UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul

de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C. L2 Cromatografia de Excluziune Sterica Metodele cromatografie de permeaie pe gel i cromatografia de excluziune steric au fost dezvoltate ca variante ale cromatografiei n faz lichid, ambele metode cptnd n ultima perioad o importan deosebit ca metode de studiu a polidispersitii polimerilor i de determinare a curbelor de distribuie molecular. 1. Masa molecular medie numeric (aritmetic ), definit prin relaia (1):

Mn =

n M n
i i

= ni M i (1),

n care ni este fracia numeric a macromoleculelor de mas Mi; Masa molecular medie gravimetric (ponderat), definit prin relaia (2):
Mw =

n M n M
i i

2 i i

= wi M i (2),

n care wi este fracia ponderat a moleculelor de mas Mi;

IPD =

Mw (3) Mn
M (4). M mer

GP =

Principiul metodei. Cromatografia pe gel permeabil i cea de excluziune steric au la baz fenomenele care apar la trecerea soluiei unui polimer polidispers printr-un strat de umplutur cu pori de anumite dimensiuni, n pori fiind reinute macromoleculele de dimensiuni adecvate (mai mici dect diametrul mediu al porilor) iar cele de dimensiuni mai mari ies din coloan odat cu solventul - figura 1. Detecia poate fi realizat cu ajutorul unui detector de tip UV-VIS, RI, fluorescen sau conductometric. n cazul ambelor tipuri de metode, mecanismul principal de reinere este acela de excluziunea steric, dar n cazul cromatografiei de permeaie pe gel, n literatura de specialitate se menioneaz faptul c, concomitent cu reinerea steric (datorat dimensiunilor macromoleculelor) au loc i interaciuni de natur electric, mai ales pentru c n general cromatografia pe gel permeabil este practicat cu utilizarea unor soluii apoase ale unor acizi, baze, sruri sau soluii tampon de diferite trii ionice. 1

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Figura 1. Ilustrarea principiului de separare a polimerilor prin CPG i CES http://www.separations.eu.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/SizeExclusion/ http://www.viscotek.com/the-gpc-sep.htm http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtration# http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/SizeExclusion/Organic SolublePolymers/Hhr/TSKgelGMHhr-Mmixedbed.htm http://www.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/protein_purification~gel_filtrat n cazul cromatografiei de excluziune steric reinerea are loc pur datorit excluziunii sterice, aceasta fiind practicat cu utilizarea unor solveni aprotici: dioxan, tetrahidrofuran etc..

Rezervor solvent de eluie (faz mobil)

Sistem de injecie

Sistem de detecie

Colector de fraciuni

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Figura 2. Componena unui sistem de CPG sau CES Cu ct dimensiunea particulelor este mai redus cu att va fi necesar un volum mai mare de solvent pentru eluia de pe coloan numit i volum de retenie VR. Curba tipic sau de distribuie a polimerilor obinut prin CPG sau CES se caracterizeaz prin: volumul de eluent care a trecut prin coloan din momentul injectrii probei (VR) i lrgimea curbei msurat la jumtatea ei W1/2. Factorii care influeneaz separarea prin cromatografie pe gel permeabil i respectiv forma curbei obinute sunt: natura i caracterisiticile fazei staionare, natura polimerului, caracteristicile fazei mobile i condiiile de operare. Natura i caracterisiticile fazei staionare joac un rol important n obinerea unor cromatograme corespunztoare, n principal prin mrimea i distribuia porilor, aspecte care dicteaz i intervalul de separare. n plus faza staionar trebuie s fie stabil i s i menin stabile proprietile pe o durat ct mai ridicat de timp, s nu interacioneze cu faza mobil sau cu componenii probei. Natura polimerului. n condiiile n care dimensiunile porilor fazei staionare rmn neschimbate (constante) cu ct dimensiunea macromoleculelor este mai redus cu att va fi necesar un volum mai mare de solvent pentru eluia de pe coloan numit i volum de retenie VR. Volumul de retenie variaz liniar i cu concentraia polimerului. Caracteristicile fazei mobile determin volumul hidrodinamic al macromoleculelor n timp ce condiiile de operare determin n unele cazuri limea cromatogramei. Etalonarea coloanelor de cromatografie pe gel permeabil/excluziune steric. Cromatografia pe gel permeabil/excluziune steric nu este o metod absolut (este realativ), fiind necesar calibrararea (etalonarea) cu etaloane de mas molecular cunoscut. Procedeul uzual implic utilizarea unor soluii de polimeri cu mas molecular cunoscut i distribuie ngust IPD=1, n domeniul de mase moleculare de interes. Practic, calibrarea implic trasarea unei drepte lgM=f(VRi). Determinarea volumelor VRi de eluie se realizeaz prin injecia n coloan a unor polimeri sau amestecuri de polimeri de mas cunoscut. Deoarece materialul de umplutur utilizat este unul poros pentru nceput este necesar determinarea volumul liber al sistemului V0 = V0P (volumului liber al porilor) V0t(care se adaug i volumul este necesar introducerea unei corecii prin raportarea volumelor de eluie VRi la volumul V0. n acest caz, ecuaia dreptei de etalonare va fi o funcie lgM=f(VRi/V0). Pentru determinarea V0 este necesar s se realizeze o eluie a unui compus (polimer) cu masa molecular peste limita superioar de separare a umpluturii coloanei.

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.

Figura 3. Cromatograma HPSEC GPC a unui amestec de proteine Determinarea distribuie de mas molecular prin cromatografie de excluziune steric de nalt performan (high performance size exclusion chromatography) necesit, de cele mai multe ori n cazul polimerilor naturali modificarea chimic a probei prin derivatizare. Modul de lucru Se pornete sistemul de cromatografie HPSEC i se ateapt o perioad de cel puin 30 minute pentru stabilizarea acestuia. Eluentul utilizat n cazul de fa este tetrahidrofuranul (THF) Se utilizeaz o coloan cu umplutur din polistiren-divinil-benzen (domeniu de separare 103-105 ) nseriate. Deoarece n cazul polimerilor naturali (lignina) n structura acestor regsim un numr mare de grupe hidroxilice este necesar blocarea acestora prin modificare chimic. Scopul modificrilor este reducerea sau nlturarea complet a interaciunilor dintre grupelor funcionale prezente n structura polimerilor naturali (grupele OH) i umplutura din care este realizat coloana. Un efect secundar pozitiv al derivatizrii este creterea solubilitii n solveni organici aprotici. Principalele metode de derivatizare: acetilarea, metilarea, sililarea. Trasarea curbei de etalonare-exemplu Se traseaz curba log M = f (Ve) utiliznd datele din cromatograma de mai jos i tabelul 2. Pentru etalonarea coloanelor de HP SEC se utilizeaz un amestec de polimeri (standard), de mase moleculare cunoscute, la alegerea cruia trebuie s se in seama de domeniul de separare al coloanei. Se reprezint grafic distribuia da mas molecular n coordonate Abs (prob) funcie de lg. Se realizeaz calculul masei moleculare medii Mw sau Mn se poate, prin integrarerea curbei de distribuie i nsumarea valorilor fiMwi. 4

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C. n cazul sistemului de CPG se utilizeaz standarde (etaloane) de polistiren-sulfonat de sodiu cu mase cuprinse n intervalul 1000- 100000 Da. Valorile Mw, Mp i Mw/Mn sunt prezentate n tabelul 1.
PSS3_B Base1_basey
5.93867
0.15

0.20

5.12667 6.87267

Absorbata

0.10

4.312
0.05

0.00 3 4 5 6 7 8 9

Volum de elutie, mL

Tabel 2 Valorile obinute pentru standardul utilizat pentru calibrare Mp Mw Mn IPD Lg Mp Lg MW Lg Mn Ve (mL) te

UNIVERSITATEA TEHNIC GHEORGHE ASACHI IAI Facultatea Inginerie chimic i protecia mediului Domeniul de licen: Inginerie Chimic Programul de studii universitare de masterat METODE DE CARACTERIZARE SI TESTARE II Aplicaiii practice 2012-2013, .L. PUITEL A.C.