ANEXO 1 Conteo en cmara de Neubauer. Esta cmara se utiliza para conteo celular.

Li mpie la cmara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminill a de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cua rzo sobre la cmara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cmara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribucin de las clulas . Es recomendable llenarla con micropipeta pequea o con una jeringa ya que la cmar a se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. La cmar a no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de ll enado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cmara es de lquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: Lleve la cmara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observar lo si guiente. 122

 Si las clulas que va a contar son pequeas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizar de la siguiente manera: En esta cuadricula se visualizan 25 presentes en 5 campos, generalmente central, lo que garantiza un conteo l ocular de 40X, donde se visualiza ro del microscopio se desplaza la 123 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas se cuentan los cuadros de las esquinas y el aleatorio. Para realizar el conteo se pasa a cada uno de los campos y con ayuda de el car

cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cma ra de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la s iguiente manera: Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realiza r el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las clulas dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres lne as que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya qu e definen cuales clulas son contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que no tocan la segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de el la no se incluyen. Grficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las clulas que tiene una X son las que no se deben contar. 124

 Despus de contar las clulas se procede a calcular la el numero de clulas por unidad de volumen. Para esto se utiliza el rea de cada cuadro, el espacio ocupado por e l lquido en el que estn las clulas que es el mismo espacio que hay entre la cuadric ula de la cmara y la laminilla de cuarzo. Se promedia el nmero de esporas de la cmara de arriba con la de abajo, se multipli ca por el factor de dilucin y por un factor F igual a106 si se cont el cuadro cent ral o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor X. Si 1ml del preinoculo ? ____________ X esporas ____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas) Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul. 125

ANEXO 2 Mtodo del cido Dinitrosaliclico (DNS) Pasos para preparar DNS: Disolver g de NaOH en H2O destilada. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos mbar a 4 C

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 C. A partir de l a solucin de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrn con la s iguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4. Procedimiento: Tomar 0. L de cada dilucin y agregar 0.5 mL de reactivo DNS. Preparar una muestra blanco p or dilucin de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. Colocar a ebullir las muestras en bao mara por 5 minutos. Enfriar co n hielo. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Agitar y dejar en reposo 15 min. Leer a 540 nm. 126

 Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. Debe tener un coeficiente de c orrelacin de 0.991 a 0.999. 0.5ml muestra problema + 0.5 ml DNS Ebullicin de muestra 5min Enfriar con hielo 0.5ml agua destilada Agitar y reposar 15min Leer Absorbancia l= 540nm Figura 14. Mtodo de DNS 127

ANEXO 3 Mtodo de Lowry Para obtener la curva estndar de Albmina se preparan 5 soluc iones patrones de Albmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones : 15.2, 80, 200, 300 y 400 g/mL. Si la concentracin de Protena es menor de 500 g/mL se lee la absorbancia a 750 nm, si est entre 1000 y 2000 g/mL se lee a 550 nm. Se prepara un blanco que no lleva Albmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL de s olucin salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a las de ms muestras. Procedimiento: Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones pa trn de albmina, las muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marc ados para conservar el orden de concentraciones para la curva. Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al bao Mara precalentado a 100C por un tiempo de 10 minutos. Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente. Agregar a cad a tubo 5 mL de la solucin complejante, mezclar y dejar reposar por 10 minutos. Ad icionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20 segundo s. Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos. Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrn construir la grfica Absorb ancia vs. Concentracin de albmina srica de bovina (BSA); con esta se puede determin ar la concentracin de las muestras problema interpolando el valor 128

de absorbancia. La curva estndar debe tener un coeficiente de correlacin (r) de 0. 991 a 0.999. Preparar tubos 1, 2, 3, 4,5 y blanco 0.5ml de NaOH 2N Adicionar Calentar 100C 10min. Enfriar a Tem. Ambiente 0.5ml de solucin l j t Mezclar y agitar 0.5ml de Reactivo Reposar 10 min. Mezclar en vrtex 20 Leer absorbancia Graficar Absorbancia Vs. Figura 15. Mtodo de Lowry 129

ANEXO 4 Tablas ANOVA Este es el anlisis estadstico de las tablas ANOVA para el cre cimiento microbiano de microorganismos, variando el pH de extraccin del Higo y la concentracin de nutrientes. Tabla 35. Anlisis de varianza efecto de pH de extracc in sobre el crecimiento de A. niger. ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico varia ciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 124,6 84607 3 41,5615357 2,06354694 0,12229449 2,86626545 Dentro de los grupos 725,069 663 36 20,140824 Total 849,75427 39 Tabla 36. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin de sustrato en el crec imiento de A. niger. ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico varia ciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 1255, 85077 3 418,616924 12,9680654 3,344E-06 2,81646351 Dentro de los grupos 1420,346 37 44 32,2805993 Total 2676,19714 47 130

Tabla 37. Anlisis de varianza de la incidencia del pH de extraccin en el comportam iento del Trichoderma harzianum ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico varia ciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 108,9 35449 3 36,3118164 4,02126552 0,01446703 2,86626545 Dentro de los grupos 325,078 109 36 9,02994747 Total 434,013558 39 Tabla 38. Anlisis de varianza de la incidencia de la concentracin en el crecimient o del Trichoderma harzianum ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crtico F Pro babilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 971,1 63585 3 323,721195 12,0302319 7,0164E-06 2,81646351 Dentro de los grupos 1183,99 485 44 26,9089738 Total 2155,15843 47 Tabla 39. Anlisis de varianza del efecto del pH de extraccin sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. ANLISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados de Promedio de las variaciones cuadr ados libertad los cuadrados Entre grupos 0,40189872 3 0,13396624 Dentro de los g rupos 18,7962027 32 0,58738133 Total 19,1981014 35 F Probabilidad Valor crtico para F 0,22807371 0,87615582 2,90111757 131

Tabla 40. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin recimiento de Saccharomyces cerevisiae. ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio ciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F 47125 3 0,29749042 0,99085408 0,40807414 2,86626545 Dentro de 088 36 0,30023635 Total 11,70098 39

de sustrato sobre el c de Valor crtico varia Entre grupos 0,892 los grupos 10,8085

Tabla 41. Anlisis de varianza del efecto del pH de extraccin sobre el crecimiento de Rhodotorula. ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadr ados libertad los cuadrados Entre grupos 0,17674497 3 0,05891499 Dentro de los g rupos 12,7860256 32 0,3995633 Total 12,9627706 35 Valor crtico F Probabilidad para F 0,14744845 0,93056632 2,90111757 Tabla 42. Anlisis de varianza del efecto de la concentracin recimiento de Rhodotorula. ANLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio babilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F 85737 3 1,29361912 4,16272894 0,01248242 2,86626545 Dentro de 42 36 0,31076228 Total 15,0682993 39 132 de sustrato sobre el c de Valor crtico F Pro Entre grupos 3,880 los grupos 11,1874

ANEXO 5 Constante K con el programa Polymath Se utiliz el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K Aspergillus niger variacin del pH de ex traccin Aspergillus niger a pH de extraccin 2 BiomasapH2 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.33 3 133

 Aspergillus niger a pH de extraccin 7 BiomasapH7 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.35 56933 Aspergillus niger a pH de extraccin 12 BiomasapH12 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/18.334)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.2 194934 134

 Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.574)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.1340424 Trichoderma harzianum variacin del pH de extraccin Trichoderma harzianu m a pH de extraccin 2 BiomasapH2 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.45)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.12 03965 135

 Trichoderma harzianum a pH de extraccin 7 BiomsapH7 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.2 273364 Trichoderma harzianum a pH de extraccin 12 BiomasapH12 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.154)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2 .6580878 136

 Trichoderma harzianum medio de Control BiomasaControl = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.648)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.97329 A. Niger variacin de la concentracin de azcares reductores Aspergillus nig er a concentracin de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.9509181 137

 Aspergillus niger a concentracin de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4580631 Aspergillus niger a concentracin de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/28.522)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4753353 138

 Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.4)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.6402406 T. harzianum variacin de la concentracin de azcares reductores Trichoder ma harzianum a concentracin de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.8190618 139

 Trichoderma harzianum a concentracin de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/11.412)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 1.1414981 Trichoderma harzianum a concentracin de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/29.016)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.6289445 140

 Trichoderma harzianum medio de Control Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/10.634)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.4885395 141