macroelemente i microelemente este definit de cerinele concentraiei celulare pentru un anumit element i este funcie de capacitatea fiecrui tip de cellule de asimilare a elementului respective. Majoritatea macroelementelor se dau n concentraii de ordinul milimolilor iar cmicroelementele de ordinul micromolilor. Concentraiile foarte reduse de microelemente nu reprezint indicaia c acest tip de compui sunt lipsii de importan; absena unui singur microelement poate determina apariia unor probleme de cretere extrem de severe. n practic, apa necorespunztoare (contaminat) utilizat la prepararea soluiilor stoc, pot aduga cantiti semnificative a acestor elemente n mediul de

cultur.. Practica cea mai sigur este utilizarea unor medii condiionate, n amestecuri gata preparate cumprate din surse comerciale autorizate i verificate. Alternativ, pot fi preparate i soluii stoc complexe, n concentraii mari pentru a fi utilizate n amestecurile finale. Un exemplu de astfel de soluie complex poate fi o combinaie de mai multe vitamine. Aceast metod este practicabil doar n cazul n care combinaia respecti este frecvent utilizat n aceeai formul. Cea mai folosit formul de mediu de cultur este cea descris de Murashigie i Skoog care a fost utilizat iniial pentru cultura esutului foliar de tutun. Este o formul bazat pe compoziia mineral a frunzelor de tutun. Mediul de baz Murashige- Skoog (1962), cod: MSO:

Exerciii
Component CaCl2-2H2O NH4NO3 KNO3 KI CoCl2-6H2O KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4 MgSO4-7H2O MnSO4-4H2O pH Cantitate 440 mg/l 1650 mg/l 1900 mg/l 0,83 mg/l 0,025 mg/l 170 mg/l 6,2 mg/l 0,25 mg/l 370 mg/l 22,3 mg/l Component CuSO4-5H2O ZnSO4-7H2O FeSO4-7H2O+ Na2EDTA Glicin Inozitol Acid nicotinic Piridoxin HCl Tiamin HCl Zaharoz 5.7 Cantitate 0,025 mg/l 8,6 mg/l 27,85 mg/l 37,25 mg/l 2,0 mg/l 100 mg/l 0,5 mg/l 0,5 mg/l 0,1 mg/l 30000 mg/l

practice
Exerciiul 1.:

Prepararea soluiilor stoc pentru mediul

MS (1962)

a) Macroelemente MS, concentraie 10x,

pentru 1L mediu se adaug 100 ml. - se toarn 250 ml ap bidistilat ntrun vas de 1L.

- se cntresc pe rnd si se adaug n apa din vas urmtoarele substane:

Azotat de K (KNO3).............................19,0 g Azotat de amoniu (NH4NO3)................16,5 g Clorur de Ca (CaCl2.2H2O) .................4,4 g Sulfat de Mg (Mg SO4.7H2O).............. 3,7 g

Fosfat monopotasic (KH2PO................ 1,7 g TOTAL..............45,3 g

- se complecteaz cu ap bidistilat steril pn la un litru, - se eticheteaz, se dateaz i se pstreaz la frigider.

b) Microelemente MS, concentraie 100x, pentru 1L mediu se adaug 10 ml

- se toarn 250 ml ap bidistilat steril ntr-un vas de 1L - se cntresc pe rnd i se adaug n apa din vas urmtoarele substane:

Sulfat de Mn (MnSO4.H2O) ............1180 mg Sulfat de Zn (ZnSO4.7H2O) ..............860 mg Acid boric (H3BO..............................620 mg Iodur de potasiu (KI) .........................83 mg Molibdat de Na (NaMoO4.2H2O) ........25 mg Clorur de Co (CoCl2.6H2O)........ 2,5mg Sulfat de Cu (CuSO4.5H2O) ...............2,5 mg TOTAL.........2773.0 mg
- se complecteaz cu ap distilat steril pn la 1L - se eticheteaz, se dateaz i se pstreaz la frigider.

c) Fierul pentru microelemente MS, concentraie 100x, pentru 1L de mediu se

adaug 5 ml - se toarn 400 ap bidistilat steril ntr-un vas de 500 ml . - se cntresc pe rnd i se adaug urmtoarele substane:

Sulfat feros (Fe2SO4.7H2O) ......2,78 g NaEDTA ..................................3,72 g TOTAL.................6,50 g

- se amestec la cald pn la completa dizolvare - se completeaz cu ap bidistilat steril pn la 1L - se eticheteaz, se dateaz i se pstreaz la frigider.

d) Vitamine MS, concentraie 100x, pentru 1L mediu se adaug 10 ml

- se toarn 250 ap distilat steril ntr-un vas de 1L - se cntresc pe rnd i se adaug urmtoarele substane:

Piridoxin HCl (Vitamina B........50 mg Tiamina HCl (Vitamina B1) .......10 mg Acid nicotinic (Vitamina PP) ......50 mg Glicina (aminoacid) ..................200 mg Mezoinozitol (alcool) ............10000 mg .............TOTAL..................10310 mg
Mediile de cultur pentru subcultivarea explantelor caulinare sau foliare (multiplicarea prin butire sau regenerare prin organogenez direct): MSO MSP1 MSD3 MSZ UM = MSO + 6 BAP (0,5 mg/l) + ANA (2,0 mg/l) = MSO + 6 BAP (1,0 mg/l) + AIA (2,0 mg/l) = MSO + Z (1,0 mg/l) = MSO + 2,4 D (2,0 mg/l) + Kin (0,25 mg/l) +Tiamin (9,9 mg/l) + Piridoxin (9,5 mg/l) + Acid nicotinic (4,5 mg/l) + hidrolizat de cazein (2000 mg/l). Mediul de cultur pentru nrdcinare MS = MSO + ANA (1,0 mg/l)

Medii de cultur folosite n culturile de calus Mediile de cultur pentru iniiere i cretere MS1 MS2 MS3 = MSO + BAP (de la 0,1 la 0,25 mg/l) + zaharoz (30 g/l) = MSO + 2,4 D (2,5 mg/l) + BAP (de la 0,1 la 0,25 mg/l) + zaharoz (20 g/l) = MSO + BAP (1,0 3,0 mg/l) + 2,4 D (2,5 mg/l) + zaharoz (40 g/l)

Mediul de cultur pentru inducerea embriogenezei somatice MS120 = MSO + 2,4 D (2,5 mg/l) + zaharoz (120 g/l)

Mediul de cultur pentru regenerare MS4 = MSO + Kin (1,0 - 3,0 mg/l) + Z (1,0 - 3,0 mg/l)

Exerciiul 2.: Prepararea mediilor de cultur Mediile de cultur sunt fie solide (gelificate), fie lichide, compoziia lor variind de la un autor la altul n limite destul de restrnse. Dup cum s-a vzut mai nainte n compoziia lor intr substane anorganice (macroelemente, microelemente i Fe chelatizat) precum i o serie de substane organice (vitamine, aminoacizi, glucide, hormoni) i dup caz un agent gelifiant. n general se prepar soluii stoc, separate pe: macroelemente, microelemente, FeEDTA, vitamine, aminoacizi i hormoni, care n momentul utilizrii necesit diluarea lor. Hormonii se folosesc n soluii pure i nu n amestec. Soluiile de substane anorganice se vor pstra n frigider la 4C, vitaminele n congelator, iar hormonii n apropierea congelatorului. Alegerea compoziiei mediului de cultur se face n raport cu scopul urmrit iar unul dintre cele mai folosite medii de cultur ar fi: Murashige - Skoog (1962) (MS), Gaborg & colab. (1968) (B5), Linsmeier - Scoog (1965) (LS), Knop, Heller, Nitsch & Nitsch. Nu se recomand scimbarea cantitailor din reetele de soluii anorganice, ntruct se produc modificari n ceea ce privete proporia diferiilor compui, alternd echilibrul ionic fixat ca optim din punct de vedere fiziologic, a stabilitii n timp a pH-ului.

Exerciiul 3: Prepararea unor soluii stoc de fitoregulatori de cretere La prepararea soluiilor stoc reinem cteva reguli generale: g. dizolvarea substanelor se face numai n ap bidistilat h. fiecare compus se dizolv ntr-o anumit cantitate de ap proporional cu i. j. numrul ingredientelor ce urmeaz a fi amestecate i cu volumul final al soluiei stoc, dup care soluiile obinute se amesteca succesiv, n ordinea

k. indicat n reetar l. la substantele greu hidrosolubile, amestecul se nclzete uor pe baia de

m. ap (dac reeta prevede aceast indicaie), agitnd n. regulatorii de cretere - hormonii - vor fi solubilizai fiecare n parte, potrivit o. indicaiilor din literatura de specialitate p. deoarece autorii exprim concentraia n maniera diferit (g, mg%, g/l sau

q. ppm) se are n vedere calcularea cantitii de substan ce trebuie cntrit r. pentru a asigura echivalena s. se are n vedere asigurarea echivalenei unui compus introdus n mediu t. cnd aceasta este o sare cu un anumit coninut n ap sau n cazul unor

u. sruri cristalizate v. n prepararea mediului de baz fiecare compus n parte se adaug ealonat, w. ntr-o anumit cantitate de ap bidistilat apreciat arbitrar, proporional cu x. volumul final al soluiei y. pH-ul mediului se va regla nainte de adugarea agarului z. agarul se va aduga mediului de cultur dup introducerea celorlalte aa. ingrediente, mediul agarizat, cu agarul lichefiat se repartizeaz n recipiente bb. de cultur. La pH prea acid sau la autoclavare incorect agarul rmne n cc. stare lichid i mediul de cultur nu se mai poate folosi. Fia mediului const n nregistrarea formulelor utilizate ntr-o baz de date proprii. Fiele vor conine obligatoriu codurile nscrise pe flacoane. MS , B5, WPM, etc.)

5. Metode de laborator: analiza optic a tipurilor de esuturi utilizate n Micropropagare.

Cele mai multe caracteristici structurale i metabolice sunt comune tuturor organismelor eucariotice, diferenele care exist fiind mai mult de detaliu, la nivel de mecanism molecular. Cu toate acestea exist trei mari caracteristici care deosebesc fundamental celulele vegetale de alte celule eucariotice i anume: 1. prezena unui perete celular rigid 2. capacitatea de fixare n cloroplaste a CO2 3. prezena unei vacuole mari, izolat printr-o membran, care ocup aproximativ 95% din volulmul citoplasmatic al celulei mature.

Plantele vasculare sunt alctuite din organe diferite- rdcin, tulpin, frunze, flori- i fiecare este alctuit dintr-un numr variat de esuturi, respectiv de celule. Toate structurile vegetale difereniate sunt iniiate din celule apte pentru diviziune, celule identice ca numr de cromozomi, specific speciei, ceea ce nseamn c n determinarea i controlul dezvoltrii i diferenierii celulare rolul determinant efectiv l joac activarea selectiv a anumitor gene n asociaie cu diferenele la nivel citoplasmatic. La nivel molecular aceasta nseamn c celulele vegetale individuale exprim doar o parte din informaia lor genetic total (respectiv, din genom). Expresia unei secvene particulare din genotip are ca rezultat diferenierea celular, creterea unui organ distinct i determin calea specific a dezvoltrii vegetale. O astfel de expesie diferenial poart denumirea de determinare i este necesar pentru meninerea i funcionarea unui anumit tip de esut. Diferena major ntre tehnicile clasice i cele moderne de nmulire vegetal const n faptul c sistemul tradiional se bazeaz pe organismul vegetal ca ntreg, n timp ce tehnologiile moderne utilizeaz ca baz pentru multiplicare, celulele. Tehnicile culturilor in vitro permit accesul la celulele vegetale individuale, ceea ce face posibil o gam larg de manipulri, urmate de selecie i inducerea regenerrii plantei ntregi prin controlul parametrilor de cultur relevani. nelegerea naturii, a limitelor i a posibilitii de control a acestei variabiliti funcionale a celulelor permit realizarea regenerrii organismelor vegetale dorite. O plant vascular regenerat, la maturitate, va conine cteva tipuri diferite de celule, care se vor grupa n esuturi; unele dintre aceste esuturi vor conine numai un anumit tip de celule, altele vor conine mai multe tipuri de celule. Celule de tip meristematic Aceste celule sunt mici (cca. 20 m), izodiametrice, caracterizate prin perete celular subire, nucleu mare, citoplasm dens, vacuol central, activitate metabolic redus, dar capacitate susinut de diviziune. Datorit spaiilor inter-celulare aproape inexistente, a lipsei totale a structurilor vasculare -ceea ce asigur absena total a agenilor patogeni- precum i a potenialului divizionar foarte ridicat (funcia principal a meristemului fiind mitoza) explantele de acest tip sunt cel mai mult folosite pentru iniierea culturilor in vitro

n corpul plantei, esuturile meristematice sunt localizate n zone specifice: zona meristemelor apicale, fiind punctele de cretere a rdcinilor i a tulpinilor zona meristemelor secundare (mugurii laterali), situate la nivelul nodurilor, fiind locul de iniiere a ramificaiilor n cazul unor specii, zona circular de esut, denumit cambiu, care se regsete n tulpina matur

Fig. Tipuri de meristeme: apical, lateral, intercalar, florifer (Cutter, 1978) Cu timpul, celulele produse n meristem devin difereniate n unul sau altul din urmtoarele tipuri de celule: Celule de aprare Celulele/esuturile de aprare acoper suprafaa frunzelor, tulpinilor i a rdcinilor. Sunt alctuite din celule plate, de obicei aezate pe cte un singur rnd, numite epiderme. Acest tip de celule secret la suprafaa exterioar a esutului cear, dnd natere unui strat impermeabil, numit cuticul. Datorit spaiului nchis i a umiditii ridicate (90-98 %) din vasele de cultur, la esuturile crescute in vitro stratul de cuticul este practic inexistent. Acest aspect necesit obligatoriu o aclimatizare treptat, la umiditi controlate, care s favorizeze formarea stratului protector.

Fig. Aspecte ale frunzei crescute in vitro: stnga sus (a)- suprafaa foliar nu secret cear; dreapta sus (b)- secreia tipic de cear n condiii de cultur in vivo; imaginea de jos- structurile tipice unei frunze crescute in vitro: astrosclereidele sunt prezente numai n mezofilul marginal (Cutter, 1978)

Izolate, celulele epidermale sunt folosite ca model experimental n studiile de programare a morfogenezei directe, fr o faz intermediar de calus. Cultivarea unui fragment subire de celule de mrime redus (1mm x 5 sau 10 mm), constnd din stratul epidermal i 3-6 straturi corticale de celule difereniate, permite ntr-o manier unic, monitorizarea proceselor morfogenice, prin intermediul unor markeri ai diferenierii, adic: (1) prin urmrirea la nivel celular din primele stadii de dezvoltare; (2) prin

controlul moleculelor specifice; (3) prin reprimarea inhibitorilor specifici anumitor ci metabolice i (4) prin regenerarea dup adugarea unor astfel de compui (Tran Thanh Van i Gendy, 1996).

Fig. Programarea morfogenezei in vitro: stnga regenerare muguri vegetativi primordii la 14 zile i muguri complet formai dup 5 sptmni (Ctan, 1996) dreapta- muguri florali: regenerare direct pornind de la esut epitelial primordii la 14 zile i floare complet dup 4 sptmni (Tran Thanh van i Gendy, 1996) Parenchimul Celulele parenchimului sunt mari, prezentd mai multe faete ca rezultat al aciunii presiunii i tensiunilor dintre celulele nvecinate, devenind izodiametrice cnd

sunt izolate; prezint perei subiri i vacuol central mare, puin specializate. De obicei sunt separate ntre ele i sunt pline cu plastide alturi de care conin cristale, taninuri, uleiuri, amidon, grunciori de aleuron. n zonele care nu sunt expuse luminii (de exemplu tulpinile subterane, tuberculi) n aceste celule predomin plastidele necolorate, acumularea de substane de rezerv definind funcia principal. Zonele expuse luminii (de exemplu frunzele) conin cloroplaste, funcia principal fiind fotosinteza. esut relativ nespecializat, parenchimul prezint un interes deosebit pentru multiplicare deoarece, datorit versabilitii, celulele sale i coserv foarte bine potenialul de redobndire a activitilor de tip meristematic. Chiar i n multiplicarea clasic, n fasonarea butailor, se utilizeaz zone cu esut parenchimatic, capabile s dezvolte primordii radiculare i caulinare. Cel mai bun exemplu al capacitii regenerative a esutului parenchimatic, izolat de condiiile normale, l reprezint obinerea unei plante de morcov complet format i funcional, pornindu-se din celule parenchimatice din floemul secundar radicular, cultivate pe mediu lichid suplimentat cu extract de nuc de cocos (Steward,1970) . Colenchimul Celulele colenchimului (lungi de maximum 2 mm) sunt nconjurate de un perete celulozic subire, mai ales la coluri, ceea ce le confer un anumit grad de plasticitate i capacitate de extinie. Datorit coninutului mare de pectin (45% la Petasites sp., Cutter, 1978), hemiceluloz (35%, la Petasites sp., Cutter, 1978) i celuloz (20% la Petasites sp., Cutter, 1978), aceste celule asigur suportul mecanic al plantei, gsindu-se mai ales n zonele organelor aflate n cretere (de exemplu, peiolul frunzelor este ntrit de prezena celulelor de tip colenchimatic). Pot conine plastide i pot chiar manifesta activitate fotosintetic. Sclerenchimul Sunt celule cu funcie de suport mecanic, prezente n semine, tulpini i n alctuirea esutului vascular din frunze. Peretele celular este foarte gros fiind puternic lignificat i dispus ntr-un strat uniform pe toat marginea celulei. Aceste esuturi nu pot

genera protoplati viabili, deoarece coninutul viu al celulei moare imediat dup ncheierea sintezei peretelui. Xilemul Xilemul conduce apa i mineralele dizolvate (ioni anorganici), de la nivelul rdcinilor n tot restul corpului plantei. Xilemul se formeaz din celule individuale aezate cap la cap sub forma unor tuburi cu diametrul mediu de 0,7 mm, avnd un aspect tipic de panglic sau spiral. La maturitate, peretele celular din capetele acestor celule se dizolv, peretele secundar se ngroa prin depunerea suplimentar de celuloz i impreganare cu lignin n timp ce coninutul citoplasmatic moare, rezultnd astfel un sistem conductor continuu. Acest tip de celule trebuie evitat la iniierea culturilor in vitro deoarece reprezint o posibil surs de rezerv de ageni patogeni endogeni care supracontamineaz explantul. Floem Componentele de baz ale floemului sunt:

elementele sit i celulele gard .

Elementele sit se numesc aa datorit pereilor perforai care permit legturi citoplasmatice pe plan vertical, ntre celule. Rezultatul acestor structuri l reprezint tubul perforat care conduce produii fotosintezei zaharuri i amino acizi- din locul de sintez (de la surs) de exemplu din frunz, spre locul de consum sau depozitare cum sunt de exemplu rdcinile, vrfurile de cretere a tulpinilor sau a frunzelor, flori, fruct, tuberculi, etc. Aceste celule nu mai conin nucleu ci doar cteva organite celulare, fiind astfel, pentru multe funcii, dependente de celulele gard. Cu toate c sunt active metabolic, datorit pierderii citoplasmei i a nucleului, aceste dou tipuri de celule nu sunt folosite ca materiale de iniiere a unei culturi de celule. Prezena lor ntr-o cultur de calus sau n agregatele celulare este important deoarece este semnul iniierii rediferenierii (organogenezei).

Fig. Diferenierea xilemului n calus-primul indiciu al reorganizrii esutului in vitro (Ctan, 1996) xilem tipic (Cutter, 1978)

Tipuri de cretere utilizate n culturile in vitro

Tehnicile i metodele de cultur in vitro permit obinerea a dou tipuri de cretere: creterea materialului vegetal n form organizat (celule, esuturi specializate i organe) i respectiv, creterea materialului vegetal n form neorganizat (calus, suspensii celulare). Pentru scopurile de multiplicare in vitro sunt folosite att creterea organizat ct i cea neorganizat.