Sunteți pe pagina 1din 7

PRACTICA FARMACEUTIC

Calitatea extractelor gemoterapice prin prisma metodelor analitice


THE QUALITY OF GEMMOTHERAPIC EXTRACTS THROUGH ANALYTICAL METHODS
Conf. Dr. Olah Neli-Kinga1,2, Dr. chimist Ramona Cmpean1, Kurucz Rka1 1 SC PlantExtrakt SRL, jud. Cluj 2 Facultatea de Medicin, Farmacie i Medicin Dentar, Catedra de Chimie Farmaceutic, Universitatea de Vest Vasile Goldi, Arad

Rezumat
Obiective. Gemoterapia a deschis o nou ramur n toterapie, cea a terapiei cu extracte din esuturi meristematice proaspete, cu un potenial terapeutic care a determinat iniierea mai multor studii n ultimii ani. Cunoaterea compoziiei chimice, meninerea n limitele constanei permise de natur, a extractelor gemoterapice este premisa unor produse eciente i sigure. Asigurarea ecienei i siguranei se poate realiza numai printr-un control riguros al calitii extractelor folosind metode analitice moderne cromatograce i spectrale. Lucrarea prezint studiul comparativ al compoziiei unor extracte gemoterapice din plante aparinnd familiei Ericaceae extractele din mldie de Iarb neagr Calluna vulgaris L., de An Vaccinium myrtillus L. i de Merior Vaccinium vitis-idaea L. Materiale i metode. Extractele gemoterapice s-au obinut conform prevederilor Farmacopeei franceze i europene, din mldie tinere, recoltate din zona Cluj. Polifenolii, avonoidele i arbutozida s-au evaluat prin cromatograe pe strat subire, cromatograe de lichide de nalt performan i spectrofotometrie UV-Vis. Rezultate. Metodele cromatograce au identicat n extracte arbutozida i hiperozida, respectiv cvercetina n extractul din mldiele de Merior i acidul clorogenic n extractul din mldie de Iarb neagr. Concentraie mai mare de avonoide totale i polifenoli totali s-a gsit n extractul din mldie de Iarb neagr, iar arbutozida are concentraie mai mare n extractul din mldie de Merior. Concluzii. S-au observat asemnri i diferene compoziionale. Metodele cromatograce pot realiza net diferenierea dintre specii nrudite cum sunt Anul i Meriorul. Identicarea i determinarea cantitativ a compuilor activi din aceste extracte pot da explicaii asupra efectelor terapeutice ale acestora, observate clinic. Prin aceste studii se poate propune o metod de vericare a calitii acestor extracte pentru asigurarea ecienei i siguranei. Cuvinte cheie: gemoterapie, extracte din esuturi meristematice, controlul calitii, cromatograe, spectrofotometrie UV-Vis

Abstract
Objectives. The gemmotherapy opened a new phytotherapy branch, those that use fresh, meristematic tissues extracts, having such a therapeutic power that determined the beginning of more studies in this eld. The
Adresa de coresponden: Conf. Dr. Olah Neli-Kinga, Facultatea de Medicin, Farmacie i Medicin Dentar, Str. L. Rebreanu Nr. 86, Arad e-mail: olahdr@aol.com

30

Vol. 6, Nr. 1, An 2013

PRACTICA FARMACEUTIC

knowledge regarding the chemical composition of the gemmotherapic extracts, its constant maintenance in the nature allowed limits, is the premise of the ecient and safe products. The ecacy and safety can be assured just by a rigorous quality control of these extracts using modern chromatographic and spectral methods. This work present a comparative study of the chemical composition of some gemmotherapic extracts obtained from plants belonging to Ericaceae family the young shoots extracts of Common heather - Calluna vulgaris L., Bilberry Vaccinium myrtillus L. and Cowberry Vaccinium vitis-idaea L. Materials and methods. The gemmotherapic extracts were obtained according to French and European Pharmacopoeia from young shoots, harvested near Cluj. The polyphenols, avonoids and arbutoside were evaluated by thin-layer chromatography (TLC), liquid chromatography (HPLC) and UV-Vis spectrophotometry. Results. By the used chromatographic methods were identied in all extracts the arbutoside and the hyperoside, the quercetine was identied in the Cowberry young shoots extract and the chlorogenic acid in Common heather young shoots extract. The higher concentration of total avonoids and polyphenols was determined in the Common heather young shoots extract. The arbutoside concentration was the highest in the Cowberry young shoots extract. Conclusions. There were observed compositional similarities and dierences. By chromatographic methods it was made a dierence between very similar species, like the Bilberry and Cowberry. The identication and quantitative determination of the active compounds from these extracts can explain the therapeutic eects of them, clinically already observed. Using the mentioned methods could be proposed a quality control method of these extracts to assure them eciency and safety. Key words: gemmotherapy, meristematic tissues extracts, quality control, chromatography, UV-Vis spectrophotometry

INTRODUCERE
Gemoterapia este o ramur mai nou a toterapiei, numit de muli chiar noua toterapie, dezvoltat ncepnd din prima jumtate a secolului XX i fundamentat n anii 60. Gemoterapia se bazeaz pe efectul stimulator i reglator pe care celulele stem vegetale sau celulele meristematice l pot avea asupra organismului uman. Celulele meristematice sunt celule vegetale nedifereniate, cu potenial mare de diviziune i care prin procesul de difereniere vor putea deveni diferite tipuri de celule cu funcii specice pentru plante (1-4). Astfel, nc din anii 60 a aprut n Farmacopeea Francez ntre monograile de preparare a suelor homeopatice, metoda de preparare a maceratelor glicerinice din esuturi meristematice proaspete (5). Aceste macerate glicerinice sunt extractele gemoterapice pe care se bazeaz azi toat experiena clinic n domeniul gemoterapiei. Extractele gemoterapice sunt prin urmare extracte n alcool etilic, glicerin i ap ale unor esuturi de plante tinere, proaspete, care se gsesc n muguri, mldie, radicele, semine etc. Prin modul lor de preparare ele plaseaz gemoterapia la grania dintre toterapie i homeopatie.

Compoziia chimic a mugurilor, mldielor i altor esuturi aate n curs de difereniere nu sunt bine cunoscute, ele coninnd att precursori ai compuilor de acumulare, ct i compui de acumulare deja formai. Compoziia chimic este unul dintre factorii care determin efectul terapeutic i, ca urmare, calitatea, eciena i sigurana acestor extracte. Ca urmare, studiul acestora i identicarea compuilor de baz au o importan deosebit pentru stabilirea unor metode de control al calitii. Farmacopeele moderne, printre care i Farmacopeea European, prevd pentru plante i extracte din plante o serie de metode analitice care pot folosite pentru vericarea calitii acestora. Dintre acestea, metodele cromatograce sunt importante deoarece sunt capabile de a separa i identica componentele unor amestecuri att de complexe cum sunt plantele i extractele acestora (6). Dintre metodele cromatograce, cromatograa pe strat subire este tehnica folosit pentru identicarea speciilor de plante, oferind o amprent specic ecrei specii datorit compoziiei lor chimice unice. Alte metode cromatograce cum sunt cromatograa de lichide sau de gaze sunt folosite pentru identicarea i determinarea cantitativ a unor compui individuali din
Vol. 6, Nr. 1, An 2013

31

PRACTICA FARMACEUTIC
plante. Metodele spectrale, n special spectrofotometria UV-Vis, este folosit pentru determinri de clase de compui activi din plante sau pentru evaluarea efectului antioxidant (6,7). Avnd n vedere necesitatea de a cunoate compoziia chimic a extractelor gemoterapice i de a dezvolta metode de control al calitii care s asigure o compoziie i concentraie constant a compuilor activi din aceste extracte, pentru o ecien terapeutic constant, am ales s studiem extractele gemoterapice obinute din plante aparinnd familiei Ericaceae. Extractele din mldiele de Iarb neagr Calluna vulgaris L., de An Vaccinium myrtillus L. i de Merior Vaccinium vitis-idaea L. au fost studiate prin metode cromatograce i spectrale. S-a urmrit coninutul de avonoide, polifenoli i de arbutozid, compus caracteristic familiei Ericaceae, observnd asemnri i deosebiri ntre plante, care, macroscopic, pot avea caracteristici morfologice similare. Condiiile analizei cromatograce de lichide (HPLC) Analiza cromatograc de lichide de nalt performan s-a realizat cu un aparat HPLC Varian ProStar prevzut cu pomp teriar i detector spectrofotometric cu arie de diode. Separarea s-a realizat pe coloan Phenomenex C-18, 150 x 4,6 mm, 5 m, prevzut cu o precoloan de aceeai tip, de 5 mm lungime. Faza mobil izocratic a fost format din 90% metanol i 10% ap puricat i s-a introdus n coloan cu un debit de 1 ml/minut. S-au injectat cte 10 l din soluii metanolice 10% obinute din cele 3 extracte gemoterapice, respectiv din soluii standard de arbutozid de 0,1; 0,2; 0,3 respectiv 0,4 mg/ml. Detecia spectrofotometric s-a realizat la 280 nm. Pe baza ariilor determinate la soluiile standard de arbutozid s-a construit o curb de calibrare pentru evaluarea coninutului de arbutozid n cele 3 extracte gemoterapice. Condiiile analizelor spectrofotometrice UV-Vis Determinarea avonoidelor totale Determinarea s-a realizat adaptnd metoda din Farmacopeea Romn (10). Cte 2 ml din extractele gemoterapice s-au amestecat cu 3 ml clorur de aluminiu 2,5% i 5 ml acetat de sodiu 10% i totul s-a adus la 25 ml cu metanol. Dup 30 de minute s-au citit absorbanele la un aparat GBC-Cintra 101, Australia, la 430 nm. Ca i soluie de comparaie s-a folosit un amestec format din 2 ml extract gemoterapic adus la 25 ml cu metanol. Ca i standard s-a folosit o soluie de rutozid de 0,1 mg/ml din care s-au luat cte 1, 2, 3 respectiv 4 ml i s-au amestecat cu 3 ml clorur de aluminiu 2,5% i 5 ml acetat de sodiu 10% i apoi toate soluiile s-au adus la 25 ml cu metanol. Dup 30 de minute s-au citit absorbanele la un aparat GBC-Cintra 101, Australia, la 430 nm. Ca i soluie de comparaie s-a folosit un amestec format din 8 ml ap adus la 25 ml cu metanol. Pe baza absorbanelor citite pentru soluiile standard s-a construit o curb de calibrare pentru determinarea concentraiei de avonoide totale exprimate n rutozid n extractele gemoterapice studiate. Determinarea polifenolilor totali Determinarea s-a realizat adaptnd metoda din Farmacopeea Romn (11). Cte 10 ml de extracte gemoterapice s-au amestecat cu 0,5 ml reactiv fosfowolframic i totul s-a adus la 25 ml cu soluie de carbonat de sodiu 15%. Dup 2 minute s-au citit absorbanele la un aparat GBC-Cintra 101, Australia, la 715 nm. Ca i soluie de comparaie s-a folosit un amestec format din 10 ml extract

MATERIALE I METODE
Prepararea extractelor Mldiele de Iarb neagr, An i Merior s-au recoltat n perioada mai-iunie, din zone nepoluate, aate la cel puin 3 km deprtare de orice zon intens circulat, din judeul Cluj. Prelucrarea plantei proaspete s-a realizat n maximum 6 ore de la recoltare, dup o vericare amnunit sub aspect botanic (macroscopic). Extractele gemoterapice s-au preparat conform metodei din Farmacopeea Francez, respectiv European (5,6), folosind ca i solvent ap puricat, alcool etilic 96% vol. i glicerin vegetal 100%, toate de calitate farmaceutic. Extracia s-a realizat la rece, prin macerare. Toate extractele au fost obinute la SC PlantExtrakt SRL. Condiiile analizei cromatograce pe strat subire Analiza cromatograc pe strat subire s-a realizat pe plac de silicagel, avnd ncorporat indicator de uorescen la 254 nm, provenit de la rma Merck, Germania. Extractele s-au supus extraciei pe faza solid, pe coloane silicagel-C18, nainte de a aplicate pe plac (8). Ca i etaloane s-au folosit soluii metanolice de 1 mg/ml de acid clorogenic, hiperozid i cvercetin. Pe plac s-au aplicat cte 40 l din extractele gemoterapice prelucrate i cte 10 l din etaloane. Eluarea s-a realizat cu un amestec de acetat de etil metanol ap puricat (64:20:16, v/v). Dup eluare placa s-a uscat n aer, apoi s-a pulverizat cu reactiv Neu-PEG i s-a vizualizat n uorescen la 365 nm (7,9).

32

Vol. 6, Nr. 1, An 2013

PRACTICA FARMACEUTIC
gemoterapic adus la 25 ml cu soluie de carbonat de sodiu 15%. Ca standard s-a folosit o soluie de acid cafeic de 1 mg/ ml din care s-au luat cte 0,01; 0,5 respectiv 1 ml i s-au amestecat cu 0,5 ml reactiv fosfowolframic i apoi toate soluiile s-au adus la 25 ml cu soluie de carbonat de sodiu 15%. Dup 2 minute s-au citit absorbanele la un aparat GBC-Cintra 101, Australia, la 715 nm. Ca i soluie de comparaie s-a folosit un amestec format din 1,5 ml ap adus la 25 ml cu soluie de carbonat de sodiu 15%. Pe baza absorbanelor citite pentru soluiile standard s-a construit o curb de calibrare pentru determinarea concentraiei de polifenoli totali exprimai n acid cafeic n extractele gemoterapice studiate. n Fig. 2 sunt prezentate cromatogramele HPLC obinute pentru extractele gemoterapice i al arbutozidei standard, iar n Tabelul 1 sunt prezentate maximele de absorbie din spectrul UV-Vis al arbutozidei standard, respectiv ale arbutozidelor separate din extractele gemoterapice. Timpul de retenie al arbutozidei este de 1,9 min att la standard, ct i n cazul compuilor separai din extractele gemoterapice.
TABELUL 1. Maximele de absorbie ale arbutozidei i al arbutozidelor separate din cele 3 extracte gemoterapice Arbutozida Standard Din extract din mldie de Iarb neagr Calluna vulgaris Din extract din mldie de An Vaccinium myrtillus Din extract din mldie de Merior Vaccinium vitis ideae Maxim de absorbie, nm 285,76 289,44 289,23 284,43

REZULTATE
n Fig. 1 se observ cromatograma pe strat subire obinut pentru cele 3 extracte gemoterapice studiate.

n Fig. 3 se observ curbele de calibrare pentru rutozid, respectiv acid cafeic obinute prin metodele spectrofotometrice menionate i pentru arbutozida obinut prin HPLC. n Tabelul 2 sunt prezentate ecuaiile curbelor i coecienii de corelaie.
TABELUL 2. Ecuaiile curbelor de calibrare i coecienii lor de corelaie Ecuaia pentru Ecuaia Rutozid Acid cafeic Arbutozid FIGURA 1. Cromatograma extractelor gemoterapice de Ericaceae n uorescen Abs = 31,185 x C + 0,0017 Abs = 13,967 x C + 0,1637 Aria = 4x107 x C + 450779 Coecientul de corelaie 0,9999 0,9984 0,9990

FIGURA 2. Cromatogramele HPLC ale arbutozidei standard i ale arbutozidelor separate din extractele gemoterapice

Vol. 6, Nr. 1, An 2013

33

PRACTICA FARMACEUTIC
TABELUL 3. Coninutul de avonoide totale exprimate n rutozid, de polifenoli totali exprimai n acid cafeic i de arbutozid a celor 3 extracte gemoterapice
Extractul Coninut de Coninut de Coninut de gemoterapic avonoide totale polifenoli totali arbutozid, din mldie exprimate n exprimate n acid mg/ml de rutozid, mg/ml cafeic, mg/ml Iarb neagr 0,102 0,131 0,430 Calluna vulgaris 0,071 0,072 1,030 An Vaccinium myrtillus Merior 0,074 0,075 1,330 Vaccinium vitis-idaea

n A ac V cin iu m llu na

avonoide totale exprimate n rutozid, mg/ml polifenolitotali exprimate n acid cafeic, mg/ml arbutozid, mg/ml

FIGURA 4. Coninutul de avonoide totale exprimate n rutozid, de polifenoli totali exprimai n acid cafeic i de arbutozid a celor 3 extracte gemoterapice

r ag ne b ris Iar lga vu Ca

r io er M aea id c Va cin iu yr m til lu s m viti s-

DISCU II
Analiza cromatograc pe strat subire indic clar diferenele ntre cele 3 specii, ecare avnd o amprent cromatograc specic cu o gam de compui specici, chiar dac fac parte din aceeai familie. Se observ ns i o serie de asemnri, compui care sunt prezeni n toate cele 3 specii, acetia ind compuii specici familiei. S-a putut identica hiperozida n toate cele 3 extracte gemoterapice, cvercetina doar n extractul din mldie de Merior, iar acidul clorogenic mai ales n extractul din mldie de Iarb neagr. Se observ diferene de intensitate a benzilor separate care indic concentraii diferite ale componentelor n diferitele extracte gemoterapice studiate. Astfel, se poate observa o band corespunztoare hiperozidei

FIGURA 3. Curbele de calibare n rutozid, acid cafeic i arbutozid

n Tabelul 3 i Figura 4 sunt prezentate rezultatele determinrilor spectrofotometrice pentru cele 3 extracte gemoterapice n ceea ce privete coninutul lor n avonoide totale exprimate n rutozid, polifenoli totali exprimai n acid cafeic i arbutozid.

34

Vol. 6, Nr. 1, An 2013

PRACTICA FARMACEUTIC
mai intens n extractele din mldiele de An, respectiv Merior. Prezena arbutozidei, identicat i determinat cantitativ prin cromatograe de lichide pe coloan n toate cele 3 extracte gemoterapeutice, ind compus specic familiei de plante, poate explica indicaia acestor extracte gemoterapice, pe baza experienei clinice, n infecii urinare de tipul cistitelor, colibacilozelor etc. Picul mai nalt, indicnd o concentraie mai mare, corespunztoare arbutozidei n extractul din mldie de Merior, poate explica indicaia preponderent n sfera aparatului urinar i digestiv, mai ales n colibaciloze, a acestui extract. Dozarea de avonoide totale i polifenoli totali a relevat o concentraie mai mare a acestora n Extractul din mldie de Iarb neagr, dar toate cele 3 extracte gemoterapice studiate au o concentraie semnicativ de avonoide i polifenoli. Aceste date sunt n concordan i cu rezultatele cromatograei pe strat subire, unde benzile galben-portocalii sau galbenverzui indic avonoidele, iar cele albastre sau verzuialbastre derivaii de acid cafeic. Concentraia mare de polifenoli i avonoide poate s e corelat cu o activitate antioxidant semnicativ care poate contribui la efectele benece ale acestor extracte gemoterapice, observate clinic. n cazul Extractului gemoterapic din mldie de An Vaccinium myrtillus concentraia semnicativ de polifenoli poate explica efectul benec asupra ochilor, inclusiv n caz de complicaii retiniene din diabetul zaharat, deoarece prin coninutul ridicat de polifenoli poate reduce stresul oxidativ de la nivelul ochilor. Concentraia semnicativ de avonoide din Extractul din mldie de Iarb neagr Calluna vulgaris poate explica efectul diuretic al acestuia, constatat clinic, cunoscut ind c avonoidele contribuie la diurez. Raportul de concentraie polifenoli, avonoide i arbutozid n extractul din mldie de Iarb neagr poate explica i indicaia preponderent a acestui extract ca diuretic, de eliminare a unor tipuri specice de calculi renali i mai puin n infecii urinare. Ca urmare, metodele analitice folosite cromatograa pe strat subire, HPLC i spectrofotometria UV-Vis pot propuse ca metode de control al calitii acestor extracte gemoterapice, determinnd identitatea speciei, identicnd potenialii compui activi i determinnd cantitativ clase de compui sau compuii importani. Folosind aceste teste ca metode de control al calitii se va putea verica constana, n limitele permise de natur, a compuilor importani din punct de vedere terapeutic i se va putea asigura eciena constant a extractelor gemoterapeutice. Folosind metode analitice de controlul calitii se garanteaz calitatea, eciena i sigurana constant a extractelor gemoterapice PlantExtrakt, folosirea speciei corespunztoare i obinerea de extracte cu gama de compui activi corespunztori, att sub aspect calitativ, ct i cantitativ.

CONCLUZII
Lucrarea a evideniat similaritile i diferenele compoziionale existente ntre 3 extracte gemoterapice obinute din plante aparinnd aceleiai familii, Ericaceae. S-au putut identica prin cromatograe compuii specici familiei, prezeni n toate cele 3 extracte, arbutozida, dar i compuii specici crei specii, mai ales din clasa polifenolilor. S-a observat, pe baza mrimii picului corespunztor arbutozidei, c cel mai mare coninut se gsete n extractul din mldie de Merior Vaccinium vitis-idaea. S-au determinat cantitativ avonoidele totale, polifenolii totali i arbutozida, observndu-se c extractul din mldie de Iarb neagr conine o concentraie mai mare de polifenoli i avonoide (0,131 mg/ml, respectiv 0,102 mg/ml), iar extractele de An i Merior conin mai mult arbutozid (1,03, respectiv 1,33 mg/ml). Pe baza acestor date se pot explica o serie de indicaii terapeutice sau efecte benece ale acestor extracte gemoterapice, observate clinic. Astfel s-a putut explica folosirea preponderent n sfera urinar a Extractului din mldie de Iarb neagr Calluna vulgaris, care are un coninut mai mare de avonoide cu posibil efect diuretic. Pe baza concentraiei semnicative de polifenoli i avonoide cu rol antioxidant se poate explica efectul benec asupra ochilor al Extractului din mldie de An Vaccinium myrtillus. Prezena arbutozidei n toate cele 3 extracte gemoterapice explic indicaia lor n infecii urinare cistite i colibaciloze, mai ales al Extractului din mldie de Merior, care prezint concentraia cea mai mare de arbutozid. Lucrarea demonstreaz importana controlului calitii extractelor gemoterapice folosind metode analitice moderne, cromatograce i spectrale, metode ce satisfac cerinele pentru a folosite n acest sens. Controlul riguros al calitii acestor extracte gemoterapice asigur eciena i sigurana constant a acestora.

Vol. 6, Nr. 1, An 2013

35

PRACTICA FARMACEUTIC BIBLIOGRAFIE


1. Piter F. Compendiu de gemoterapie clinic (Meristemoterapia) cu index clinic, Ediia a III-a, Traducere din limba italian dr. Sorina Soescu, Constana: Fundaia Cretin de Homeopatie Simile, 2003. 2. Tetau M. Gemotherapy A clinical guide, St. Bruno, Quebec: Ed. Du Detail Inc, 1998. 3. Rozencwajg J. Dynamic Gemmotherapy Integrative Embryonic Phytotherapy, Second Edition, Natura Medica Ltd., 2008. 4. Halfton R. Gemmotherapy The Science of Healing with Plant Stem Cells, Rochester, Vermont, Toronto, Canada: Healing Arts Press, 2010. 5. *** Pharmacopee Franaise, ed. VIII, Paris: Gouvernement Franais, 1965. 6. *** European Pharmacopoeia, Monograa 2371: Metode de preparare a suelor homeopatice i potenarea, Ed. 7, Brussel: Council of Europe - EDQM, 2012. 7. *** Homepathisches Arzneibuch, Stuttgart, Eschborn: Deutscher Apotheker Verlag, 2012. 8. Cobzac S., Cmpan G., Olah N., Gocan S. The quantitative determination of rutin in different glycerinic plant extracts by solid-phase extraction and thin layer chromatography with densiometry. Journal of Planar Chromatography Modern TLC, 1999; 12: 26-30. 9. *** European Pharmacopoeia, Monograa 2029: Tincturi mam pentru preparate homeopatice, Ed. 7, Brussel: Council of Europe - EDQM, 2012. 10. *** Farmacopeea Romn, Ed. X, Bucureti: Ed. Medical, 1993. 11. *** Farmacopeea Romn, Ed. IX, Bucureti: Ed. Medical, 1976.

36

Vol. 6, Nr. 1, An 2013