Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 2(320) 2013

EFICIENA NOILOR INDUCTORI N OBINEREA HAPLOIZILOR MATERNI LA PORUMB (Zea mays L.)
Sarmaniuc M., Mihailov M., *Rusu G. Institutul de Genetic i Fiziologie a Plantelor al Academiei de tiine a Moldovei, *Institutul de Fitotehnie Porumbeni Rezumat
n ultimii 5-10 ani, liniile dublu haploide (DH) sunt intens utilizate n ameliorarea porumbului (Zea mays L.). Aceasta a devenit posibil datorit progresului substanial al tehnologiei inducerii haploizilor materni in vivo. n aceast lucrare este descris eciena noilor linii inductoare LHI, ce deriv din plantele F6 ca rezultat al ncrucirii liniilor ZMS, Stock 6 i MHI. Liniile LHI demonstreaz rat de inducere a haploizilor medie, de 10-15%, posed gene marcher antocian dominante, ce permit identicarea haploizilor la diferite faze de dezvoltare: boabe uscate (R1-nj), plantule i plante mature (B1, Pl1) din diferite tipuri de material. Cuvinte cheie: Zea mays L., inductori, rat de inducere a haploizilor, linii DH Depus la redacie 06 iunie 2013 --------------------------------------------------------------------------------------------------------Adresa pentru coresponden: Sarmaniuc Mariana, Institutul de Genetic i Fiziologie a Plantelor al Academiei de tiine a Moldovei, str. Pdurii, 20, MD-2002 Chiinu, Republica Moldova; e-mail: sarmaniuc_1984@mail.ru; tel.(+373 22) 66-03-64

Introducere n prezent, cele mai mari companii de producere a porumbului utilizeaz tehnologia haploidiei la crearea liniilor homozigote i hibrizilor. Comparativ cu metoda tradiional ce necesit 5-7 autopolenizri repetate, prin haploidie liniile sunt create n dou generaii, iar durata procesului de ameliorare se reduce de 2-3 ori. Prima generaie prevede obinerea de plante haploide. n generaia a doua la haploizi se dubleaz numrul de cromozomi cu diferii inhibitori mitotici, ca rezultat se obin plante DH, ce sunt 100% homozigote. n prezent haploizii prezint baz material, pentru soluionarea diferitor probleme n genetic, citogenetic, ameliorare i altele [7]. Haploizii materni reprezint plante cu garnitura njumtit de cromozomi (n), comparativ cu forma iniial (2n), dezvoltndu-se din ovule nefecundate [10]. Actualmente, obinerea haploizilor a devenit posibil datorit liniilor cu capacitate de inducere in vivo, prin ncruciarea acestora cu donorii (genotip din care se obin boabele cu embrion haploid). Pentru evidenierea haploizilor, n inductori au fost integrate anumite gene dominante, ce regleaz sinteza pigmentului antocian i formeaz sistemul marcher. Pigmentarea antocianului n esuturi la diferite faze de dezvoltare, permite diferenierea haploizilor de diploizi n descendena F 1. Stock 6 este primul inductor, ce a fost depistat ntmpltor de ctre americanul Ed Coe n 1959 [1]. n ncruciri cu

105

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 2(320) 2013

donorii relev rat haploid de 2-3%. Implicarea liniei Stock 6 n diferite ncruciri a rezultat crearea de ali noi inductori [2, 8, 10,12]. Cu ecare an tehnologia haploidiei avanseaz tot mai mult, necesitile de plante haploide sunt din ce n ce mai mari, iar inductorii nc demonstreaz dezavantaje n obinerea acestora. La o mare parte, e rata haploid nu este sucient de nalt, e sinteza antocianului determinat de genele marcher este instabil. Odat cu mrirea diversitii materialului din care se dorete obinerea haploizilor s-a determinat, c unii donori inueneaz puternic pigmentaia antocianic. n unele cazuri intensitatea pigmentrii ind att de slab, nct haploizii i hibrizii practic nu se deosebesc cu nimic de cele materne [7]. Pentru sporirea ecienei tehnologiei haploidiei nc este necesar ameliorarea liniilor inductoare. n procesul obinerii noilor inductori, paralel cu majorarea ratei haploizilor este necesar i consolidarea sistemului marcher. Pigmentaia determinat de genele marcatoare s permit diferenierea exact a haploizilor de diploizi la diferite faze de dezvoltare fr mult efort i cheltuieli, din diferite tipuri de material. Astfel, scopul acestei lucrri a constituit aprecierea noilor inductori (rata de inducere i eciena genelor marcher) n procesul de obinere a plantelor haploide din diferite tipuri de material. Material i metode n cadrul Institutului de Genetic i Fiziologie a Plantelor au fost create noi linii de inducere a haploizilor materni, prin autopolenizarea combinaiilor hibride obinute la ncruciarea inductorilor: Stock 6 [1]; ZMS (Zarodivi Marker Saratov) [11]; MHI (Moldavian Haploid Inducer) [4]. Autopolenizarea repetat s-a realizat pn n generaia a asea, iar din cele mai bune forme F6 au fost selectate 11 linii, ce au fost numite LHI (Linie Haplo-Inductoare). Liniile LHI conin genele marcher R1-nj, B1 i Pl1, ce regleaz sinteza antocianului la diferite faze de dezvoltare. Haploizii se pot identica la nivel de boabe uscate, prin pigmentaia antocianic n endosperm i embrion reglat de R1-nj; plantule de 3-4 zile dup coloraia roietic a sistemului radicular i coloraia intens violet n esuturile vegetale la etapa de plant matur determinat de genele B1 i Pl1. Pentru aprecierea ratei de inducere i manifestrii fenotipice a genelor marcher la liniile LHI au fost utilizai aproximativ 30 donori din dou grupe heterotice Lancaster i Iodent puse la dispoziie cu amabilitate de ctre Institutul de Fitotehnie Porumbeni. Fiecare donor a fost semnat pe parcel aparte a cte 2 rnduri, unde s-a realizat ncruciri cu diferite linii LHI. Dup recoltare, pe ecare tiulete polenizat cu inductor s-a apreciat intensitatea pigmentrii antocianului n endosperm i embrion i s-a calculat procentul de haploizi, dup care s-a determinat rata de inducere a ecrei linii n dependen de donor. Pentru analiza pigmentrii antocianului n sistemul radicular la plantule de 3-4 zile, boabele F 1 au fost germinate n termostat la T 26 C, pn la apariia rdcinilor. Rezultate i discuii Potrivit rezultatelor obinute de Eder, Chalyk (2002); Kebede i colab (2011) germoplasma matern manifest inunen asupra ratei haploizilor, iar cele obinute de Coe (1994) demonstreaz aciunea donorului i asupra expresiei genelor marcher

106

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 2(320) 2013

[2, 5, 6]. Posibilitatea de a obine plante haploide dintr-un spectru vast de material a favorizat analiza detaliat la noile linii a ratei haploizilor i a manifestrii fenotipice a marcherilor antocianici. n general frecvena haploizilor pe tiulete a variat de la 0,9 la 26,1%. Valorile maxime sunt aproximativ de dou ori mai nalte, dect cele preconizate. Comparativ cu cel mai bun genitor MHI cu efectivitate de inducere de pn la 8%, liniile LHI n dependen de combinaia donorinductor au indicat rat a haploizilor pn la 18,2%. De asemenea, liniile LHI ind implicate n ncruciri cu diferii donori au prezentat efectivitate inductiv medie de la 5,1 la 9,9% (tabelul 1). LHI 1, LHI 4 i LHI 11 au demonstrat ecien inductiv redus, pentru care nu au fost indicate.
Tabelul 1. Variaia ratei de inducere la liniile LHI n dependen de combinaia donorinductor. Inductori LHI 2 LHI 3 LHI 5 LHI 6 LHI 7 LHI 8 LHI 9 LHI 10 Numr de donori 12 11 6 8 14 12 12 14 Numr de boabe 2978 1761 611 659 1935 1326 1676 2926 Media ratei haploizilor, % 8,5 0,46 8,3 0,64 9,8 0,64 7,2 0,59 9,9 0,76 6,7 0,48 5,1 0,51 6,7 0,51 Variaia ratei haploizilor n diferii donori,% 2,5 14,2 2,1 15,0 3,6 15,9 1,5 14,3 3,7 18,2 2,1 11,8 1,9 11,3 2,5 12,1

Sistemul marcher la liniile LHI conine genele antocian R1-nj, B1 i Pl1. Dintre acestea, cea mai ampl utilizare n identicarea haploizilor demonstreaz R1-nj. n combinaie cu alte gene dominante ce controleaz sinteza antocianului ( A1, A2, Bz1, Bz2, C1 i C2), marcherul determin pigmentaie antocianic n aleuron (esut endospermal) i scutellum (esut embrionar) la etapa de boabele uscate. Ca rezultat, al polenizrii donorului cu inductorul ce conine R1-nj, haploizii combin embrion matern (nepigmentat) i endosperm triploid (pigmentat) derivat din genomul matern i patern [7, 8]. Pigmentaia din embrion i endosperm permite ecient i uor selectarea boabelor cu embrion haploid. n prezent, la majoritatea inductorilor pigmentarea antocianului n boabele uscate reprezint reperul identicrii haploizilor. Paralel cu determinarea ratei haploizilor s-a evaluat intensitatea pigmentrii antocianului n boabele obinute, ca rezultat al ncrucirii donorilor cu liniile LHI (tabelul 2.). S-a constatat, c intensitatea pigmentaiei n diferite genotipuri a variat de la 0,9 la 3,9 n embrion i de la 0 la 3,7 n endosperm pe o scar de la 4 pentru pigmentaie intens la 0 pentru lipsa acesteia. Pentru Hibridul 12 valoarea de 1,0 a pigmentaiei antocianului n endosperm i embrion s-a dovedit a destul de slab, iar haploizii practic nu au putut selectai. La Hibridul 20 s-a stabilit cea mai major intensitate a pigmentrii de 3,9 n embrion i 3,4 n endosperm, diferena ntre boabe haploide i hibride a fost evident, iar selectarea s-a realizat uor i cu exactitate nalt. Pe lng marcherul R1-nj, liniile LHI conin genele B1 i Pl1 ce controleaz sinteza antocianului n sistemul radicular la plantule de 3-4 zile.

107

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 2(320) 2013

Tabelul 2. Inuena donorului asupra pigmentrii antocianului n endosperm i embrion la faza de boabe uscate. Donor Hibrid 1 Hibrid 2 Hibrid 3 Hibrid 4 Hibrid 5 Hibrid 6 Hibrid 7 Hibrid 8 Hibrid 9 Hibrid 10 Hibrid 12 Hibrid 13 Hibrid 14 Hibrid 15 Hibrid 16 Hibrid 17 Hibrid 18 Hibrid 19 Hibrid 20 Hibrid 21 Hibrid 23 Hibrid 27 Hibrid 28 Hibrid 29 Hibrid 30
a

Numrul de boabe 177 501 587 725 1317 579 1305 492 687 848 236 841 987 1096 535 225 948 649 735 644 1005 243 264 153 273

Evaluarea medie a pigmentriia embrion 3,5 0,4 3,0 0,1 2,1 0,1 2,3 0,1 3,2 0,1 2,2 0,1 3,2 0,2 3,1 0,2 2,9 0,2 2,3 0,2 1,0 0,2 3,5 0,1 2,6 0,2 3,1 0,1 3,1 0,3 2,8 0,2 3,3 0,2 2,1 0,1 3,9 0,1 3,3 0,2 3,7 0,2 2,3 0,3 2,5 0,3 2,5 0,3 2,6 0,2 endosperm 2,5 0,4 2,9 0,3 2,1 0,1 2,1 0,1 2,2 0,1 2,0 0,0 2,9 0,2 2,5 0,1 2,6 0,2 2,2 0,1 1,0 0,2 2,5 0,2 2,2 0,2 2,2 0,1 2,7 0,2 2,3 0,2 2,7 0,2 2,0 0,1 3,4 0,2 3,0 0,1 3,6 0,2 2,0 0,2 2,3 0,2 2,5 0,3 2,2 0,1

S-a utilizat urmtoarea scar: 4 pigmentare intens; 3 pigmentare normal; 2 pigmentare slab; 1 pigmentare foarte slab; 0 lipsa pigmentaiei

Ca rezultat al germinrii boabelor s-a constatat, c germoplasma matern nu manifest inuen asupra expresiei B1 i Pl1, precum n cazul marcherului R1-nj. Plantulele haploide ce se dezvolt din ovule nefecundate nu conin genele marcher, pentru care au sistem radicular apigmentat, spre deosebire de hibrizi cu rdcini pigmentate. Diferena ntre haploizi i diploizi este evident, iar selectarea se face cu exactitate de 100%. La urmtoarea etap a lucrrii s-a propus aprecierea identicrii haploizilor dup marcherii antocianici R1-nj, B1 i Pl1 obinui din diferite genotipuri. S-a luat cte un tiulete din diferii donori polenizi cu inductor, iniial s-a identicat numrul de haploizii dup manifestarea fenotipic a genei R1-nj, dup care numrul total

108

Genetica, Biologia molecular i Ameliorarea

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 2(320) 2013

de boabe a fost germinat, apoi plantulele haploide au fost identicate dup marcherii B1 i Pl1 (tabelul 3).
Tabelul 3. Efectivitatea selectrii haploizilor din diferii donori la faza de boabe uscate (R1-nj) i plantule de 3-4 zile (B1 i Pl1). Genotip Hibrid 2 Hibrid 3 Hibrid 5 Hibrid 6 Hibrid 7 Hibrid 9 Hibrid 10 Hibrid 12 Hibrid 13 Hibrid 14 Numr de boabe 94 62 113 14 157 51 72 63 65 68 123 Nr. haploizi dup R1-nj 6 6 11 2 9 3 2 4 5 6 4 Intensitate de pigmentarea embrion endosperm 3 3 4 4 3 3 4 3 2 1 3 3 2 2 3 4 4 1 0 3 4 3 Nr. haploizi dup B1 i Pl1 9 6 13 3 9 4 10 8 6 8 8

Hibrid 15 Hibrid 19 50 5 3 3 7 a S-a utilizat urmtoarea scar: 4 pigmentare intens; 3 pigmentare normal; 2 pigmentare slab; 1 pigmentare foarte slab; 0 lipsa pigmentaiei.

n tabelul 3 este relatat efectivitatea selectrii haploizilor din diferii donori la nivel de boabe uscate dup marcherul R1-nj, ulterior la faza de plantule de 3-4 zile dup B1 i Pl1. Astfel, s-a constatat c la Hibridul 3 i Hibridul 7, R1-nj la care s-a manifestat pigmentarea intens a antocianului n endosperm i embrion, numrul de haploizi coincide cu cel determinat la faza de plantule. n cazul Hibridului 12, Hibridului 10, Hibridului 15 coloraia slab din aleuron i scutelum a mpiedicat identicarea exact, numrul haploizilor la etapa de boabe uscate nu coincide cu cel stabilit la faza de plantule. n asemenea cazuri, soluia n evidenierea haploizilor este expresia genelor B1 i Pl1. Totui, dac R1-nj manifest coloraie intens selectarea se va face la faza de boabe uscate. n cazul pigmentaiei antocianice slabe n endosperm i embrion, identicarea mai precis a haploizilor se va realiza la faza de plantule de 3-4 zile. Concluzii Analiza rezultatelor privind aprecierea liniilor LHI la inducerea haploizilor materni a permis constatarea urmtoarelor: (i) noii inductori au demonstat rat de inducere medie, de 10-15%, mult mai nalt dect s-a preconizat, (ii) sistemul marcher ce conine genele antocian R1-nj, B1 i Pl1 n dependen de germoplasma matern permite exact i uor identicarea haploizilor la diferite faze de dezvoltare (boabe uscate, plantule de 3-4 zile i plante mature). Bibliograa 1. Coe E. A line of maize with high haploid frequency. //Amer. Nat. 1959.V. 93.
381-382.

109

Microbiologia i Biotehnologia

Buletinul AM. tiinele vieii. Nr. 2(320) 2013

2. Coe E., Sarkar K. The detection of haploids in maize. // J. Heredity. 1964. V. 55. 231-233. 3. Coe E. Anthocyanin genetics. // The Maize Handbook M. Feeling. V. Walbot (eds) Springer-Verlag. 1994. 279-281. 4. Chalyk S. Use of maternal haploid improving maize inbred lines. // Maize Genetic Cooperation News Letter. 1999. V. 73. 73-77. 5. Eder J., Chalyk S. In vivo haploid Induction in maize. // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104(4). 703-708. 6. Kebede A. et al. Effect of source germoplasm and season on the in vivo haploid induction rate in tropical maize. // Euphytica. 2011. V. 180. 219-226. 7. Geiger H., Gordillo G. Doubled haploids in hybrid maize breeding. // Maydica. 2009. V. 54. 485-499. 8. Lashermes P., Gailard A., Beckert M. Ginogenetic haploid plants analysis for agronomic and enzymatic markers in maize (Zea mays L.). // Theor. Appl. Genet. 1988. V. 76. 570-572. 9. Prigge V. Implementation and optimization of the doubled haploid technology for tropical maize (Zea mays L.) breeding programs. // Ph.Thesis. Univestity of Hohenheim, Germany. 2012. 55 p. 10. Rber F., Gordillo G., Geiger H. In vivo haploid induction in maize. Performance of new inducers and signicance of doubled haploid lines in hybrid breeding. // Maydica. 2005. V. 50. 275-283. 11. ., . . . // . 2. -. 1971. 60-66. 12. ., . . // . 1984. . 276. 735-738.

110