Sunteți pe pagina 1din 2

2.

Dozarea activitii peroxidazelor Activitatea peroxidazei s-a determinat n rdciniele i frunzele plantulelor de gru, att de la lotul martor, ct i n cele tratate cu NaCl, AS, sau cu ambele soluii. Extractul enzimatic a fost realizat din material vegetal proaspt (1g) recoltat, dup 21 de zile de la montarea experimentului. Mojararea sa realizat cu nisip de cuar bine splat i sterilizat n etuv la 120C adugnd 4 ml tampon fosfat n concentraie de 6,7x 10 M, pH=7, diluat 1:9 cu ap distilat rcit la 4C i 40 mg polivinil-pirolidon (pentru nlturarea eventualilor inhibitori ai activitii peroxidazice). Extractul s-a centrifugat la 15000xg, timp de 20 de minute la 4C. Supernatantul separat a fost pstrat 2 ore la frigder pentru exprimarea i stabilizarea activitii enzimatice. Au fost efectuate cte 3 repetiii, att pentru martor, ct i pentru variantele experimentale luate n studiu. Activitatea peroxidazic s-a determinat folosind un spectrofotometru Shimadzu UV-mini1240, la o temperatur de 30C, urmrind formarea tetraguaiacolului, la o lungime de und de 470 nm, =26.6mM-1cm-1, n 3 ml amestec de reacie coninnd 1 ml tampon fosfat 0,1M pH=6,0; 1 ml guaiacol 15mM, 1 ml H2O2 3mM, i 50l extract enzimatic. O unitate peroxidazic (U) reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz oxidarea a 1mol de guaiacol intr-un minut, conform metodei citate de Kim i Yoo, 1996. Se citeste absorbanta imediat la momentul t=0 (A0) si dupa 1 minut (A1)

(A/min x Vt) / ( x Vs) Unde : A/min = A1 A0 Vt = vol final de reactie = 3,05 ml Vs = vol probei = 0,05

3.Determinarea coninutului de prolin

Prolina, aminoacid cu rol protector, sintetizat n cazul n care plantele sunt supuse unui factor de stres se va determina cu ajutorul metodei Bates i colab (1973). 0,5g de material vegetal s-a omogenizat cu 10 ml soluie apoas 3% de acid sulfosalicilic s-a filtrat, iar filtratul a fost tratat cu 2 ml ninhidrin acid i 2 ml acid acetic glacial ntr-o eprubet la 100C, timp de o or, dup care s-a rcit n baie de ghea. Amestecul de reacie a fost extras cu 4 ml de toluen prin agitare energic timp de 15-20 de secunde. A fost separat supernatantul cromoforic coninnd toluen i s-a citit absorbana la o lungime de und de 520 nm, folosind toluen ca martor.

Concentraia prolinei a fost stabilit folosind o curb etalon iar rezultatul s-a raportat la substana proaspt, conform urmtoarei relaii.

*g prolina/ml x ml toluen / 115.5 g/ mol+/ *g proba/5+ = moli prolina/g mat.vegetal proaspt.