Sunteți pe pagina 1din 17

Tema I.

ASPECTE PRACTICE GENERALE PRIVIND REALIZAREA CULTURILOR DE CELULE I ESUTURI ANIMALE Cultura de celule este o metoda de biologie celulara pe larg utilizat pentru cercetarile biomedicale fundamentale (biochimie, biologie celular i molecular, genetic) i aplicative (biotehnologie, inginerie tisular, inginerie genetic etc). LABORATORUL DE CULTURI CELULARE Laboratorul de culturi celulare se compune din mai multe spatii de lucru si anexe, legate intre ele intr-un circuit functional, care sa asigure pe de o parte protectia personalului, iar pe de alta parte conditiile sterile de lucru, de care depinde reusita procedurilor de lucru. Camera pentru preparare a mediilor si sterilizare, vestiarul, camera-filtru si boxele sterile sunt principalele incaperi, care alcatuiesc circuitul unui laborator de culturi celulare. n afara de acestea, un spatiu separat este prevazut pentru stocarea probelor biologice la rece, sau camera de criostocare. In camera de preparare a medii !r si sterilizare sunt amplasate aparatle necesare pentru obtinerea unui mediu de cultura (aparatul pentru obtinerea de apa distilata sau ultrapura, balanta analitica, plita magnetica, p!-metru, etuva, autoclav, frigider etc) Ve"#iar$ este dotat cu dulapuri si spatii de depozitare a hainelor de exterior si materiale pentru igiena personala (chiuveta cu apa curenta, sapun, prosoape de hartie). In camera%&i #r$ se gasesc echipamentele vestimentare pentru operatorii culturilor de celule (halate, manusi, capeline, masti, papuci de laborator), dezinfectante pentru maini si alte materiale de lucru, care necesita depozitarea intr-un spatiu curat, cu decontaminare periodica. Camera "#eri ' este dotat cu sisteme eficiente de sterilizare (aparat pentru filtraea sterila a aerului, lampa cu radia"ie #$, echipamente sterile pentru personal). n camera sterila se lucreaza cu materialul biologic (celule si tesuturi), utilizand aparatura specifica pentru obtinerea suspensiilor celulare, pentru incubarea celulelor si monitorizarea acestora. %stfel, in camera sterila (boxa sterila de lucru) sunt amplasate urmatoarele aparate& Hota cu flux de aer laminar vertical - o incinta de lucru cu deschidere frontal. %re montate in plafon filtre !'(% cu o dimensiune a porilor de ),** +m, care nu permit trecerea microorganismelor. %stfel, filtrele !'(% au rolul de a steriliza aerul care intra in contact cu celulele, lichidele si celelalte materialele sterile in lucru.

Incubatorul in care celuele sunt men"inute la o temperatur de -. /C, o concentratie a bioxidului de carbon (C/*) din aer de 0-1 2 si 31-3.2 umiditate. %tmosfera hipoxica (imbogatita cu C/*) este un factor stimulator al cresterii celulare pe de o parte si un factor de mentinere a echilibrului acido-bazic in mediile de cultura formulate pe baza de 4a!C/ -, pe de alta parte. #miditatea este importanta pentru evitarea cresterii osmolaritatii mediilor de cultura prin evaporarea apei din acestea. Microscopul optic inversat in contrast de faza, cu a5utorul caruia sunt analizate celulele din cultura. Centrifug de laborator cu sistem de racire, necesara pentru procesul de izolare si spalarea a celulelor. In camera de cri!"#!care "$n# pa"#ra#e , la diferite intervale valorice ale temperaturilor 6)oC, celule, fragmente de tesuturi si o serie de suplimente pentru prepararea mediilor de cultura& serului fetal de vi"el, L-glutamatul, factori de crestere si altele. nghetarea la 7*))C - conservarea serului fetal si a factorilor de crestere, a reactivilor si solutiilor care au indicata de producator, pastrarea prin inghetarea la aceasta temperatura nghetarea la 78) oC - criostocarea celulelor si fragmentelor de tesut pentru o perioada scurta de timp (,-* luni) nghetarea la -,31)C 7 in azot lichid (4!*) 7 criostocarea celulelor si fragmentelor de tesut pentru o perioada indelungata de timp 7 ani

Containere de stocare a celulelor in azot lichid

MATERIALE DE LUCRU

9aterialel specifice tehnicii culturilor de celulare sunt& - recipientele pentru creterea celulelor (cutii (etri, flacoane tip Corrner cu suprafata de crestere diferita, plci multicelulare simple i supraeta5ate) - tuburi pentru criostocare, - tuburi pentru centrifugare, - pipete gradate si pipete automate cu varfuri detasabile, - sisteme de filtrare a solutiilor cu pori de ),** +m, - camere de numarat celule, - alte materiale, comune laboratoarelor cu specific de biochimie si biologie moleculara 'ste bine sa fie folosite recipiente de cultura de unica folosinta, presterilizate (din policarbonat, polistiren sau polipropilen) in locul sticlriei clasice, care necesita spalare si sterilizare.

Plasi de cultura simple

Tuburi de centrifuga

Placi de cultura multi-well (multicelulare), sau cu godeuri ( ac!ane de c$ #$ra

Pipete serologice si dispozitiv umplere a acestora Camera de numarat celule (hemocitometru)

de

Pipete automate si varfuri pentru pipete


-

(i #re c$ p!ri de )*+ ,m* a#a"a-i e a "erin.a

automate

MEDII DE CULTUR/ 9ediile de cultur folosite intr-un laborator de culturi celulare sunt de mai multe tipuri si sunt alese in functie de protocolul. n functie de tipul celulelor multiplicate si a obiectivelor urmarite se pot utiliza& - medii de spalare a celulelor (solutii saline tamponate) - medii de cultura pe baza de ser fetal bovin (:;<) - medii de cultura sintetice, cu suplimente nutritive formulate in functie de tipul celulelor din cultura (medii fara :;<) 9ediile de cultura sunt solutii saline fiziologice tamponate, imbogatite cu suplimente organice cu rol nutritiv, energetic, de reglare a metabolismului celular si a diviziunii celulare. (aminoacizi, vitamine, glucoza si altele). 9ediile de cultura pot fi suplimentate cu amestec de antibiotic in raport de ,2 (penicilina, streptomicina si neomicina) si cu indicatorul de p! de tipul rosu-fenol. PROCEDEE DE STERILIZARE =oate materialele si lichidele care intra in contact cu celulele in cultura trebuie sa fie sterile. %legerea metodei de sterilizare a acestora este dictata de stabilitatea lor la temperaturi inalte. :terilizarea cu aer uscat si fierbinte, sterilizarea in abur fierbinte, iradierea, sterilizarea chimica si filtrarea sunt cele 0 posibilitati aplicate in functie de materiialul sterilizat, conform tabelului de mai 5os. METODA CONDITII MATERIALE Aer ,1)oC, , ora 9etal, sticla, (=;' (teflon) &ier-in#e LIMITARI (ot avea loc schimbari de culoare a
>

A-$r &ier-in#e

,*, C, ,0*) min

Lichide stabile& apa, solutiile saline, mediile autoclavabile, materiale plastice cu o stabilitate relativa la temperaturi inalte& siliconii, policarbonatul ((C), n?lonul, polipropilena ((()

materialelor sterilizate %mbala5e permiabile la abur@ #n timp mai mare de incalzire din cauza unui volum mare de apa necesar pentru sursa de abur %lterari chimice si degradari macromoleculare 4ecesita o sursa de generare a electronilor, fiind mai putin accesibila pentru laboratoarele mici 'ste posibil pentru volume mici 4u este accesibil pentru zonele umbrite@ Aezistenta pentru spori

Iradiere0 Aadiatii B

*0CD?

(lasma (fascicol de electroni) 9icrounde

*0CD?

9ateriale plastice de tipul polistirenului ((:), suporturi organice, reactivi si substante sensibile la incalzire 9ateriale plastice de tipul (:, suporturi organice, reactivi si substante sensibile la incalzire

Aadiatiile #$ din spectrul lungimilor scurte S#eri i1are c2imica 'tilen oxid ,h

0 min, intensitate superioara *0> nm, 0),)) E, -) min

%pa, gelurile de tipul agarului

:olutii contaminate, material plastic, aerul din incinta, suprafete de lucru cu suprafata extinsa.

9ateriale plastice terminstabile nstrumentar metalic

.)2 solutie apoasa , ora de de alcool etilic imersie

Fin cauza compusilor toxici reziduali, necesita o ventilare de cateva zile 4u distruge sporii@ 'xista un risc crescut de imflamare daca se asociaza cu flambarea la flacara 4u poate fi folosit pentru solutiile vascoase sau F9:/ (di-metilsulfoxid)

(i #rare ;iltre atasabile la seringa sau unitati de filtrare pentru volum mare de lichid

(ori de ),,),* +m

=oate solutiile apoase, in special cele termosensibile, ce contin proteine

NORME DE SECURITATE SI PROTECTIA MUNCII IN LABORATORUL DE CULTURI CELULARE0 ,) *) -) >) 0) n laborator nu se intra in hainele si incaltamintea de strada. 4u se consuma alimente sau lichide nainte de a intra si la parasirea spatiilor laboratorului de culturi celulare mainile se spala cu sapun lichid cu proprietati dezinfectante :e evita expunerea la radiatiile #$. Lampile #$ sunt pornite dupa terminarea lucrarilor si sunt oprite cu cel putin *)--) min inainte de a intra in laborator (entru colectarea materialelor cu potential risc biologic se utilizeaza sacii si galetile din material plastic de culoare galbena, cu in scriptia < /!%G%AF 7 risc biologic

Tema +. SUBCULTIVAREA ELEMENTAR/ A UNOR CULTURI CELULARE SERIALE I CONTROLUL DE CRETERE A CULTURILOR Ma#eria * "! $3ii 4i medii de c$ #$r'0 ,.(ipete serologice de 0ml si ,) ml@ pipete automate si varfuri pentru pipete automate@ flacone de centrifuga, de ,0 ml@ flacoane de cultura (toate sterile) *. :olutie tripsinaH'F=% ),*02H),)*2 -.(<: steril >.9ediu de cultur 9'9 complet 0.:olu"ie albastru de tripan ),-2 Te2nica de $cr$0

Fup ob"inerea unei mase celulare confluente pe fundul flaconului de cultura de .0 cm , vasul de cultur este scos din incubator si pus in hota cu flux laminar. ,.:e decanteaz mediul de cultur supernatant cu a5utorul unei pipete (asteur, ataat liniei de aspira"ie prin vacuum sau cu o pipeta serologica.
*

*.:e spal de dou ori suprafa"a care con"ine cultura cu (<: adus la I-. )C. :e cltete uor vasul pentru a antrena lichidul de splare in coltul inferior al flaconului, de unde lichidul este inlaturat prin aspirare. -.(este cultura se adaug - ml de amestec tripsin ),*02 i 'F=% ),)*2 adusa la temperatura de I-.)C. :e fac cJteva micri de antrenare a solu"iei pe suprafa"a care con"ine cultura, apoi se decanteaz * ml, lasand , ml din solutia tripsinaH'F=%, peste monostratul celular. >.:e las vasul Kn repaus Kntre -) sec i * min, la incubator, pJn cJnd la o micare uoar a vasului se observ LpJnzaM de celule desprinse de pe suprafa"a de cultur. 0.Cu o pipet gradat se ia o cantitate de 0 ml mediu de cretere complet i se adauga peste suspensia celular desprins (pentru neutralizarea actiunii tripsinei). :e fac cJteva aspira"ii cu o pipet serologica, pentru omogenizarea suspensiei. 1.:e face o numaratoare a celulelor din suspensie si se determina viabilitatea acestora, conform protocolului cu albastru tripan descris mai 5os (controlul de crestere a culturii celulare). ..:e repartizeaz con"inutul vasului de cultur Kn mai multe vase de cultur, Kn care s-a adugat Kn prealabil mediu de cretere. 4umrul de vase pentru subcultur este calculat Kn func"ie de densitatea celulelor din vasul ini"ial de cultur, astfel KncJt Kn fiecare vas s se realizeze o densitate optim, de *)-0)> celule H cm* suprafata de cultura. 8.$asele de cultur sunt acoperite i puse la incubat Kn condi"ii de umiditate, C/ * 02 i I-. C.
)

CONTROLUL DE CRETERE A CULTURII CELULARE Controlul de cretere a culturilor celulare consta in determinarea numrului de celule i a viabilitii celulare. De#erminarea n$m'r$ $i de ce $ e0 Nntr-un tub ,*H,* se pun ),)0 ml de suspensie celular cu ),)0 ml albastru de tripan ),-2. %lbastru de tripan este un colorant vital, care nu poate trece prin membrana intacta a
.

celulelor vii, colorand doar celulele cu membrana celulara degradata (celulele moarte). :e folosesc pipete cu varfuri sterile. :e omogenizeaza bine amestecul. :e pun ,-* picturi din amestecul ob"inut pe o camer de numrat celule (tip 4eubauer). Camera de numarat se monteaza pe masa microscopului. Cu obiectivul ,)x se numara celulele din patratele externe ale camerei, fiecare compus din cate ,1 patrate mai mici (vezi imaginea atasata). :e noteaza separat celulele colorate (moarte) si cele necolorate (vii)

(entru determinarea concentratia celulelorHml, se aplica urmatoarea formula Numar celule/ml = nr celule in cele patrate externe/ x !" """ (entru determinarea numarului total de celule in cultura numarul de celuleHml se inmulteste cu volumul suspensiei obtinute dupa tripsinizare (1 ml in cazul protocolului de mai sus). (entru determinarea viabilitatii celulare aplicam formula&

(e baza datelor obtinute la subcultivarea celulelor se poate construi o curba de crestere a celulelor, dupa modelul prezentat in figura de mai 5os.

Faca noile culturi celulare obtinute prin subcultivare se vor initia de fiecare data cu acelasi numar de celule, atunci, fara a face curba de crestere zilnica, se va putea estimare cu o mare precizie intervalului de timp necesar efectuarii pasa5ului celular. n figura de mai 5os celei, in care este reprezentata curba de crestere celulara, este dat un exemplu de grafic pentru subcultura seriala si semnificatia valorilor inscrise pe acesta.

Tema. 5 OBINEREA CULTURILOR DE CELULE PRIMARE PRIN METODA TRIPSINIZARII LA CALD

Cultura de celule primare este o cultura obtinuta cu a5utorul celulelor izolate din fragmente de tesut proaspat. Celulele pot fi izolate din tesuturi prin metode rapide (cateva ore), procesare mecanica, digestie enzimatica sau ambele, in functie de tipul sau duritatea tesutului. Culturile primare pot fi obtinute, de asemeenea, prin metoda de migrare a celulelor dintr-un fragment tisular, timp de *-- saptamani. #$#%#&'(' N'C')#%'* !ota cu flux de aer laminar vertical Centrifuga cu racire %gitator orbital termostatat
,)

Camera de numarat celule (!emocitometru <urger-=urc sau altele) ncubator cu C/* si umiditate 9icroscop invesrsat in contrast de faza M#&'%I#(' +' (,C%,* -*-- placi (etri de sticla sterilizate in prealabil -* pipete serologice sau pipete (asteur cu bulb -;oarfeci cu varf subtire si pense anatomice sterilizate in prealabil -pipete automate de diferite volume cu varfuri de unica folosinta -flacoane 'rlenma?er de sticla (,))-*0) ml, in functie de volumul tesutului) sterilizate -sita de n?lon sterila cu dimensiunea porilor O de >)+m -;lacoane de cultura cu suprafata de *0cmm* )-(,.II /I M'+I, +' C,(&,%0* ,. :olu"ia fosfat 7 salin ((<:), fara ioni de Ca*I si 9g*I alctuit din& CCl 7 *)) mg C!*(/> - *)) mg 4a!(/> x . !*/ 7 *,,1 g sau 4a*!(/> 7 ,,,> g 4aCl 7 8 g %dusa la ,))) ml cu apa bidistilata sau ultrapura p!-ul solutiei se aduce la .,--.,>, a5ustandu-se cu !Cl ,4 i 4a/! ,4 sterile *. :olu"ia de =ripsin (),*02) in (<: cu p! .,>. =riopsin ,&*0) 7 *,0 g (<: 7 ,))) ml -. 9ediu de cultur 9'9 (9ediu 'agle 9inimal) de baza cu ,)2 :;< si ,2 (H:H4 ntr-un recipient de sticla de ,))) ml cu agitator magnetic, se dizolv continutul unui flacon precantarit de pulbere 9'9 (,.,>g) in 8)) ml apa bidistilata sau apa ultrapura - :e agita pe platforma agitatorului magnetic pana la solubilizarea completa a pulberii - :e adauga in mediu reconstituit -,.g de 4a!C/- :e agita in continuare pana la solubilizarea comoleta a solutiei de bicarbonat - :e aduce volumul final al solutiei la ,)))ml cu ap dublu-distilat sau ultrapura - :e verifica valoarea p!, pentru a avea .,--.,>. %5ustarea p! se face cu !Cl ,4 i 4a/! ,4 - :e filtreaza steril cu a5utorul filtrului atasat la o pompa de vacuum si se stocheaza la I*->oC. - (e recipientul in care se stocheaza mediul se noteaza data reconstituirii, continutul (cu sau fara :;< sau (H:H4), numele utilizatorului >. 9ediu de cultur 9'9 complet (cu ,)2 :;< si ,2 (H:H4)
,,

(entru 0)) ml mediu este nevoie de& >>3,0 ml 9'9 de baza 0) ml :;< dezghetat si filtrat steril ),0 ml amestec solutie stoc (H:H4 , care este preparata din , ml (enicilin de , ))) ))) # I ,g :treptomicin si , ml neomicina Kn ,)) ml (<: si se pastreaza la -*)oC TE6NICA DE LUCRU e&ec#$a#a pe parc$r"$ a + $crari prac#ice d$pa c$m $rmea1a0

L$crare de a-!ra#!r Nr.78+%5 !re9 :e pregatesc pentru lucrarea de laborator 4r.* (cu o saptamana inainte de izolare celulelor propriu-zisa) urmatoarele materiale si solutii, conform indicatiilor de mai sus& ,. :e sterilizeaza cu a5utorul aerului fierbinte si ambala5 din folie de aluminiu urmatoarele materiale& - (laci (etri de sticla - * foarfeci cu varf subtire si curbat - *-- pense anatomice - * flacoane 'rlenma?er *. :e sterilizeaza in abur fierbinte si ambalate in cutii din ((& - $arfuri pentru pipete automate -. :e prepara solutiile !Cl ,4 si 4a/! ,4 pentru a5ustarea p! >. :e prepara solutia (<: sterila fara Ca si 9g 0. :e prepara mediu 9'9 simplu, steril 1. :e prepara mediu 9'9 complex, steril .. :e prepara solutia de tripsina, care se filtreaza si se pastreaza in volume de cate 0 ml la -*)oC) 8. :e pun la congelator --> litri de apa pentru a forma cuburi de gheata pana la momentul celei de-a *-a lucrari practice L$crarea de a-!ra#!r Nr.+ 8: !re9 % zolarea celulelor din tesutul dermo-epidermic de sobolan. ,. n hota cu flux de aer laminar se pregatesc - tuburi conice de centrifuga, cu volum de 0) ml, notate, cu cate -) ml solutii de spalare pentru tesut, dupa cum urmeaza& -ul flacon (>2 (H:H4 in 9'9 de baza, fara :;<) -lea flacon (*2 (H:H4 in 9'9 de baza, fara :;<) -lea flacon (9'9 simplu, fara :;<) (ana la recoltarea tesutului, flacoanele se tin la rece (frigider sau pe gheata) *. :e sacrifica animalul prin inectie letala a unui anestezic de uz general.

,*

-.:e depileaza o parte din sprafata dorsala a tegumentului >. :e dezinfecteaza zona depilata cu solutie de alcool iodat 0. :e decupeaza cu un foarfec steril zona pregatita pentru recoltare =esutul va fi pus Kn lucru cJt mai repede posibil (Kn intervalul dintre recoltare i prelucrare "esutul se va men"ine la o tempratur de I> )C pentru oprirea proceselor metabolice). 1. :e imerseaza fragmentul de tesut in flaconul cu solutia energic timp de ,) min .. :e transfera in solutia si se agita energic timp de ,) min de spalare si se agita

8. :e transfera in solutia de spalare si se agita energic timp de ,) min 3. :e transfera tesutul intr-o placa petri sterila, de sticla, peste care se adauga >-0 ml de mediu 9'9 complet ,). :e curata partea dermo-epidermica de hipoder cu a5utorul unui foarfec ascutit cu varf curbat ,,. :e spala fragmentul de tesut de cateva ori cu mediu proaspat ,*. Pesutul este fragmentat (timp de 0-,) min) in fragmente fine, cu a5utorul unui foarfec mic, pJn la ob"inerea unor fragmente mici, de aproximativ ,-- mm diametru. ,-. Nn vasul unde s-a efectuat fragmentara se adaug circa --> volume (raportat la masa "esutului fragmentat) de tripsin de lucru. :olu"ia de tripsin va fi Knclzit Kn prealabil la I-.)C. ,>. :e decanteaz steril suspensia tisular Kn tripsin Kntr-un vas de tripsinizare (flacon 'rlenma?er de ,)) ml sau alt volum, in functie de cantitatea materialului de prelucrat) ,0. $asul de tripsinizare se aeaz pe platforma incubatorului cu agitare orbitala, la ,-)-,0) turHmin si temperatura de -.oC. :e face omogenizarea suspensiei timp de 0-,) min. ,1. :e las cJteva secunde suspensia Kn repaus, pentru sedimentarea fragmentelor mari, Knc nedegradate, apoi se decanteaza uor supernatantul, fie cu o pipet cu o camer de aer i cu vJrful efilat, fie prin aplecarea prudent a vasului deasupra flaconului de colectare (flacon de cultura de 0) ml, rcit Kn prealabil la gheata)

,-

,.. ;laconul cu suspensia celulara este pastrat la ghea" pJn la decantarea urmtorului eantione ,8. (este fragmentele rmase Kn balonul de tripsinizare se adaug din nou tripsin (I-. C) i se reia agitarea timp de 0-,) min.
)

,3. :e poate trece prin cJteva etape de tripsinizare, pJn la epuizarea fragmentelor mai mari de "esut. *). Nn final, suspensia celular Kn tripsin este decantat Kn cupe de centrifugare (rcite la I> C).
)

*,. Cupele se echilibreaz i se pun la centrifugat ,) min la 0))D sau 8))-,))) rotHmin (se folosete o centrifug cu rcire). **. :e decanteaz supernatantul (solu"ia de tripsin), iar sedimentul se reia in mediu de cultur, astfel KncJt s se ob"in o concentra"ie celular optim, de ,) 0 celule H ml (numrtoare celular de control). *-. :uspensia celular Kn mediu este repartizat steril Kn vase pentru culturi celulare& -flacoane de *0 cm*, cJte 0 mlHflacon *>. ;lacoanele de cultur se aeaz pe suprafa" plan, Kn incubatorul cu C/ * i umiditate, la temperatura de I-.)C si concentratia de C/* de 02, notJnd pe partea superioar a recipientului denumirea celulelor cultivate, data initierii culturii, numarul de celule insamantateHflacon si numele operatorului. *0. 9ediul de cultura initial si celulele moarte, neaderate de fundul flaconului sunt inlaturate a doua zi. (este cultura aderata de suport se adauga 0 ml mediu 9'9 complet proaspat.

,>

%='4= 'Q ,. :e lucreaza cu mare atentie, pentru a nu atinge varfurile de lucru (instrumentar, pipete) de suprafete contaminate sau pielea operatorului *. La deschiderea recipientelor cu mediu se are gri5a ca marginea gatului, marginea si interiorul capacului sau a dopului sa nu fie atinsa de materiale contaminate sau mana examinatorului. -. Fupa deschiderea flaconului cu mediu de cultura, capacul sau dopul este pus fie cu partea interioara in sus, intr-o zona a hotei sigura, ferita de pericole de atingereHstropire sau este pozitionat cu partea interioara in 5os, pe o suprafata sterila (o placa sau un capac de placa (etri)

,0

>. ;laconul cu mediu este inchis si pus la frigider imediat dupa extragerea din el a cantitatii de mediu necesar pentru lucru.

CULTURI DE CELULE LUCRARI PRACTICE


,1

CIC(,( II )&,+II M#)&'%('

)1(1 +%1 2I-(1 2,&N#%, M#%I#

,.