Sunteți pe pagina 1din 61

Universitatea de Medicin si farmacie Gr. T.

Popa Iai FACULTATEA DE MEDICIN Domeniul: MEDICIN MICROBIOLOGIE

MONITORIZAREA INCIDENEI INFECIEI GONOCOCICE I CUNOATEREA PROFILULUI REZISTENEI LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE NEISSERIA GONORRHOEAE CIRCULANTE PE TERITORIUL JUDEULUI SUCEAVA
REZUMAT

Conductor doctorat Prof. Univ. Dr. Luminia-Smaranda Iancu

Doctorand Silvia Filipiuc (Lzurc)

TEZ DE DOCTORAT IAI 2011

CUPRINS REZUMAT
Pag. Introducere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Contribuii Personale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Motivaie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Scopul studiului . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Capitolul 1. Constituirea lotului de studiu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1. Tulpini studiate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.1.1. Caracteristici de timp, loc i persoan a cazurilor confirmate cu Neisseria gonorrhoeae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.1.2. Discuii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.2. Prelevare probe i transport probe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.2.1. Prelevare probe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.3. Examenul direct al prelevatelor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.4. Studiul culturilor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 1.4.1. Caractere de cultur a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae . . . . . . . . . . 20 1.5. Identificare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.5.1. Testul producerii de beta-lactamaz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 1.5.2. Testul oxidazei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.5.3. Sistem de identificare API NH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 1.6. Evaluarea, interpretarea rezultatelor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Capitolul 2. Cercetri privind testarea sensibilitii la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae izolate , prin antibiograma difuzimetric, Kirby Bauer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.1. Testarea sensibilitii la antibiotice prin metoda difuzimetric . . . . . . . . . . . . 25 2.1.1. Principiul metodei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.1.2. Material i metode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.1.2.1.Tulpini bacteriene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 2.1.3. Rezultate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.1.4. Discuii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.1.5. Concluzii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Capitolul 3. Cercetri privind testarea concentraiilor minime inhibitorii CMI a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae izolate , prin E-test . . . . . . . . . . . . . . 38 3.1. Testarea sensibilitii la antibiotice prin metoda difuzimetric . . . . . . . . . . . . 38 3.1.1. Principiul metodei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.1.2. Material i metode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.1.2.1.Tulpini bacteriene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.1.2.2. Metod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.1.3. Rezultate i discuii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 3.1.4. Concluzii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

Capitolul 4. Cercetri privind screeningul pentru detecia Metode bazate pe PCR n secreiile de col uterin prin metode bazate pe RT-PCR . . . . . . . . . . . . 52 4.1. Screening-ul pentru detecia Neisseria gonorrhoeae prin RealTime PCR, la paciente cu sindrominflamator pelvin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.1.1. Lotul de studiu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.1.2.Cuantificarea absolut utiliznd tehnica Real Time PCR . . . . . . . . . . . . 52 4.1.3.Principiul kitului Primer Desing genesing kit pentru Neisseria gonorrhoeae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 5.1. Evaluarea datelor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 6.1.Discuii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 6.2 Concluzii . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 BIBLIOGRAFIE SELECTIV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

REZUMAT INTRODUCERE O victorie n btlia cu bacteriile nu este uor de obinut, mai ales c aceti adversari au o evoluie de peste 3 milioane de ani, iar abilitatea i diversitatea rspunsurilor la adversiti este uluitoare i nspimnttoare (Wax si colab., 2008). Rezistena bacterian este o problem global, care afecteaz att rile industrializate ct i pe cele srace. Acest fenomen face dificil tratarea infeciilor comunitare, mai ales a celor cu transmitere sexual sau a tuberculozei, toate contribuind la costuri economice importante datorit creterii morbiditii i mortalitii prin aceste afeciuni. In ultimii ani asistm la amplificarea numrului infeciilor cu transmitere sexual, mai ales acelor determinate de Neisseria gonorrhoeae, care evolueaz, datorit creterii procentului tulpinilor rezistente, spre eec terapeutic. In numeroase ri rezistena la penicilin a depit 80% (Ray i colab., 2005). Supravegherea rezistenei la antibiotice la Neisseria gonorrhoeae este esenial pentru instituirea unei terapii eficiente. Stabilirea tipului de rezisten la tulpinile izolate de la pacienii cu gonoree din zona Sucevei contribuie la urmrirea rspndirii acestora n estul rii noastre, la optimizarea schemelor terapeutice, la eradicarea infeciei gonococice i la completarea bazei de date la nivel naional i european. De asemenea este important ca populaia s contientizeze c gonoreea nu este o infecie banal, c infeciile cronice pot duce la sterilitate, iar infeciile asimptomatice reprezint rezervorul pentru rpndirea gonococului. Amplificarea fenomenului rezistenei bacteriene impune reconsiderarea strategiilor de utilizare a agenilor antimicrobieni, mai ales controlul prescripiilor, implementarea unor strategii de reducere a rspndirii infeciilor cauzate de microorganisme rezistente i aplicarea unor programe de supraveghere epidemiologic, inclusiv, prin supravegherea cu laboratorul, prin detectarea bacteriilor rezistente.
4

CONTRIBUII PERSONALE 1. MOTIVAIE Neisseria gonorrhoeae, patogen primar, cu gazd unic omul este, conform CDC Atlanta, a doua cauz de infecii cu transmitere sexual, dup Chlamydia trachomatis. Prevalena gonoreiei la bolnavii cu vrsta ntre 15-49 ani este de 2% n Africa Sub Sahariana, 1% - Asia de S-E , 0.6% - America Centrala i de Sud i ntre 1-10% n rile industrializate (Manju B., et all 2007, Gerbase AC, 1998). Pn n prezent, diferite ri au raportat, n procente variabile, tulpinile de Neisseria gonorrhoeae rezistente la penicilin, tetraciclin i quinolone; pentru unele regiuni se pune problema remodelrii managementului acestei infecii, funcie de rezultatele testrilor in vitro, testri care au devenit indispensabile n ghidarea terapiei (Manju B., et all 2007, Stathi M, et all (2006), Tapsall JW (2005). Reducerea sensibilitii la cefalosporine de a 3- generaie, folosite n prima linie a fost raportat n unele ri ca: Africa de Sud 13% (T. Berglund, M. Unemo, P. OLcen, et all 2002), India 5,5% (Manju B., et all 2007), China 16% (Tapsall JW (2005), Rahman M, Sultan Z, Monira S, et al. (2002), Rusia 3% ( Veronoca Vorobieva, Natalia Firsova, et all 2007), Europa de Vest 3 izolate cu sensibilitatea scazut, Japonia 0,9% (Ito M, Deguchi T, Mizutani KS, et al. (2005). Continuarea supravegherii rezistenei la antibiotice a este esenial, monitorizarea emergenei i rspndirii rezistenei la antibiotice este baza raional pentru instituirea tratamentului sindromic (Manju B., et all 2007, WHO (2001) Geneva, Simonsen GS, Tapsall JW, Allegranzi B, et all. (2004) i meninerea eficacitii tratamentului (WHO (2001) Geneva, Tapsall JW (2003). Controlul gonoreiei este complex i dificil, impunnd cooperarea multidisciplinar, pentru stabilirea schemei terapeutice i a instituirii msurilor de prevenie n vederea reducerii infeciilor secundare (Tapsall JW (2001)). Programele de supraveghere sunt necesare pe de o parte datorit dificultilor de cultivare i, pe de alta, datorit instalrii rapide a rezistenei gonococului (WHO (2001), Roy K, Wang SA, Meltzer MI (2005).
5

. Dificultile de izolare, stocare i testare a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae pentru monitorizarea rezistenei la antibiotice impun respectarea strict a unui algortim de diagnostic, adaptat la condiiile existente n laboratoarele din ara noastr. n acest scop este necesar testarea prin E- test, metod care poate surprinde creterea CMI pentru cefalosporine, ceea ce ne propunem i noi n studiul nostru (Workowski KA et all 2008, Deguchi T, Yasuda M. 2008). Contribuii la cunoaterea temei cunoaterea incidenei reale a infeciei gonococice, n zona de Nord-Est a rii, respectiv n judeul Suceava (prin mbuntirea depistrii i raportrii cazurilor suspecte de gonoree de ctre medicii de diferite specialiti ) i a caracteristicilor epidemiologice de timp, loc i persoan; prin cunoaterea pattern-ului de sensibilitate la antibiotice a gonococului, aducerea de argumente tiinifice privind oportunitatea schemelor de tratament sindromic i orientarea tratamentului pacienilor cu gonoree dup criteriul obiectiv al sensibilitii la antibiotice; cunoaterea regional a prevalenei tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae productoare de beta-lactamaze va permite orientarea precoce a terapiei, ctre o terapie adecvat i stabilirea msurilor de chimioprofilaxie adecvate; rezultatele vor completa baza de date raportat de ctre Romnia la ECDC (European Centre of Diseases Control), privind rezistena tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae circulante n Romnia. 2. SCOPUL STUDIULUI Scopul izolrii tulpinii n cultur pur este determinarea rezistenei la antibiotice datorit emergenei rezistenei la fluoroquinolone i a riscului instalrii rezistenei i la cefalosporine. Creterea numrului de cazuri confirmate cu laboratorul va permite determinarea incidenei i prevalenei, la valori mai apropiate de cele reale, fr a ne propune diagnosticarea a 100% din cazuri, dat fiind evoluia subclinic a infeciei, la aproximativ 50% dintre femei. n Romnia nu se cunosc n prezent morbiditatea, incidena i prevalena real datorit dificultilor de izolare, iar spectrul de
6

rezisten la antibiotice i circulaia tulpinilor rezistente este cunoscut parial, prin studii de cercetare izolate, n general efectuate n sudul rii sau n regiunea de NV. Incidena gonoreei este subraportat la nivelul ntregii ri, inclusiv n regiunea de NE, unde ne-am propus s defurm acest studiu; pentru cunoaterea incidenei acestei boli n judeul Suceava, plecnd de la experina i studiile anterioare (din perioada 2004-2008). Deoarece, la femei, majoritatea infeciilor gonococice sunt asimptomatice, ne-am propus utilizarea RT PCR, pentru depistarea activ a infeciei determinat de N. gonorrhoeae, la paciente cu boal inflmatorie cronic, condiie de risc pentru complicaii ulterioare. Ulterior, studii extinse, vor confirma sau nu utilitatea practic a acestui demers, prin frecvena rezultatelor pozitive i a raportului cost-beneficiu. Capitolul 1 CONSTITUIREA LOTULUI DE STUDIU 1.1. TULPINI STUDIATE n depistarea cazurilor suspecte de gonoree pe baza definiiei de caz (clinic i epidemiologic) au fost implicai 14 medici: 5 dermato-venerologi, 6 ginecologi, 2 planning familial, 1 urolog din judeul Suceava; dup semnarea acordului liber consimmnt al pacienilor am studiat un numr de 60 de tulpini (izolate clinice obinute de la 12 femei i 48 brbai, 9 au fost confirmate doar prin frotiu). In perioada 2004-2008 am studiat sensibilitatea prin metoda Kirby- Bauer a 60 tulpini de Neisseria gonorrhoea la penicilin, ampicilin, augmentin, tetraciclin, claritromicin, ceftriaxon, ciprofloxacin, izolate la bolnavii de gonoree din judeul Suceava, n perioada 2004-2008. . n perioada octombrie 2009- august 2010 am studiat CMI prin E-test 32 tulpini de N. gonorrhoeae izolate de la 26 brbai (81%) i 6 femei (19%), respectiv de la cazuri suspecte de gonoree, pe baza definiiei de caz (clinic i epidemio-logic); 5 cazuri au fost confirmate numai prin frotiu. n perioada ianuarie-martie 2011 am studiat probele provenite de la o sut de paciente cu sindrom inflamator pelvin
7

pentru stabilirea diagnosticului etiologic de N. gonorrhoeae prin Real-time - PCR din care 11 probe au fost pozitive. 1.1.1. CARACTERISTICI DE TIMP, LOC I PERSOAN ALE CAZURILOR CONFIRMATE n tabelul numrul I am prezentat principalele caracteristici legate de repartiia pe medii de proveniena urban, rural, sexe, vrst, ocupaie, dac au avut sau nu simptomatologie, dac au fost tratai cu antibiotice n ultimele 48 ore. Numrul total al cazurilor suspecte de Neisseria gonorrhoeae care s-au prezentat la cabinetele medicilor colaboratori au fost 318 din care 276 brbai (87%) i 42 femei (13%); din mediul urban 236 (75.8%) i 82 din mediul rural (24.2%). Numrul de cazuri confirmate cu N. gonorrhoeae din 318 prezentri au fost de 92 tulpini i 14 frotiuri (29.2%) care au fost studiate in vitro pentru testarea sensibilitii la antibiotice (60 tulpini au fost testate prin antibiograma difuzimetric i 32 am determinat CMI concentraia minim inhibitorie prin E-test.
Tabel nr. I. Caracteristici legate de repartiia pe medii de proveniena urban, rural, sexe, vrst, ocupaie, dac au avut sau nu simptomatologie, dac au fost tratai cu antibiotice n ultimele 48 ore.

nr. cazuri-suspecte intrate n studiu nr. cazuri confirmate anul depistarii mediu sex grupa de vrst

318 106 (33.7%): 92 izolri n cultur i 14 frotiuri pozitive 2004-13 tulpini; 2005-32 tulpini; 2006-7 tulpini;2008-8 tulpini; 2009-12-tulpini; 2010-20 tulpini 65 (71%) R 74 M (80.4%) 2 (grupa de vrst 15-19 ani); 37 (grupa de vrst 20-24);44 ( grupa de vrst 25-34 ani); 7 (grupa de vrst 35-44ani); 2 (grupa de vrst 45-54 ani). 81 necstorit (89%) 59 fr; 3 agricultor; 6 muncitori;10 studeni; 4 personal sanitar; 4 personal din nvmnt; 6 altele 74 (M) 18 (F) 8

starea civil ocupaia secreie uretral tampon endocervical

disurie durere etaj abdominal inferior partener simptomatic antibioterapie n ultimele 48 ore durata tratamentului intervalul de timp recoltare-primire probe

71 (78%) 17 (19%) 10 (11%) 7 (8%) 24 ore Medie = 50 minute (min = 5 minute, max = 4 ore).

1.1.2. DISCUII Distribuia gonoreei variaz considerabil da la o ar la alta n cadrul rilor care au raportat i supravegheaz aceast boal n rndul populaiei, membre a Uniunii Europene. Aceste rate sunt cuprinse de la 1 la 27 cazuri la %000 de locuitori. Sunt state cu rate sub 5%000 cum ar fi cele din sud: Grecia, Spania i Portugalia; centrul i estul Europei: Bulgaria, Romania, Polonia i Slovenia. Rate intermediare <15%000 au fost gsite n Scandinavia (Danemarca, Norvegia i Suedia), Irlanda, Estonia, Lituania, Malta. Rate crescute s-au raportat n Lituania i Marea Britanie. Trendul din 2006-2010 a fost de descretere mai mult de 9 procente n ri ca: Republica Ceha, Estonia, Grecia, Irlanda, Lituania, Marea Britanie; mai mult de 50% descretere n Romania i Estonia (Surveillance Report - Sexually transmitted infections in Europe 1990-2009). Creteri de incidene a gonoreei au fost raportate n Bulgaria, Danemarca, Malta, Portugalia, Slovacia i Spania. Incidenele gsite n judeul Suceava se ncareaz n acest trend, cu excepia anului 2004 cnd am iniiat acest studiu, am mobilizat toi colaboratorii, am iniiat un program de informare a populaiei locale i am obinut o inciden de 50.18%000 locuitori, de asemenea n toi aceti ani de supraveghere susinut a gonoreei am obinut rate ale incidenei peste cele ale Romaniei, respectiv: 2004-50.18%000; 2005-31.08%000; 2006-18.6%000; 2008-5.5%000; 2009-6.4%000; 2010-4.2%000, cu siguran avem cea mai apropiat rat de incidena de cea real din Romnia.

Incidenta gonoreei in Romania si jud. Suceava in perioada 1984-2010


incidenta la 100.000 locuitori

80 70 60 50 40 30 20 10 0
71,9 63,8 57,4 50,18 46,2 41,5 39,939,9 35,7 35,0 33,5 31,08 28,128,8 26,7 26,6 25,524,7 25,424,8 23,6 22,723,5 21,9 22,121,4 20,4 20,2 19,817,9 19 18,6 17,9 17,917,3 17,6 17,5 16,7 15,6 11,69,8 10,8 9,5 7,4 5,5 6,4 3,782,93 2,8 4,2 2,4

19 84 19 87 19 89 19 91 19 93 19 95 19 97 19 99 20 01 20 03 20 05 20 07 20 09
ani

gonoree RO gonoree SV

Fig. 1. Incidena gonoreei n Romnia i judeul Suceava n perioada 1984-2010 (Sursa: MS-CCSSDM).

Repartiia pe sexe masculin/feminin: este raportat o inciden substanial mai mare la xesul masculin 80.4% (Suceava) fa de cel feminin, ct i n toate statele membre UE ,variaii de la stat la stat ntre 24-40% (Cehia, Danemarca, Frana, Grecia ,Malta, Slovenia); 58% n Netherland i 56% Frana (Surveillance Report Sexually transmitted infections in Europe 1990-2009).

Fig. 2. Incidena gonoreei n Statele membre UE n perioada 1990 -2009 (Sursa: Surveillance Report - Sexually transmitted infections in Europe 1990-2009).

10

Se observ un declin n evoluia incidenei gonoreei, care reflect rezultatele screeningului n serviciile de supraveghere i modul de raportare n sistem. Acest declin se datoreaz i numrului mare de cazuri rmase nediagnosticate i neraportate (Surveillance Report - Sexually transmitted infections in Europe 1990-2009). n Romnia se poate aduda la acestea i stigmatul de boal ruinoasa pentru gonoree, automedicaiei i neprezentrii bolnavilor la cabinetele medicale. 1.2. PRELEVARE I TRANSPORT PROBE 1.2.1. PRELEVARE PROBE Pacienii care s-au ncadrat n definiiile de caz i au semnat consimmntul informat aprobat de Comitetul de Etic al UMF, li s-au recoltat probe . Produsele patologice au fost reprezentate de secreiile exudative ale mucoaselor inflamate. Secreiile au avut un aspect purulent, sunt opace, cremoase, cu o tent glbuie i se desprind uor de pe mucoas (D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638) Norme de prelevare, transport, conservare: Prelevrile le-am efectuat nainte de instituirea tratamentului antimicrobian. Recoltarea am efectuat-o mpreun cu medicii colaboratori (11 medici: 3 planing familial, 2 urologi, 3 dermato-venerologi, 3 ginecologi) care au examinat pacienii i au efectuat recoltarea: cu ansa sau tampoane sterile. La barbai, prin uoar exprimare a uretrei, am obinut o picatur de material patologic, care s-a recoltat cu ansa sau un tampon subire de 2-3mm , montat pe o scobitoare. A fost necesar s se intre cu ansa sau tamponul pe canalul uretral, pe o distan de 1-2 cm, de la meat (mai ales n cazurile unor secreii srace sau aderente). La femeie recoltarea am efectuat-o din colul uterin; instrumentarul necesar manevrei (valve, speculum) nu a trebuit s fie umectat cu substane dezinfectante. S-a recoltat secreia din endocervix, avnd grij s nu se contamineze proba cu flora vaginal (D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638).

11

TRANSPORT PROBE Cea mai bun metod pentru pstrarea viabilitii a fost inocularea ntr-un mediu nutritiv (AMIES) a tamponului, ce asigur o viabilitate de 6-12 ore; 1.3. EXAMENUL DIRECT al PRELEVATULUI Neisseria gonorrhoeae, diplococ cu caracterele morfologice tipice le-am observat n preparatele din exsudatul formelor acute ale infeciei gonococice:coci asimetrici, grupai cte doi, cu feele adiacente uor concave, sugernd imaginea boabelor de cafea, Gram-negativi, intracelulari, uneori extracelulari, cu dimensiuni uniforme (0.6-1m). n exsudatele provenite de la pacieii tratai cu antibiotice am observat modificri morfologice i mai pronunate, coci foarte mici alturi de coci gigani, apariia de gonococi Gram- pozitiv. Aspectul caracteristic al infeciei acute a fost de celul burat(D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638). (Fig.3).

Fig. 3. Secreie uretral examinat la microscopul cu imersie. Polimorfonucleare burate cu diplococi n boabe de cafea.

12

1.4. STUDIUL CULTURILOR 1.4.1. CARACTERE DE CULTUR Izolarea i cultivarea gonococilor am realizat-o n aerobioz n prezena unei proporii de CO2 10% la temperatura de 36-37C. Dup numeroase treceri pe geloz snge, am obinut uneori culturi i pe mediile uzuale. Intervalul necesar pentru aparia culturii a fost n general 48h ,au fost i tulpini care au crescut la 72 ore.

Fig. 4. Cultur pur de Neisseria gonorrhoeae pe agar GC baz + 1% hemoglobin + 1% supliment nutitiv IsoVtalex, VITOX + supliment selectiv (VCN).

Neisseria gonorrhoeae a produs diferite tipuri de colonii care au variat n diametru de la 0.5 la 1 mm, de consisten S, translucide, roz-gri, cu margini bine definite. Coloniile suspecte, le-am identificat microscopic i biochimic. ntre cele doua tipuri de secreii, cele uretrale au dat rezultate superioare n izolare datorit faptului c nu au fost nsmnate pe medii selective (care pot inhiba i o parte din gonococi). (D. Buiuc, M. Negu,Tratat de microbiologie clinic 2008). 1.5. IDENTIFICARE 1.5.1.Testul pentru -lactamaz Principiu Testul pentru -lactamaz se poate executa n cadrul testului API.
13

1.5.2 Testul Oxidazei Principiu: Testul detecteaz prezena citocromului C din lanul respirator. Se execut cu/pe colonii suspecte (de 18 h)

diplococi, Gram negativi de pe medii selective i neselective (D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638).
1.5.3 Sistemul de identificare API-NH (Neisseria Haemophylus) Principiu: Galeria API-NH conine microtuburi cu substraturi uscate pentru realizarea a 12 teste de identificare (reacii enzimatice sau fermentaii de zaharuri) precum i detecia penicilinazei. Se execut numai pe culturi pure de 18-20h. Dup dou ore de incubare aerob la 37C, citirea rezultatelor se face vizual iar identificarea se face cu ajutorul listei de profiluri numerice (sau softului furnizat de productor),(D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638). 1. Interpretarea: Identificarea am realizat-o cu ajutorul profilului numeric: pe Fia de rezultate, testele au fost separate n grupe de cte 3, ncepnd cu al doilea microtub (GLU), fiecare avnd atribuit cte o valoare (1,2 sau 4) Sumele valorilor din interiorul fiecrui grup, corespunztoare reaciilor pozitive, a realizat un profil numeric cu patru cifre. Acest profil, introdus n Lista de profiluri numerice,a identificat tulpina testat. QC: Controlul bacteriologic al galeriei am efectuat cu tulpinile de referin: Neisseria gonorrhoeae ATCC 31426 Haemophylus influenza ATCC 10211

14

Tabel

nr.

II.

Sistemul de identificare API-NH (Neisseria

Haemophylus)
GAL Profil 1001 5424 MAL ODC ProA GLU GGT URE SAC FRU PEN PAL IND + LIP -

N.g. -/+ H.i. -

+ +

-/+

+ -

Limitele testului - Sistemele API-NH sunt destinate identificrii numai a speciilor din baza de date a productorului - n cazul obinerii unui profil ndoielnic cu ProA pentru Neisseria gonorrhoeae a fost necesar verificarea identificrii cu un test alternativ (ex. reducerea nitrailor i nitriilor) - Capacitatea de identificare corect API-NH a speciilor de Neisseria a fost n jur de 98%.

Fig. 5. Teste biochimice galerii API NH Biomerieux -lactamaz negativ.

1.6. EVALUARE, INTERPRETAREA REZULTATELOR Raportarea rezultatelor Raportare: datorit consecinelor speciale i medico-legale ale erorilor de diagnostic n gonoree, CD recomand criterii pentru raportarea diagnosticului de gonoree. Se definesc 3 nivele de diagnostic:
15

- sugestiv - definire pe baza datelor clinice - prezumtiv - definitiv Ultimele dou includ rezultatele testelor de laborator. Capitolul 2 CERCETAREA REZISTENEI LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE N.gonorrhoeae IZOLATE PRIN ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRIC 2.1. Testarea sensibilitii la antibiotice, metoda difuzimetric 2.1.1 Principiul metodei: un inocul standardizat al tulpinii testate de Neisseria gonorrhoeae este nsmnat pe o placa de mediu agarizat Muller Hinton care s asigure difuzarea liber, uniform i reproductibil a substanelor antimicrobiene microcomprimate cu concentraii stabilite (D. Buiuc, M.Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638). Metoda difuzimetric, este cea recomandat de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards (2002) i de OMS, pentru terapia primar a infeciei gonococice: ampicilin, augmentin, ciprofloxacin, claritromicin, ceftriaxone, penicilin, tetraciclin. 2.1.2 Material i metod Testarea sensibilitii a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae la antibiotice am executat-o pe mediul GC agar base completat cu 1% IsoVitaleX sau cu un supliment echivalent. Columbia agar baz CM 0367 LOT 736335 / expira 01.2014 (proveniena Oxoid) completat cu 1% IsoVitaleX, lot 646832, expir 04.2011, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) am efectuat-o din cultura proaspat de 18h. Procedura: Materiale i echipamente Materiale: 1. Tulpini bacteriene: - tulpina de testat - cultura de 20 -24 de ore izolat n cultur pur - tulpina de referin Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226, pentru controlul testrii n ziua de lucru: - cultura de 20 - 24 ore pe
16

mediu GC cu agar baz completat cu 1% isoVitaleX sau cu un supliment echivalent Pentru manipularea tulpinilor de referin vezi instruciunea de stocare i utilizare a tulpinilor de referina (D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638). 2. Mediu GC agar baz completat cu 1% IsoVitaleX sau cu un supliment echivalent, pentru testarea sensibilitii la antibiotice la Neisseria gonorrhoeae, controlat conform. recomandrilor ultimului standard NCCLS M100 Performance standards for antimicroblal susceptibility testing. Mediul Mueller Hinton utilizat n acelai scop pentru majoritatea bacteriilor aerobe, nu este acceptabil pentru Neisseria gonorrhoeae . 3. Soluie fiziologica salin (Na CI 8,5%) steril 4. Discuri impregnate cu antibiotice pentru antbiograma difuzimetrica controlate conform. recomandrilor ultimului standard NCCLS M100 Performance standards for antimicrobial susceptibitity testing . Penicilin- 10 U/Tetraciclin - 30 g/Ceftriaxon - 30 g Ampicilin - 30 g/Ciprofloxacin 5 g/Augmentin 30 g Claritromicin 30 g 5. Alte materiale: - tuburi 12 / 120mm sterile ans bacteriologic standardul 0,5 McFarland- pipete gradate de 1 sau 2 ml sterile si pipetoare, tampoane de bumbac sterile, pense iris pentru aplicarea antibioticelor, stativ pentru tuburi pipete Pasteurrigl gradat pentru citirea rezultatelor antibiograme, plcue de ceramic de culoare nchis pentru citirea diametrului de inhibiie pe fond ntunecat, container deeuri, piset cu soluie de cloramina, bec de gaz recipiente cu cloramin, mnui de unica folosin, halate pentru utilizare n laboratorul de microbiologie de nivel 1-2. Echipamente: - incubator cu C02 (35 - 37 C) - frigider Ultimul standard NCCLS M100. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.

17

Fig. 6. Antibiograma difuzimetric pe mediu GC agar baz completat cu 1% IsoVitaleX, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) pt. ceftriaxon, augmentin, tetraciclin, penicilin.

Fig. 7. Antibiograma difuzimetric pe mediu GC agar baz completat cu 1% IsoVitaleX, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) pentru claritromicina, amoxicilina, ciprofloxacin.

2.1.2.1.Tulpini bacteriene Dup identificare, tulpinile de Neisseria gonorrhoeae le-am stocat prin congelare la -25C in bulion tripticaz soia i 20% glicerol.
18

Am testat sensibilitatea la antibiotice prin metoda difuzimetric Kirby-Bauer (Jones, R. J.et all 1989) recomandat de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards 2002/2008) i de WHO, pe mediu GC agar baze completat cu 1% IsoVitaleX, fr hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108CFU/ml) am efectuat-o din cultura proaspat de 24h; discurile impregnate cu antibiotic (AB Oxoid): penicilin 10g (cu diametrul de inhibiie conform NCCLS de la 26mm - 47mm), amoxicilina 10g, augmentin 30g, claritromicin 15g (pentru care nu exista interval de referin), tetraciclin 30g (cu diametrul de inhibitie conform NCCLS de la 26mm - 47mm), ceftriaxona 30g (conform NCCLS rezistent >35mm ), ciprofloxacin 5g (conform NCCLS rezistent >36mm ); plcile au fost incubate 5% CO2 pentru 24h la 37C, 70 umiditate; diametrele de inhibiie au fost msurate cu rigla; tulpini de control folosite la fiecare lot testat: Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226. 2.1.3 REZULTATE Treizeci i unu de tulpini de Neisseria gonorrhoeae au fost -lactamaz pozitive. Un numr substanial de tulpini au fost rezistente la penicilin (51 din 60) i tetraciclin (51din 60). Pentru penicilin 42 de tulpini au zone de inhibiie <19mm (propus limita pentru -lactamaza pozitiv), 9 tulpini cu diametre ntre 20-26mm (rezistente dar non -lactamaz pozitiv). Pentru tetraciclin 48 de tulpini au diametru de inhibiie <19mm (propus limita rezistenei nalte) i 3 tulpini de Neisseria gonorrhoeae cu diametru intre 20 i 30mm (nivelul sczut de rezistena). Rezultatele testrii Kirby-Bauer pentru 60 de tulpini de gonococ sunt prezentate in Tabelul III. n timp ce pentru penicilin, tetraciclin, ceftriaxon i ciprofloxacin sunt criterii clare n ghidul pentru interpretare a sensibilitaii (National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2008), pentru amoxicilin, augmentin, i claritromicin nu sunt bine definite. Toate 31 tulpini -lactamaza pozitiv au fost rezistente la penicilin; producerea de -lactamaz nu a fost corelat cu reducerea sensibilitii la alte antibiotice exceptnd tetraciclina. Un numr mare de tulpini de Neisseria gonorrhoeae (41 din 60) au fost rezistente la ciprofloxacin.
19

TABEL III. Procentul i numrul de tulpini Neisseria gonorrhoeae izolate in 2004-2008, rezistente la antibioticele testate Categorie Antibiotic Ceftriaxona 30g Penicilina 10ui Tetraciclina 30 g Amoxicilina 10g Augmentin 30g Claritromicina 15g Ciprofloxacina 5 g Rezistent 1.6 (1/60) 70 (42/60) 80 (48/60) 60 (36/60) 58.3 (35/60) 55 (33/60) 55 (33/60) sensibilitate % (nr.) Intermediar 3.3 (2/60) 15 (9/60) 5 (3/60) 16.6 (10/60) 13.3 (8/60) 6.6 (4/60) 13.3 (8/60)

Sensibil 95 (57/60) 15 (9/60) 15 (9/60) 23.3 (14/60) 28.3 (17/60) 38.3 (23/60) 31.6 (19/60)

Tulpini de Neisseria gonorrhoeae izolate n perioada 2004-2008 rezistente la antibioticele testate

90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0%

80,0% 70,0% 60,0% 58,3% 55,0% 55,0%

Tetraciclina 30g Penicilina 10g Amoxicilina 10 g Augmentin 30g Claritromicina 15 g Ciprofloxacina 5 g Ceftriaxona 30g 1,6% Rezistenta n valori procentuale

Fig. 8. Rezistenele la antibiotice a tulpinilor de Neiseria gonorrheoae izolate in 2004-2008 in jud.Suceava

20

TABEL IV. Sensibilitatea pentru Neisseria gonorrhoeae testata prin metoda difuzimetrica Nr.tulpini Rezistena moderat 2 9 3

Antibiotic Ceftriaxona 30 g Penicilina 10ui -lactamaza pozitiv Tetraciclina 30g

Rezisten nalt 1 42 31 48

Sensibil 57 9 9

Rezistena nalt a fost corelat cu rezistena mediata plasmidic, i rezistena moderat a fost corelat cu rezistena mediat cromosomal (Criteriile utilizate dup Jones, R. i colb J.,. 1989). 2.1.4.DISCUII Acest studiu este primul raportat n judeul Suceava, optimizarea diagnosticului microbiologic al gonoreei cu implementarea controlului de calitate al testarii sensibilitii la antibiotice facnd parte a programului naional de supraveghere OMS. Se observ o scdere a sensibilitii la antibiotice, a tulpinilor izolate de Neisseria gonorrhoeae, n special la penicilin i tetraciclin (85%) comparabil cu descreterea sensibitii tulpinilor raportat n Asia (74.3% la penicilin i 98.4% la tetraciclin); Europa de Vest (82% la penicilin i 91.3%la tetraciclin); America (90% la penicilin i 100% la tetraciclin); Africa (100% la penicilin i 91.7% la tetraciclin) (T. Berglund, M. Unemo et all 2002); Rusia (77% la penicilin i 92% la tetraciclin) (V. Vorobieva, N. Firsova, et all 2007); Spania (70% la penicilin i 86.5% la tetraciclin) ( S. Berron et all .2000); Iai (100% la penicilin i 92.6 la tetraciclin). Am depistat 31 de tulpini Neisseria gonorrhoeae producatoare de -lactamaza(51%) n timp ce n alte regiuni cum ar fi Asia (46.2%); Europa de Vest (15.2); America (23.1%); Africa (33.3%) ( Torsten Berglund et all 2002); Rusia (77%) (V. Vorobieva, N. Firsova, et all 2007); India (21.2%) (Manju B., et all 2007); Australia (14%) (Tapsall, J. W et all 1998); Japonia (0.5%) ( Ito M, Deguchi et all 2005). Iasi (71.6%) ( Bdescu A. et all 2007). In zona de NE a Romniei se constat o
21

prevalen ngrijortoare a tulpinilor de gonococ rezistente la penicilin, A. Bdescu i colab, raportnd n 2007, 100% dintre tulpini rezistente, pe un numr de 81 izolate. Valorile nregistrate de noi, respectiv 85% sunt asemntoare, ceea ce ne facem s conchidem c n zona noastr, excesul terapiei de prim intenie cu penicilin a condus la acest fenomen.. Producerea de -lactamaz nu a fost corelat cu reducerea sensibilitii la alte antibiotice exceptnd tetraciclina.
Tulpini de Neisseria gorrhoeae beta lactamaz pozitive 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% valori procentuale 51,0% 46,2% 33,3% 23,1% 21,2% 15,2% 14,0% 0,50% 71,6% Asia (T. Berglund 2002) Africa (T. Belgrund 2002) America (T. Berglund 2002) India (Tapsall J.W. 1948) Europa de Vest (T. Berglund 2002) Australia (Tapsall J.W.1948) Japonia (ITO M. 2006) Iai(A. Bdescu 2007) Suceava

Fig. 9. Producerea de beta lactamaz a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate n 2004-2008 conform studiilor citate n literatur.

Un numr mare de tulpini 55% de Neisseria gonorrhoeae au fost rezistente la ciprofloxacin, rezultat ce nu-l mai recomand ca tratament pentru gonoree n regiunea noastr, utilizarea sa fiind indicat numai dupa efectuarea antibiogramei i demonstrarea sensibilitii izolatelor. n alte zone sunt raportate: Asia (63%); Europa de Vest (4.3%); America (7.7%); Africa (0%) (T Berglund et all 2002); Rusia (50%) (V. Vorobieva, N. Firsova, et all 2007); Iasi (59.2%) (Bdescu A et all 2007); India (86.6%) (Manju B., et all 2007); Australia (50%) (Tapsall, J. W. et all 1998); Japonia (81.6%) (Ito M, Deguchi T et all 2005); China (94.3%).

22

China (T. Berglund, 2002) Rezistenta la Ciprofloxacin pe diferite zone geografice

100,0% 94,3% 86,6% 90,0% 81,6% 80,0% 70,0% 63,0% 59,2% 55,0% 60,0% 50,0% 50,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 7,7% 4,3% 10,0% 0,0% 0,0%

India (Manju B (2007) Japonia (Ito M, 2006)


Asia (T. Berglund, 2002)

Iai (A Bdescu, 2007) Suceava


Rusia (V. Vorobieva et all 20072008) Australia (Tapsall J. W. 1948) America (T. Berglund

2002)

Europa de Vest (T.

rezistenta n valori procentuale

Berglund Africa (T. Berglund 2002) 2)

Fig. 10. Rezistenele la ciprofloxacin a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate n 2004-2008, conform studiilor citate n literatur.

Pan n prezent tulpinile de Neisseria gonorrhoeae au dezvoltat o rezisten crescut la penicilin, tetraciclin, quinolone n diferite ri (India, China, Japonia) punnd o serioas problem de management n gonoree (Manju B, et all 2007, Stathi M, et all (2006) 57:7759, Tapsall JW (2005) 41(Suppl 4): S2638 ).
Rezistena la Penicilin pe diferite zone geografice
120,0% 100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0% rezistenta n valori procentuale 100,0% 100,0% 90,0% 82,0% 77,0% 74,3% 70,0%
Africa (T Berglund, 2002)

Iai (Bdescu A, 2007) America ( TBerglund, 2002) Europa de Vest (T Berglund, 2002) Rusia (V Vorobieva et all 2007-2008) Asia (T Belgrund, 2002) Spania (S Benon, 2000)

Fig. 11. Rezistenele la penicilin a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate n 2004-2008, conform studiilor citate n literatur.

23

Rezistenta la Tetraciclin pe diferite zone geografice


105,0% 100,0% 95,0% 90,0% 85,0% 80,0% 75,0% rezistenta n valori procentuale 100,0% 98,4% 92,6% 92,0% 91,7% 91,3% 86,5% America (T. Berglund 2002) Asia (T. Berglund 2002) Iai(A. Bdescu 2007) Rusia (V. Vorobieva ,all 20072008) Africa (T. Belgrund 2002) Europa de Vest (T. Berglund 2002) Spania (Benon S 2000)

Fig. 12. Rezistenele la tetraciclin a tulpinilor de Nesiseria gonorrheoae izolate n 2004-2008, conform studiilor citate n literatur.

La ceftriaxon am izolat o tulpin rezistent (1.6%) i 2 tulpini moderat sensibile n timp ce n alte regiuni sunt raportate: America (semnalate sporadic); Africa (13%) ( T. Berglund, M. Unemo, P. OLcen, et all 2002; 13: 109-114); Rusia (3%) ( N. Frigo, V.Vorobieva, N. Firsova, et all 2007; 84:285-289), Iai (0%) ( Bdescu A, Petrescu Z, et all 2007 p.512); India (5.5%) (Manju B., et all 2007); Japonia (30.3%) ( Ito M, Deguchi T, Mizutani KS, et al. (2005) 49:13743.); Italia (4.8%) ( T. Berglund, M. Unemo, P. OLcen, et all 2002; 13: 109-114); Suedia (1%) ( Martin IMC, Hoffman S, Ison CA. (2006) 58:58793);
Rezistena la Ceftriaxon pe diferite zone geografice
35,0% 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 13,0% 5,5% 4,8% 3,0% 1,6% 1,0% 0,0% rezistenta n valori procentuale 30,3% Japonia (ITO M. 2006) Africa (T. Berglund 2002) India (Manju B., 2007) Italia(T. Berglund 2002) Rusia (Veronoca V. all 20072008) Suceava Suedia (Martin IMC 2006) Iai (A Bdescu 2007)

24

Fig. 13. Rezistenele la ceftriaxon a tulpinilor de N. gonorrhoeae izolate n 20042008, conform studiilor citate n literatur

Reducerea sensibilitii la cefalosporine de a 3-a generaie folosite n prima linie a fost raportat n unele ri: China, India (Manju B., et all 2007, Tapsall JW (2005) 41(Suppl 4): S2638, Rahman M, Sultan Z, Monira S, et al. (2002) 40:203740). Continuarea supravegherii rezistenei la antibiotice a Neisseria gonorrhoeae este esenial, monitorizarea emergenei i rspandirii rezistenei la antibiotice este baza raional pentru instituirea tratamentului sindromic (Manju B., et all 2007, WHO (2001) Geneva: World Health Organization, Simonsen GS, Tapsall JW, Allegranzi B, et al. (2004) 82:92834. ) i meinerea eficacitii tratamentului WHO. (2001) Geneva: World Health Organization, Tapsall JW. (2003) 27:S704). Trendul rezistenelor la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae izolate n perioada 2004-2008 este redat in tabelul V i n figura nr.14.
Rezistenta la antibiotice n perioada 2004-2008
100% rezistenta n valori procentuale 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1,6% 2004 0% 2005 ani 0% 2006 0% 2008 76% 69% 61% 87% 75% 62% 59% 56% 57% 50% 42% 37%

Penicilina Amoxicilina Augmentin Claritromici na Tetraciclina Ceftriaxon

Fig. 14. Rezistenele la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate n perioada 2004-2008 n jud. Suceava

25

Tabel nr. V Prevalena rezistena la antibiotice, pentru perioada 2004-2008 2004 69% 69% 61% 1.6% 53% 69% 76% 2005 62% 59% 59% 0% 40% 56% 87% 2006 57% 57% 57% 0% 42% 42% 57% 2008 75% 50% 50% 0% 50% 37% 75%

Penicilina Amoxicilina Augmentin Ceftriaxon Ciprofloxacin Claritromicina Tetraciclina

2.1.5. CONCLUZII n zona noastr penicilina, tetraciclina, ciprofloxacina, claritromicina, amoxicilina i augmentinul nu pot fi folosite n tratamentul gonoreei, dect dup rezultatul testrii la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae. n Romnia, optimizarea, standardizarea i controlul de calitate al testarii sensibilitii la antibiotice a gonococului nu este nc bine stabilit n multe laboratoare. Continuarea regional i national a supravegherii sensibilitii la antibiotice este crucial n detectatea emergenei noilor rezistene, monitorizarea variaiei patternurilor de sensibilitate face posibil adaptarea tratamentului Evoluia sensibilitii la cefalosporine a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae trebuie monitorizat obligatoriu (fiind singura clas de antibiotice disponibil n momentul de fa pentru terapia sindromic n uretrita gonococic), pentru surprinderea apariiei tulpinilor rezistente. Sunt necesare studii microbiologice inclusiv prin utilizarea markerilor de epidemiologie molecular, stabilirea mecanismelor de rezisten i a modului lor de transmitere. Capitolul 3 CERCETAREA REZISTENEI LA ANTIBIOTICE PRIN DETERMINAREA CMI 3.1. E-test 3.1.1 Principiul metodei E-test:tehnic cantitativ pentru determinarea concentraiei minime inhibitorii (MIC) pentru antibiotice i pentru detectarea
26

mecanismelor de rezisten a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae izolate in cultura pura. E-test conine stripuri din plastic inert desicat pe care sunt aplicate antibioticele n gradiente exponenial calibrate cu scala CMI n g/mL . 3.1.2 Materiale i metod 3.1.2.1.Tulpini bacteriene Dup semnarea consimmntului informat de ctre pacieni, am reuit s includem n lotul studiat un numar de 32 de tulpini de Neisseria gonorrhoeae (izolate clinice obinute de la 6 femei i 26 barbai, n alte 5 cazuri, confirmarea diagnosicului s-a realizat doar pe seama frotiului, existnd dificulti legate de transportul probei n timp util la laborator) n perioada octombrie 2009- august 2010. 3.1.2.2. Metod Am testat sensibilitatea la antibiotice prin metoda E-test recomandat de CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)/2008 (37), respectiv de ctre OMS, pe Mediu GC Columbia agar baz CM 0367 LOT 736335 / expir 01.2014 (proveniena Oxoid) completat cu 1% IsoVitaleX, lot 646832 expir /04/2011, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) am efectuat-o din cultura proaspat de 18h (D Buiuc, M Negu, Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629-638). Am utilizat benzi E test cu urmatoarele antibiotice: - CH-Claritromicin CMI 0.016-256 g/mL,lot BJ 0577/ 05/ expir n 2012; - PGLBenzylpenicilinCMI 0.002-32 g/mL lot BI 0353/ expir in 02/2011 - TXL Ceftriaxon CMI 0.002-32 g/Ml lot BI2625/expir in 09/2011; - TC-Tetraciclin CMI0.016-256 g/Ml, lot BI 0354/ expir in 02/2011; - CI-Ciprofloxacin CMI 0,002-32 g/Ml,lot BI2032 expir in 07/2013; - AC-Amoxicilin CMI 0.016-256 g/Ml,lot BI 0030/ expir in 11/2011; - XL-Augmentin CMI 0.016-256 g/mL, lot BH 3602/ expir in 12/2010 - SC - Spectinimicin CMI 0.064-1024, lot BJ 0233 expir 10.2013.
27

Tulpini de control folosite la fiecare lot testat: Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 lot 648457, expir 09/2011. Pe suprafaa unei plci cu mediu agarizat am nsmnat mai nti cu tulpina testat (fig. 70) n condiii standardizate (0.5 McFarland turbiditate standard lot 822370301, expir n 2012 m-am asigurat de grosimea mediului de 4mm 0.5mm i calitatea inoculului :pentru bacteriile fastidioase am suspendat n bulion tripticaz soia lot 237022 (D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinic 2008, p. 629-638).

Fig. 15. Testarea prin E-test, simultan pentru mai multe antibiotice.

Dup incubare corespunztoare (in atmosfera imbogait cu 5% CO2), CMI este indicat de intersecia dintre zona eliptic de inhibiie a culturii i scala de gradient a langhetei. Testul permite determinarea concomitent, pe aceeai plac, a CMI pentru mai multe antibiotice, att pentru bacterii aerobe ct i anaerobe; n plus testul permite supravegherea pacienilor pe parcursul terapiei antimicrobiene pentru a surprinde selectarea de clone rezistente. Am determinat CMI, prin E-test pentru cte dou antibiotice pe plac, dup cum urmeaz: pentru amoxicilin i spectinomicin, pentru ciprofloxacin i augmentin, pentru amoxicilin i ceftriaxon (Fig. 16-18)

28

Tabel VI. Valorile CMI, conform CLSI 2008 criterii de interpretare Antibiotic Tulpin Tulpin Tulpin sensibil intermediar rezistent CMI (g/mL) sensibil CMI (g/mL) 0.06 0.12-1 >2 Penicilin Ceftriaxon Ciprofloxacin Spectinomicin Tetraciclina 0.25 0.06 32 0.25 Nu exist limite 0.12-05 64 0.5-1 Nu exist limite >1 128 2-32

Fig. 16. E-test pe mediu GC agar baz completat cu 1% IsoVitaleX, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) de Neisseria gonorrhoeae pentru amoxicilin i spectinomicin.

Fig. 17. E-test pe mediu GC agar baz completat cu 1% IsoVitaleX, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) de Neisseria gonorrhoeae pentru ciprofloxacin i augmentin.

29

Fig. 18. E-test pe mediu GC agar baz completat cu 1% IsoVitaleX, far hemoglobin; suspensia standardizat (0.5 McFarland 108 UFC/ml) de Neisseria gonorrhoeae pentru amoxicilin i ceftriaxon.

3.1.3 Rezultate i discuii Valorile CMI pentru penicilin, ampicilin, augmentin, tetraciclin, claritromicin, ceftriaxon, ciprofloxacin, au fost transformate n rate de rezisten (D. Buiuc, M. Negu, Tratat de microbiologie clinic 2008, p.629-638). Producerea de penicinilaz Neisseria gonorrhoeae (PPNG) sunt -lactamaz pozitive; - rezistena cromosomal Neisseria gonorrhoeae (CMRNG) au CMI >2 g/mL i -lactamaz negative i CMI 2-8 g/mL la tetraciclin; - tetraciclin-rezistena: Neisseria gonorrhoeae (TRNG) au CMI. la tetraciclin >16 g/mL i -lactamaz negativ; Neisseria gonorrhoeae cu rezistena cromosomal la tetraciclin (tetR) are CMI la tetraciclin 2-8 g/mL i CMI la penicilin <1 g/mL; - quinolone rezistena Neisseria gonorrhoeae (QRNG) au CMI la ciprofloxacin > 1g/mL; - ceftriaxon rezistena Neisseria gonorrhoeae au CMI > 0.125g/mL; - spectinomicin rezistena Neisseria gonorrhoeae au CMI > 128g/mL. Multirezistena a fost definit:
30

- QRNG i PPNG; QRNG i TRNG;QRNG, PPNG i TRNG. (Martin IMC, Hoffman S, Ison CA. (2006) 58:58793). Au fost izolate 32 tulpini de Neisseria gonorrhoeae de la 26 barbai (81%) i 6 femei (19%) cazuri suspecte de gonoree pe baza definiiei de caz (clinic i epidemiologic), 5 cazuri au fost confirmate numai prin frotiu. apte tulpini au fost -lactamaz pozitiv (testate prin galeriile API NH). Un numr substanial de tulpini au fost rezistente la penicilin (17 din 32) i tetraciclin (19 din 32) (Tabel VII). Pentru penicilin: 7 tulpini (21,8%) de Neisseria gonorrhoeae au avut rezisten nalt corelat cu rezistena plasmidic PPNG, iar 8 tulpini (25%) de Neisseria gonorrhoeae au fost CMRNG i au avut rezisten mediat cromosomal (CMI >1 g/mL) (Tabel IX). CMI 90 cu valoarea 16 g/mL pentru penicilin (propus limita pentru lactamaz pozitiv, CMI 50 cu valoarea de 0.03 g/mL (Tabel VIII). Pentru tetraciclin: 19 tulpini de Neisseria gonorrhoeae au prezentat o rezisten (Tabel VII); 11 tulpini (37.5%) au avut rezisten inalt mediat cromosomal tetR (CMI > 8 g/mL) iar 4 tulpini (12.5%) sunt TRNG (CMI >16 g/mL) au avut rezisten mediat plasmidic (CMI >1 g/mL) (Tabel IX). CMI 90 cu valoarea 32 g/mL, au indicat o rezisten de nivel nalt; CMI 50 cu valoarea de 2 g/mL (Tabel VIII). Pentru ciprofloxacin: 11 tulpini (34.4%) de Neisseria gonorrhoeae au avut rezisten inalt (tabelul VII), sunt QRNG (CMI > 1 g/mL) (tabelul IX), 9 tulpini (28,1%) au prezentat o reducere a sensibilitatii la ciprofloxacin. CMI 90 cu valoarea 32 g/mL, au indicat o rezisten de nivel nalt; CMI 50 cu valoarea de 0.06 g/mL (Tabel VIII). Pentru ceftriaxon: 1 tulpin (3,1%)de Neisseria gonorrhoeae a prezentat o reducere a sensibilitii (Tabel VII), Concentraia care definete reducerea sensibilitii (CMI > 0.125 g/mL) (tabelul IX), 0 tulpini au prezentat rezisten la ceftriaxon. CMI 90 cu valoarea 0.25g/mL , au indicat o rezisten de nivel nalt; CMI 50 cu valoarea de 0.08 g/mL (Tabel VIII). Pentru spectinomicin: 1 tulpin (3,1%) de Neisseria gonorrhoeae a prezentat o reducere a sensibilitii (Tabel VII), Concentraia care definete reducerea sensibilitii (CMI >128
31

g/mL) (tabelul IX), 0 tulpini au prezentat rezisten la spectinomicin. CMI 90 cu valoarea 64g/mL , indic o rezisten de nivel nalt ; CMI 50 cu valoarea de 8 g/mL (Tabel VIII). Rezultatele testrii E-test pentru 32 de tulpini de gononococ sunt prezentate n Tabelul VII.
TABEL VII. Rezultatele testrii prin E-test pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae izolate in perioada 2009-2010 Antibiotic Ceftriaxona Penicilina Tetraciclina Amoxicilina Augmentin Claritromicina Ciprofloxacina Spectinomicin Rezistent % (pozitiv/total) 0 (0/32) 53,1 (17/32) 59,4 (19/32) 43.7 (14/32) 40,6 (13/32) 34,4 (11/32) 34,4 (11/32) 0 (0/32) Intermediar % (pozitiv/total) 3,1 (1/32) 15,6 (5/32) 9,4 (3/32) 21,9 (7/32) 18,8 (6/32) 40,6 (13/32) 28,1 (9/32) 3,1 (1/32) Sensibil % (pozitiv/total) 96.9 (31/32) 31.2 (10/32) 31.2 (10/32) 34,4 (11/32) 40,6 (13/32) 25 (8/32) 37,5 (12/32) 96.7 (31/32)

Criterii de interpretare conform CLSI (2008) n timp ce pentru penicilin, tetraciclin, ceftriaxon i ciprofloxacin sunt criterii clare n ghidul pentru interpretare al sensibilitii (Jones, R. J., T. L. Gavan, C. Thornsberry, et all II. 1989), pentru amoxicilin, augmentin, si claritromicin nu sunt bine definite. Toate cele 7 tulpini -lactamaz pozitiv au fost rezistente la penicilin; producerea de -lactamaz nu a fost corelat cu reducerea sensibilitii la alte antibiotice exceptnd tetraciclina. Un numar mare de tulpini (20 din 32, respectiv 62.5%)au prezentat o reducere a sensibilitii la ciprofloxacin. Determinarea CMI permite nu numai decizii terapeutice mai subtile, ci faciliteaz analiz epidemiologic a rezistenei la agenii antimicrobieni: calculul CMI 50 i CMI 90 (tabelul VIII) sunt concentraiile care inhib 50%, respectiv 90 % din tulpinile testate (concentraia cea mai mic de antibiotic inhibitoare pentru un anumit procent din tulpinile testate). Aceste valori permit orientarea rapid ctre cel mai indicat medicament pentru terapia antimicrobian de prim intentenie.
32

TABEL VIII. CMI 50 i CMI 90 i range-ul CMI de sensibilitate pentru antibioticele testate prin E-test la 32 izolate de Neisseria gonorrhoeae Antibiotic Ceftriaxona Penicilina Tetraciclina Amoxicilina Augmentin Claritromicina Ciprofloxacina Spectinomicin CMI(g/mL ) Limite 0.02-0.25 0.03-3.4 0.25-4 0.047-8 0.02-32 0.016-12 0.02-4 0.064-64 CMI(g/mL) 50% 0.08 0.03 2 0.25 0.25 0.38 0.06 8 CMI(g/mL) 90% 0.25 16 32 16 8 12 32 64

Criterii de interpretare conform CLSI (2008)

Acest studiu a urmrit optimizarea diagnosticului microbiologic al gonoreei cu implementarea controlului de calitate al testrii sensibilitii la antibiotice prin E-test, ntr-un laborator judeean , facnd parte a programului naional de supraveghere, conform criteriilor OMS. Rezistena inalt (53.1%) a tulpinilor izolate de Neisseria gonorrhoeae la penicilin, combinat; cromosomal (25%) i plasmidic (21.8%) i la tetraciclin (59.4%): cromosomal (37.5%) i plasmidic (12.5%) sunt comparabile cu rezultatele obinute n unele ri din vestul Europei : - Belgia: la tetraciclin (48.4%) : cromosomal (35.9%) i plasmidic (12.5%); - Portugalia: la penicilin plasmidic (11.8%) i la tetraciclin (70.6%) : cromosomal (35.3%) i plasmidic (35.3%); - Austria: la penicilin, combinat (18.9%): cromosomal (3.1%) i plasmidic (15.6%) i la tetraciclin (47.9%): cromosomal (46.9%) (Martin IMC, 2006).

33

TABEL IX: Rata de rezisten la antibiotice i gradele de comparaie cu alte state Europene, Japonia si Australia pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae testate prin metoda E-test
Ceftriaxona % QRNG % CMRNG % PPNG % TRNG % Tet R %

Austria Belgia Danemarca Anglia Frana Grecia Italia Olanda Portugalia Scoia Spania Suedia Japonia Australia Romnia (jud Suceava)

0 0 0 0 0 0 4.8 0 0 0 0 1 30,3 0

53.1 46.9 46 12 32.7 7.6 33.3 16 17.6 30.3 15.2 48 78.3 38 34,4

3.1 10.9 11.2 8 10.9 3.8 9.5 0 0 17.2 2.2 7.3 59.3 34 25

15.6 4.7 1 1 15 8.9 9.5 8.6 11.8 7.1 6.5 9.6 1 21,8

1 12.5 5.1 6 6.7 6.3 0 8.6 35.3 1 6.5 8.3 2.2 12 12,5

46.9 35.9 43.9 20 57.4 40.5 42.9 33.3 35.3 25.3 43.5 40.6 68.8 37.5

Rezistena nalt a fost corelat cu rezistena mediat plasmidic iar rezistena moderat/intermediar a fost corelat cu rezistena mediat cromosomal. Criteriile utilizate sunt cele ale CLSI (Jones, R. J., T. L. Gavan, C. Thornsberry, P. C. Fuchs, E. H. Gherlach, J. S. Knapp, P. Murray, and J. A. Washington II. 1989).

Scderea sensibilitii la antibiotice, n special penicilin i tetraciclin (68.7%) comparabil cu descresterea sensibitii tulpinilor raportat n Asia (74.3% la penicilina i 98.4% la tetraciclin); America (90% la penicilin i 100% la tetraciclin); Africa (100% la penicilin i 91.7% la tetraciclin) (T. Berglund, M. Unemo, P. OLcen, et all 2002; 13: 109-114); Rusia (76% la penicilin i 92% la tetraciclin) ( A.Kubanova, N. Frigo, A. Kubanov, et all 2008; 84:285-289, V. Vorobieva, N. Firsova, et all 2007:83:133-13) ( S. Berron, J. A. Et all .2000 September; 44(9):2543-2544). Un numr mare de tulpini de Neisseria gonorrhoeae, respectiv 62.5%, au fost rezistente la ciprofloxacin (34.4% rezistena nalt (QRNG) i (28.1%) cu o scdere a sensibilitii ; rezultat ce nu-l mai recomand ca tratament pentru gonoree n regiunea noastr,
34

utilizarea sa fiind indicat numai dup efectuarea antibiogramei i demonstrarea sensibilitii izolatelor. n alte zone sunt raportate s-au nregistrat frecvene diferite, dup cum urmeaz: Asia (63%); Europa de Vest (Austria 53.1%, Belgia 46.9% Suedia 48%); America (7.7%); Africa (0%) (T. Berglund, M. Unemo, P. OLcen, et all 2002; 13: 109-114); Rusia (50%) (A.Kubanova, N. Frigo, A. Kubanov, et all 2008; 84:285289); India (86.6%) (Manju B., et all 2007); Australia (50%) (Tapsall, J. W., Limnios, M. & Schultz, T. (1998); 8, 4157.); Japonia (81.6%) (Ito M, Deguchi T, Mizutani KS, et al. (2005) 49:13743.); China (94.3%), valori comparabile cu cele din vestul Europei (Fig. 19). Pn n prezent tulpinile de Neisseria gonorrhoeae au dezvoltat o rezisten crescut la penicilin, tetraciclin, quinolone n diferite ri (India, China, Japonia) punnd o serioas problem de management n gonoree Manju B., et all 2007 (Stathi M, et all (2006) 57:7759. Tapsall JW (2005) (Suppl 4): S2638).
Asia (Martin IMC,2006) 63 53,1 46,9 48 50 86,6 50 81,6
0 20 40 % 60 80 100

Austria (Martin IMC,2006) Belgia (Martin IMC,2006) Suedia (Martin IMC,2006) Rusia (Kubanova A,2006) India (Manju B,2007) Australia (Tapsall JW,1998) Japonia (Ito M,2005)

Fig. 19. Rezistena de nivel nalt nregistrat pentru ciprofloxacin, pentru tulpini de N. gonorrhoeae, n diferite regiuni de pe glob, conform studiilor citate in literatur.

La ceftriaxon nu am izolat nicio tulpin rezistent iar o tulpin a fost moderat sensibil n timp ce n alte regiuni au fost raportate tulpini ca rezistente, intre 3% (Rusia) i 30% in Japonia (Tabel. IX) raportate: Suedia (1% ), Italia (4.8%), America (semnalate sporadic); Africa (13%) ( T. Berglund, M. Unemo, P.
35

OLcen, et all 2002; 13: 109-114); Rusia (3%) (A.Kubanova, N. Frigo, A. Kubanov, et all 2008; 84:285-289); India(5.5%) ( Manju B., et all 2007); Japonia (30.3%) (Ito M, Deguchi T, Mizutani KS, et al. (2005) 49:13743); Italia (4.8%), (T. Berglund, M. Unemo, P.OLcen, et all 2002; 13: 109-114); Suedia (1%) (Martin IMC, Hoffman S, Ison CA. (2006) 58:58793.), (Fig. nr. 20) (tabelul IX).
Italia (Kubanova A,2006)
4,8

America (sporadic)
13

Dat e di n lit erat ur a pr ivin d rezi sten te de nive l scazu t

3 5,5 30,3 4,8 1

Africa (Kubanova,2006) Rusia (Kubanova A,2006) India (Manju B,2007)

10

15 %

20

25

30

35

Japonia (Ito M,2005) Italia (Martin IMC,2006)

Fig. 20: Rezistena de nivel sczut pentru ceftriaxon, pentru tulpini de N. gonorrhoeae, n diferite regiuni de pe glob.

Reducerea sensibilitii la cefalosporine de a 3-a generaie folosite n prima linie a fost raportat n unele ri: China, India (Manju B., et all 2007, Tapsall JW (2005) 41(Suppl 4): S2638, Rahman M, Sultan Z, Monira S, et al. (2002) 40:203740). n Romnia nu exist o raportare a profilului rezistenei prin deteminarea CMI la antibiotice prin E-test a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae . Nu am izolat nicio tulpin de Neisseria gonorrhoeae rezisten la spectinomicin, CMI 50 a fost de 8 g/mL, iar pentru CMI 90 am nregistrat o valoare de 64 g/mL. Datorit pstrrii sensibilitii la acest antibiotic, o singur doz, de 2 g este considerat util, tratamentul de prim linie n zona noastr. Au fost raportate tulpini rezistente n rile Pacificului de Vest (Martin IMC, Hoffman S, Ison CA. (2006) 58:58793). Continuarea supravegherii rezistenei la antibiotice a Neisseria gonorrhoeae este esenial, monitorizarea emergenei i rspndirii rezistenei la antibiotice este baza raional pentru instituirea tratamentului sindrom (Manju B., et all 2007, WHO.
36

(2001) Geneva: World Health Organization, Simonsen GS, Tapsall JW, Allegranzi B, et al. (2004) 82:92834) i meninerea eficacitii tratamentului (WHO. (2001) Geneva: World Health Organization, Tapsall JW. (2003) 27:S704). Controlul gonoreiei este complex i dificil cere integrarea multidisciplinar pentru stabilirea antibioticelor incluse (Tapsall JW (2001) Geneva: World Health Organization). Programele de supraveghere sunt necesare datorit dificultilor de cultivare i instalarea rezistenei rapide a gonococului (WHO. (2001) Geneva: World Health Organization, Roy K, Wang SA, Meltzer MI. (2005) 11:126573).
Rezistenta la antibiotice n perioada 2004-2010
100% rezistenta n valori procentuale 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1,6% 2004 0% 2005 0% 2006 ani 0% 2008 0% 2009 0% 2010 76% 69% 61% 87% 75% 62% 59% 56% 57% 50% 42% 37% 66% 58% 50% 41% 60% 55% 40% 35%
Penicilina Amoxicilina Augmentin Claritromici na Tetraciclina Ceftriaxon

Fig. 21. Rezistenele la antibiotice a tulpinilor de Neiseria gonorrheoae izolate n jud. Suceava in perioada 2004-2010.

3.1.4. Concluzii: n zona noastr penicilina, tetraciclina, ciprofloxacina, claritromicina, amoxicilina i augmentinul nu pot fi folosite n tratamentul gonoreei, dect dup rezultatul testrii la antibiotice. Trendul rezistenei la antibiotice n judetul Suceava, n perioada 2004-2010 a fost pentru fiecare din antibioticele utilizate - rezistena la penicilin prin producerea de beta-lactamaz a fost de 61% n 2004 la 50% in 2008 i de 20% n 2010; - rezistena la penicilina inclisiv rezistenta cromosomala a scazut de la 69% n 2004 la 60% n 2010;
37

- rezistena ciprofloxacin a crescut de la 53% n 2004 la 66% in 2009 i de 40% n 2010; - rezistena ceftriaxona de la de la 1,6% n 2004 ,nu s-a mai izolat nicio tulpina rezistenta pn n 2010; - rezistena tetracicin a crescut de la 76% n 2004 la 87% in 2005 i apoi a scazut la 60% n 2010; - rezistena claritromicin a sczut de la 69% n 2004 la 58% in 2009 i de 35% n 2010; - rezistena la amoxicilin a sczut de la 69% n 2004 la 50% in 2009 i de 40% n 2010; n Romnia, optimizarea, standardizarea i controlul de calitate al testrii sensibilitii la antibiotice a gonococului nu este nc bine stabilit n multe laboratoare. Continuarea la nivel regional i naional a supravegherii sensibilitii la antibiotice este crucial in detectatea emergenei noilor rezistente, monitorizarea variaiei pattern-urilor de sensibilitate face posibil adaptarea tratamentului. Evoluia sensibilitii la cefalosporine trebuie monitorizat obligatoriu, (fiind singura clas de antibiotice disponibil n momentul de fa pentru terapia sindromic n uretrita gonococic), pentru surprinderea apariiei tulpinilor rezistente. Sunt necesare studii microbiologice, inclusiv prin utilizarea markerilor de epidemiologie molecular, stabilirea mecanismelor de rezistena i a modului lor de transmitere. Capitolul 4 4.1. Screening-ul pentru detecia Neisseria gonorrhoeae prin Real Time PCR, la paciente cu sindrom imflamator pelvin 4.1.1. Lotul de studiu n perioada februarie martie 2011 au fost testate 100 de paciente cu sindrom inflamator pelvin. Tabel X: Repartiia pacientelor pe grupe de vrst: Grupa de vrst Numr paciente 20 - 30 37 30 - 40 29 40 - 50 19 > 50 15
38

4.1.2. Cuantificarea absolut utiliznd tehnica Real Time PCR Real time PCR permite cuantificarea probei pe baza semnalului fluorescent, n timpul fazei exponeniale de amplificare, naintea limitrii cantitii de reactivi, a acumulrii inhibitorilor sau a inactivrii polimerazei. Citirea fluorescent la un ciclu precoce de amplificare este mai eficient i mai reproductibil dect metoda end point. Determinarea numrului de cpii n probele testate a fost realizat n Laboratorul de Virusologie Molecular Disciplina de Studiu Microbiologie, UMF Grigore T. Popa, Iai, cu ajutorul termocyclerului Strategene Mx3005p. 4.1.3. DETECTIA N. GONORRHOEAE PRIN RT-PCR Detecia Neisseria gonorrhoeae a fost realizat utiliznd tehnica Real Time PCR (cu kitul PrimerDesign) i a presupus respectarea urmatoarelor etape de lucru: 4.1.3.1. Recoltarea i transportul probelor; 4.1.3.2. Purificarea ADN / N. gonorrhoeae; 4.1.3.3. Cuantificarea absolut utiliznd tehnica Real Time PCR. 4.1.3.1. Probele au fost recoltate de la nivelul endocolului cu ajutorul tampoanelor E - Swab / Copan Innovation, care permit analiza probei ADN dintr-un ml lichid de transport; acest mediu de transport este certificat ca fiind ADN/ARN free. Cele 100 de probe au fost testate n 5 sesiuni diferite de lucru: I. probele 1 10; II. probele 11 40; III.probele 41 50; IV.probele 51 70; V. probele 71 100. 4.1.3.2 Purificare Purificarea ADN / N. gonorrhoeae Etapele de lucru pentru purificarea ADN-ului bacteriilor gram negative, utiliznd kitul PrimerDesign PrecisionTM Gram Negative Bacterial DNA extraction:
39

1.SETAREA PLACUTII

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

Sesiunea V
Fig. 22 Setarea plcuelor

40

Fig 23 Setarea profilului termic

Profilul termic prezint 1 segment cu 1 ciclu de amplificare i un al doilea segment cu 50 de cicluri. Curbele de amplificare obinute n cele 5 sesiuni de lucru

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

41

Sesiunea V
Fig 24 Curbele de amplificare

Validarea experimentelor: verificarea parametrilor curbelor standard

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

42

Sesiunea V
Fig. 25 Verificarea parametrilor curbelor standard

Analiza rezultatelor obinute: numrul de cpii ADN / gonococ detectate

Sesiunea I

Sesiunea II

Sesiunea III

Sesiunea IV

43

Sesiunea V
Fig. 26 Analiza rezultatelor: numr cpii ADN/gonococ detectate

5.1. Evaluarea datelor qPCR Dup finalizarea fiecrei sesiuni de lucru, se realizeaz analiza datelor obinute. Aceast analiz presupune urmtoarele etape: corecia baseline; setarea threshold cycle; verificarea controalelor negative / pozitive; verificarea probelor necunoscute; realizarea analizei specifice a experimentului: curba standard - cuantificarea absolut / parametri; cuantificarea relativ; curba de melting / topire. Baseline este ciclul iniial n RTPCR cnd se poate observa o mic schimbare n semnalul fluorescent, de obicei regsindu-se la ciclurile 3-15. Threshold cycle / Ct primul ciclul PCR la care fluorescena msurat de instrument este determinat peste nivelul semnalului de fond (back-ground) Parametrii unei curbe standard realizat corect sunt: o eficien nalt: 90% - 110%; o precizie bun: 0,985 1,00;40 o variabilitate sczut ntre standarde.
44

Toate cele cinci sesiuni de cuantificare absolut au fost validate prin verificarea martorilor (controale negative, controale pozitive, controale interne de extracie a ADN-ului, controalele care au verificat recoltarea corect a probelor). Corecia base-line a fost iniial calculat de soft-ul Stratagene MX3005P, iar apoi a fost stabilit manual, n funcie de parametrii optimi ai curbelor standard. n funcie de eficiena reaciei RT PCR, am considerat o prob pozitiv pentru N. gonorrhoeae pentru un Ct 40 (Tevfik Dorak M., (editor) Real Time PCR, BIOS Advanced Methods, Data analysis and reporting, pg. 39 62). Astfel, s-au obinut 11 rezultate pozitive, respectiv 11%, repartizate pe sesiuni de lucru, conform tabelului XI:
Tabel XI: Numrul probelor pozitive pentru N. gonorrhoeae:

Sesiune de lucru I II III IV V Total

Numr probe cu Ct 40 0 9 0 0 2 11 / 100 probe pozitve

6.1. Discuii: Uitlizarea n ultima decad a tehnicilor de biologie moleculara pentru detercatrea infeciilor asimptomatice ne-a determinat s iniiem primul studiu de acest fel din Romnia pentru diagnosticarea prin RT-PCR a cazurilor de ingecie gonococic, la paciente cunsocute cu BIC, La nivel mondial, studiile care au utilizat diverse sisteme Real Time PCR pentru a evalua prevalenta infeciei cu Neisseria gonorrhoeae au detectat diverse valori (tabel XII), variind ntre 0.006% i 19% (Sakem B. et all 2011, Tevfik Dorak M, Soni S, et all. 2010, Whiley DM, et all 2005, Gaydos CA, et all 2010, Reyes PA et all 2007, Hjelmevoll SO et all 2008, Mangold KA et all 2007, Geraats-Peters CW et all 2005, Whiley DM et all 2004, Tabrizi SN et all 2004, Whiley DM et all 2002).
45

Studiile care au utilizat diverse sisteme Real Time PCR pentru a evalua prevalena infeciei cu Neisseria gonorrhoeae au detectat diverse valori (tabel XII), variind ntre 0.006% i 19%.
Tabel XII: Prevalena N. gonorrhoeae evaluat cu diferite sisteme RT PCR (Sakem B. et all 2011 Apr 27, Tevfik Dorak M, Soni S, et all. 2010, Whiley DM, et all 2005, Gaydos CA, et all 2010, Reyes PA et all 2007, Hjelmevoll SO et all 2008, Mangold KA et all 2007, Geraats-Peters CW et all 2005, Whiley DM et all 2004, Tabrizi SN et all 2004, Whiley DM et all 2002) Nr. crt 1 2 3 4 5 6 7 Prevalenta gonococ 0,006 0,2 16,7 1.7 17,4 0,84 3,8 16 8 9 10 30 3 19 An publicare 2011 2011 2010 2010 2008 2008 2007 2007 2005 2004 2004 Tara Elvetia Spania USA Anglia Norvegia Austria USA Rusia Olanda Australia Australia Autor Sakem B Corbeto EL Gaydos CA Hopkins MJ Hjelmevoll SO SchabereiterGurtner C Mangold KA Shipitsyna E Geraats-Peters CW Whiley DM Whiley DM Sistemul RT PCR utilizat Abbott Diagnostics in house Abbott RealTime CT/NG Roche COBAS Taqman CT in house COBAS AMPLICOR COBAS Amplicor Real-time nucleic + (NASBA) COBAS AMPLICOR TaqManABI7500 in house

Dei preul pentru detecia /N. gonorrhoeae /prob, prin sistemul RT PCR / Taq Man este ridicat (440 RON), avantajul utilizrii acestei metode este reprezentat de sensibilitatea i specificitatea metodei, n comparaie cu metodele clasice de diagnostic. Un alt avantaj al acestei metode este timpul scurt n care se poate detecta prezena gonococului (maxim 4 ore de la recoltare:
46

extracie ADN, amplificare RT PCR), n comparaie cu metodele clasice (24 48 ore). Pe parcursul anilor, muli autori au trecut de la utilizarea metodelor RT PCR in house la utilizarea de sisteme automate RT PCR. Tehnica PCR a demonstrat o sensibilitate, specificiatte, valoare predictiv pozitiv i negativa de 100% n populaia selectat. Studiul prezentat n acest capitol reprezint o premier, deoarece n baza de date PubMed nu am ntlnit nicio referin bibliografic referitoare la testarea prevalenei infeciei gonococice la asimptomatici, utiliznd trusele de la PrimerDesing. Singurele referine, din 2003 i 2005 se refer la testarea infeciei meningococice (Jordens JZ, 2005; Whiley DM, 2003) (Whiley DM, Buda PP, et all. 2005, Jordens JZ, Heckels JE., 2005 ). De asemenea, un alt avantaj al acestor metode este faptul c asigur o alternativa util de amplificare a acizilor nucleici pentru laboratoarele clinice ct i pentru clinicieni (Gaydos CA, Cartwright CP, et all. 2010). Prevalena infeciei cu N. gonorrhoeae a fost 3.8%. Tehnica Real Time PCR poate fi utilizat de asemenea pentru detecia rezistenei N. gonorrhoeae la antibiotice. n 2006, VernelPauillac F (Frana) a remarcat rapida cretere a rezistenei gonoocului la penicilin i, prin urmare, se impune urmrirea fenomenului rezistenei la antibiotice. Acesta a pus la punct o metod Real Time PCR care a detectat o mutaie a genei ponA. Profilul mutaiei obinut prin Real Time PCR a artat o bun corelaie cu paternul sensibilitii la antibiotice obinut prin antibiograma clasic. Tehnica Real Time PCR a demonstrat o acuratee i o reproductibilitate care a fost corespunztoare mutaiei prezente la toate tulpinile de gonococ cu rezisten mediat cromozomal (Vernel-Pauillac F, Hogan TR, Tapsall JW, Goarant C.,2009). n 2009, Vernel-Pauillac F i colaboratorii au raportat utilizarea unui duplex Real Time PCR pentru detecia simultan a mutaiilor gyrA i parC implicate n rezistena gonococului la chinolone . 6.2 Concluzii: - studiul nostru utilizeaz pentru prima dat n ar o metod Real Time-PCR pentru detectarea infeciilor asimptomatice de N. gonorhoeae; - prevalena infeciilor asimptomatice, diagnosticate printr-o metod nalt sensibil i specific este de 11%;
47

prevalena de 11% se ncadreaz n datele din literatur, care semnleaz valori cuprinse ntre 0.006% i 19 %; studiul prezentat n acest capitol reprezint o premier, deoarece n baza de date PubMed nu am ntlnit nicio referin bibliografic referitoare la testarea prevalenei infeciei gonococice la asimptomatici, utiliznd trusele de la PrimerDesing. Singurele referine, din 2003 i 2005 se refer la testarea infeciei meningococice ; detectarea infeciilor asimptomatice prin tehnici de biologie molecular, dei mai scump, comparativ cu metodele clasice de izolare i identificare, are o eficien superioar, ceea ce justific utilizarea ei pentru femeile cu infecie pelvin cronic, n vederea instituirii unei terapii specifice, cunoscnd profilul de rezisten la antibiotice n zona studiat, determinat prin metode fenotipice sau/i genotipice.

Bibliografie selectiva A.Kubanova, N. Frigo, A. Kubanov, et all. 2008; 84:285-289. National surveillance of antimicrobial susceptibility in Neisseria gonorrhoeae in 2005-2006 and recommendations of first-line antimicrobial drugs for gonorrhoea treatment in Rusia. Allan L.Truant.2002, ISBN: 1-55581-189-2, Pages: 40. Manual of Commercial Methods in Clinical Microbiolog. Alexander S, Coelho da Silva F, Manuel R, Varma R, Ison C., Evaluation of strategies for confirming Neisseria gonorrhoeae nucleic acid amplification tests. J Med Microbiol. 2011; 60: 90912. Binnicker MJ, Williams RD, Apicella MA., Infection of human urethral epithelium with Neisseria gonorrhoeae elicits an upregulation of host anti-apoptotic factors and protects cells from staurosporine-induced apoptosis., Cell Microbiol. 2003;5(8):54960. CDC-Gonoccal Isolate Surveillance Project GISP=-1999, US Dep. of Health and Human Services. Chalkley, L. J., van Rensburg, J. et all. (1997) 40, 81722.Plasmid analysis of Neisseria gonorrhoeae isolates and dissemination of tetM genes in Southern Africa 1993-1995.Journal of Antimicrobial Chemotherapy.
48

Centers for Disease Control and Prevention. (2007) 56:3326. Update to CDC's Sexually Transmitted Treatment Guidelines, 2006: fluoroquinolones no longer recommended for treatment of gonococcal infections. MMWR (2007). Corbeto EL, Lugo R, Martr E, Falguera G, Ros R, Avecilla A, Coll C, Saludes V, Casabona J., Prevalence and determining factors of acquiring C. trachomatis infection among adolescents and young adults in Catalonia., Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(2):96-101. Chui L, Chiu T, Kakulphimp J, Tyrrell GJ., A comparison of three real-time PCR assays for the confirmation of Neisseria gonorrhoeae following detection of N. gonorrhoeae using Roche COBAS AMPLICOR., Clin Microbiol Infect. 2008 Hjelmevoll SO, Olsen ME, Sollid JU, Haaheim H, Unemo M, Skogen V., A fast real-time polymerase chain reaction method for sensitive and specific detection of the Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene., J Mol Diagn. 2006;8(5):574-81. D. Buiuc, M. Negu ,Tratat de microbiologie clinica 2008, p.629638. Centers for Disease Control and Prevention. (2007) 56:3326. Ito M, Deguchi T, Mizutani KS, et all. (2005) 49:13743. Lack of nationwide surveillance of antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae in Japan. Gerbase AC, Rowley JT, Heymann DH, et all. Global prevalence and incidence estimates of selected curable STDs. Sex Transm Infect (1998) 14:S126. Gill, M. J., Simjee, S., Al-Hattawi, K., Robertson, B. D., Easmon, C. S. F. & Ison, C. A. (1998). Gonococcal resistance to -lactams and tetracyclines involves mutation in loop 3 of the porin encoded at the penB locus.Antimicrobrobial Agents and Chemotherapy 42, 2799803. Gordon, S. M., Carlyn, C. J., Doyle, L. J., Knapp, C. C., Longworth, D. L., Hall, G. S. et al. (1996). The emergence of Neisseria gonorrhoeae with decreased susceptibility to ciprofloxacin in Cleveland, Ohio: epidemiology and risk factors. Annals of Internal Medicine 125, 46570. Gill, M. J., Simjee, S., Al-Hattawi, K., Robertson, B. D., Easmon, C. S. F. & Ison, C. A. (1998). Gonococcal resistance to -lactams
49

and tetracyclines involves mutation in loop 3 of the porin encoded at the penB locus.Antimicrobrobial Agents and Chemotherapy42, 2799803. Global strategy for the prevention and control of sexually transmitted infections: 20062015, 2006. Gaydos CA, Cartwright CP, Colaninno P, Welsch J, Holden J, Ho SY, Webb EM, Anderson C, Bertuzis R, Zhang L, Miller T, Leckie G, Abravaya K, Robinson J., Performance of the Abbott RealTime CT/NG for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae., J Clin Microbiol. 2010;48(9):3236-43. Goire N, Nissen MD, LeCornec GM, Sloots TP, Whiley DM., A duplex Neisseria gonorrhoeae real-time polymerase chain reaction assay targeting the gonococcal porA pseudogene and multicopy opa genes., Diagn Microbiol Infect Dis. 2008;61(1):61. Geraats-Peters CW, Brouwers M, Schneeberger PM, van der Zanden AG, Bruisten SM, Weers-Pothoff G, Boel CH, van den Brule AJ, Harmsen HG, Hermans MH., Specific and sensitive detection of Neisseria gonorrhoeae in clinical specimens by real-time PCR., J Clin Microbiol. 2005 Jones, R. J., T. L. Gavan, C. Thornsberry, P. C. Fuchs, E. H. Gherlach, J. S. Knapp, P. Murray, and J. A. Washington II. 1989. Standardization of disk diffusion and agar dilution susceptibility tests for Neisseria gonorrhoeae: interpretative criteria and quality control guidelines for ceftriaxone, penicillin, spectinomycin, and tetracycline. J. Clin. Microbiol. 27:2758-2766. John Tapsall is with the World Health Organization Collaborating Centre for Sexually Transmitted Diseases, Department of Microbiology, Prince of Wales Hospital, Sydney, Australia CMAJ , 2009. Jordens JZ, Heckels JE., A novel porA-based real-time PCR for detection of meningococcal carriage., J Med Microbiol. 2005;54( 5):463-6. Koenig MG, Kosha SL, Doty BL, Heath DG., Direct comparison of the BD ProbeTec ET system with in-house LightCycler PCR assays for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae from clinical specimens., J Clin Microbiol. 2004;42(12):5751-6.
50

Kimmitt PT, Kirby A, Perera N, Nicholson KG, Schober PC, Rajakumar K, Chapman CA., Identification of Neisseria gonorrhoeae as the causative agent in a case of culture-negative dermatitis-arthritis syndrome using real-time PCR. Manju B.*, Krishna R., S. M. Gupta, Sumathi M. and R. K. Jain Changing trends of antimicrobial susceptibility patterns of Neisseria gonorrhoeae in India and the emergence of ceftriaxone less susceptible N. gonorrhoeae strains. Regional STD Teaching Training and Research Centre, Vardhman Mahavir Medical College and Safdarjang Hospital, New Delhi, India. Martin IMC, Hoffman S, Ison CA. European surveillance of sexually transmitted infections (ESSTI): the first combined antimicrobial susceptibility data for Neisseria gonorrhoeae in Western Europe. J Antimicrobial Chemother (2006) 58:58793. Moodley, P., Hoppenbrouwers, J., Bohlken, L. & Sturm, A. W. (2001). Emergence of TetM-mediated tetracycline resistance in rural South Africa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48, 1423. Mangold KA, Regner M, Tajuddin M, Tajuddin AM, Jennings L, Du H, Kaul KL., Neisseria species identification assay for the confirmation of Neisseria gonorrhoeae-positive results of the COBAS Amplicor PCR., J Clin Microbiol. 2007;45(5):1403-. Marshall R, Chernesky M, Jang D, Hook EW, Cartwright CP, Howell-Adams B, Ho S, Welk J, Lai-Zhang J, Brashear J, Diedrich B, Otis K, Webb E, Robinson J, Yu H., Characteristics of the m2000 automated sample preparation and multiplex real-time PCR system for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae., J Clin Microbiol. 2007;45(3):747-51. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2008). Performance Standard for Antimicrobial Susceptibility Testing: Eighteenth Informational Supplement M2A9 end M7-A7.. NCCLS, Villanova, PA. Ochiai S, Sekiguchi S, Hayashi A, et all. Decreased affinity of mosaic-structure recombinant penicillin-binding protein 2 for oral cephalosporins in Neisseria g Manual of Clinical Microbiology. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover & R.H. Yolken (eds). 7th ed., ASM
51

Pope CF, Hay P, Alexander S, Capaldi K, Dave J, Sadiq ST, Ison CA, Planche T., Positive predictive value of the Becton Dickinson VIPER system and the ProbeTec GC Q x assay, in extracted mode, for detection of Neisseria gonorrhoeae., Sex Transm Infect. 2010;86(6):465-9. *** PrimerDesign PrecisionTM Gram Negative Bacterial DNA extraction handbook; *** PrimerDesign genesig Kit for quantification of Gonorrhoeae (N. gonorrhoeae), Primer Design handbook; *** PrecisionTM 2X qPCR Mastermix handbook, Primer Design LTD, handbook; *** Introduction to Quantitative PCR, Stratagene, Methods and Application Guide; P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover & R.H. Yolken (eds). 7th ed., ASM Press, Washington, D.C, 1999, p.336-338. Neisseria gonorrhoeae J Antimicrob Chemother (2007) 60:5460. Prashini Moodley, Chinsamy Pillay, Rabia Goga, Ayesha B. M. Kharsany and A. Willem Sturm, 9. Rahman M, Sultan Z, Monira S, et all. Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae isolated in Bangladesh (1997 to 1999): rapid shift to fluoroquinolone resistance. J Clin Microbiol (2002) 40:203740. Roy K, Wang SA, Meltzer MI. Optimizing treatment of antimicrobial resistant Neisseria gonorrhoeae. Emerg Infect Dis (2005) 11:126573. Retsema, J. (1999). Susceptibility and resistance emergence studies with macrolides. International Journal of Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11, Suppl. 1,S1521 discussion S312. Retsema, J. A., Brennan, L. A. & Girard, A. E. (1991). Effects of environmental factors on the in vitro potency of azithromycin. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 10, 83442. Rockett R, Goire N, Limnios A, Turra M, Higgens G, Lambert SB, Bletchly C, Nissen MD, Sloots TP, Whiley DM., Evaluation of the cobas 4800 CT/NG test for detecting Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae., Sex Transm Infect. 2010;86(6):4703.
52

Stathi M, Flemetakis A, Miriagou V, et al. Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in Greece: data for the years 19942004. J Antimicrob Chemother (2006) 57:7759. Simonsen GS, Tapsall JW, Allegranzi B, et all. The antimicrobial resistance containment and surveillance approacha public health tool. Bull World Health Organ (2004) 82:92834. Schito, G. C., Mannelli, S. & Pesce, A. (1997). Trends in the activity of macrolide and beta-lactam antibiotics and resistance development. Alexander Project Group. Journal of Chemotherapy 9, Suppl. 3, 1828. S. Berron, J. A.Vazquez, M. J. Gimenez, L. de la Fuente, and L. Aguilar In Vitro Susceptibilies of 400 Spanish Isolates of Neisseria gonorrhoeae to Gemifloxacin and 11 Other Antimicrobial Age. Soni S, Alexander S, Verlander N, Saunders P, Richardson D, Fisher M, Ison C., The prevalence of urethral and rectal Mycoplasma genitalium and its associations in men who have sex with men attending a genitourinary medicine clinic., Sex Transm Infect. 2010;86(1):21-4. Shipitsyna E, Zolotoverkhaya E, Hjelmevoll SO, Maximova A, Savicheva A, Sokolovsky E, Skogen V, Domeika M, Unemo M., Evaluation of six nucleic acid amplification tests used for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia compared with an international strictly validated real-time porA pseudogene polymerase chain reaction., J Eur Acad Dermatol Venereol. 2009;23(11):1246-53. Schabereiter-Gurtner C, Hufnagl P, Sonvilla G, Selitsch B, Rotter ML, Makristathis A, Hirschl AM., Evaluation of a novel internally controlled real-time PCR assay targeting the 16S rRNA gene for confirmation of Neisseria gonorrhoeae infections., Clin Microbiol Infect. 2008;14(5):480-6. Tapsall JW. Antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae. Clin Infect Dis (2005) 41(Suppl 4):S2638. Tapsall JW. Monitoring antimicrobial resistance for public health action. Commun Dis Intell (2003) 27:S704. Tapsall JW. Antimicrobial resistance n Neisseria gonorrhoeae WHO/CDS/CSR/DRS/2001.3. (2001) Geneva: World Health Organization.
53

Tapsall J. Antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae is diminishing available treatment options for gonorrhea: some possible remedies. Expert Rev Anti Infect Ther (2006) 4:61928. Tanaka M, Nakayama H, Huruya K, et all. Analysis of mutations within multiple genes associated with resistance in a clinical isolate of Neisseria gonorrhoeae with reduced ceftriaxone susceptibility that shows a multidrug-resistant phenotype. Int J Antimicrob Agents (2006) 27:206. Tapsall JW, Ray S, Lo JYC, et al. Distribution of a cephalosporinresistant sequence type of Neisseria gonorrhoeae with a mosiac PBP2 associated with treatment failure in the Asia-Pacific region, poster presentation, abstract P052. Programme and abstracts of the 16th International Pathogenic Neisseria Conference; 2008; 712; Rotterdam, Netherlands. Tapsall, J. W., Limnios, M. & Schultz, T. (1998). Continuing evolution of the pattern of quinolone resistance in Neisseria gonorrhoeae isolated in Sydney, Australia. Sexually Transmitted Diseases 8, 4157. Tanaka, M., Matsumoto, T., Kobayashi, I., Uchino, U. & Kumazawa, J. (1995). Emergence of in vitro resistance to fluoroquinolones in Neisseria gonorrhoeae isolated in Japan. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39, 236770. Thornsberry, C., Jaffee, H., Brown, S. T., Edwards, T., Biddle, J. W. & Thompson, S. E. (1977). Spectinomycin-resistant Neisseria gonorrhoeae. Journal of the American Medical Association 22, 24056. T. Berglund, M. Unemo, P. OLcen, J. Giesecke and H. Freulund One Yar of Neisseria gonorrhoeae isolates in Sweden: prevalence study of antibiotic susceptibility shows relation to the geographic area of exposure.. Inernational Journal of STD&AIDS 2002; 13: 109-114. T. Fekete, J. Woodwell, and Kenneth R. Cundy Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae to Cefpodoxime: Determination of MICs and Disk Diffusion Zone Diameters. Tabrizi SN, Chen S, Cohenford MA, Lentrichia BB, Coffman E, Shultz T, Tapsall JW, Garland SM., Evaluation of real time polymerase chain reaction assays for confirmation of Neisseria
54

gonorrhoeae in clinical samples tested positive in the Roche Cobas Amplicor assay., Sex Transm Infect. 2004;80(1):68-71. Tevfik Dorak M., (editor) Real Time PCR, BIOS Advanced Methods, Data analysis and reporting, pg. 39 - 62. Unemo M, Olcn P, Fredlund H, Thulin S., Real-time PCR and subsequent pyrosequencing for screening of penA mosaic alleles and prediction of reduced susceptibility to expanded-spectrum cephalosporins in Neisseria gonorrhoeae., APMIS. 2008;116(11):1004-8. Vernel-Pauillac F, Hogan TR, Tapsall JW, Goarant C., Quinolone resistance in Neisseria gonorrhoeae: rapid genotyping of quinolone resistance-determining regions in gyrA and parC genes by melting curve analysis predicts susceptibility., Antimicrob Agents Chemother. 2009;53(3):1264-7. Vernel-Pauillac F, Falcot V, Whiley D, Merien F., Rapid detection of a chromosomally mediated penicillin resistance-associated ponA mutation in Neisseria gonorrhoeae using a real-time PCR assay., FEMS Microbiol Lett. 2006;255(1):66-74. V. Vorobieva, N. Firsova, T. Ababkova, I. Leniv, Bjorg C. Haldorsen, M. Unemo and V. Skogen Antibiotic susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in Arkhangelsk, Rusia. Sexually Transmitted infections 2007:83:133-13. WHO. Management of Sexually Transmitted Diseases (1997) Geneva: WHO. 37. Document no. WHO/GPA/TEM94./Rev.1. WHO. Global Surveillance Network for Gonococcal Antimicrobial Susceptibility (1990) Geneva: WHO. WHO/VDT/90-452. WHO/CDS/CSR/DRS/2001.5. (2001) Geneva: World Health Organization Whiley DM, Limnios EA, Ray S, et al. Diversity of penA alterations and subtypes of Neisseria gonorrhoeae less susceptible to ceftriaxone from Sydney, Australia. Antimicrob Agents Chemother (2007) 51:31116. Workowski KA, Berman SM, Douglas JM Jr. Emerging antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: urgent need to strengthen prevention strategies. Ann Intern Med 2008;148:60613. Wong WW, Huang CT, Li LH, et all. Molecular epidemiological identification of Neisseria gonorrhoeae clonal clusters with
55

distinct susceptibility profiles associated with specific groups at high risk of contracting human immunodeficiency virus and syphilis. J Clin Microbiol 2008;46:3931-4. Whiley DM, Sloots TP., Comparison of three in-house multiplex PCR assays for the detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis using real-time and conventional detection methodologies., Pathology. 2005;37(5):364-70.

Lista cu articole publicate


Revista Medico-Chirurgicala a Societatii de medici si naturalisti din Iasi Nr 113(2009) Nr.4: 1. Monitorizarea incidentei infectiei cu Neisseria gonorrhoae si a rezistentei acestuia in judetul Suceava . Revista Medico-Chirurgicala a Societatii de medici si naturalisti din Iasi Nr 114(2010) Nr.4: 2. Determinari cantitative prin E test pentru evaluarea rezistenei la antibiotice a Neisseria gonorrhoae . 3. Neisseria gonorrhoeae detection through Real-Time PCR in asymptomatic pacients(propunere 09.2011).

14.10.2011 Filipiuc

drd. Silvia

56

CURRICULUM VITAE
Nume i prenume: Filipiuc Silvia Data i locul naterii: 31.07.1962, Rdui, judeul Suceava Domiciliul: B-dul George Enescu, nr. 12, bl. 117, sc.E , ap. 10, SUCEAVA Telefon fix: 0230/522835 Telefon mobil: 0745/261526 Stare civil: cstorit, un copil de 23 ani Studii: absolvent a colii Generale Grniceti, promoia 1977 absolvent a Liceului Sanitar Suceava, promoia 1981 absolvent a Universitii de Medicin i Farmacie Iai, Facultatea de Medicin General, promoia 1987 medic stagiar la Spitalul Orenesc Rdui 1989-1990 medic rezident n specialitatea microbiologie, parazitologie, imunologie prin concurs n perioada 1991-1993, catedra de microbiologie U.M.F. Iai medic specialist n microbiologie, parazitologie, imunologie prin concurs n anul 1994, catedra de microbiologie U.M.F. Iai medic primar medicin de laborator prin Ord. M.S. 694/1998 auditor/evaluator tehnic RENAR 05.2007 doctorand UMF IASI sub indrumarea Prof dr. Iancu Luminita din oct. 2008 Experien profesional: medic specialist microbiolog la D.S.P. Suceava, 1993-1998 medic primar microbiolog la D.S.P. Suceava din 1998 medic ef laborator la D.S.P. Suceava, prin Ord. M.S. 478/13 iunie 2000 (n baza concursului din sesiunea 3 6 iunie 2000) pn n prezent auditor tehnic (al conformitaii cu standardele internaionale ) al laboratoarelor medicale la RENAR din 2006 evaluator tehnic RENAR 2010 Cursuri de perfecionare:

57

perioada 10-24 ianuarie1997 curs de Boli cu transmitere sexual; Diagnostic serologic i microbiologic la Institutul Cantacuzino Bucureti perioada 6 martie 6 iunie, 1998 curs de Actualiti n Parazitologie la U.M.F. Iai Grigore T. Popa perioada 6-9 decembrie 1999, Curs de Hemocultur Metode convenionale i moderne de izolare i identificare la Institutul Cantacuzino Bucureti perioada 27-30 iunie 2001, Curs de Management i Calitate n Laborator la Institutul Cantacuzino Bucureti perioada 26.03 6.04.2001, curs de Citologie la Institutul Oncologic Cluj Napoca perioada 10-12 mai 2001, seminar Metode de referine API i sisteme automate de control bacteriologic, la Institutul Cantacuzino Bucureti perioada 29-30 noiembrie 2002, Mas Rotund cu tema: Deziderate i realizri n supravegherea gravidei pentru profilaxia infeciilor cu transmitere vertical /perinatal, Sibiu perioada 21-22 mai 2003 Curs de Consiliere i testare HIV, Sibiu (Baylor College of Medicine U.S.A.) perioada 7-10 aprilie, 21-24 aprilie 2003, Curs de Formare auditori interni pentru laboratoare clinice i medicale, RENAR Bucureti perioada 10-13 mai 2004, Curs Analiza Computerizat (EPI DATA/EPI INFO 2000) a datelor epidemiologice importante pentru sntatea public, U.M.F. Iai perioada 14-25.06.2004, Curs PHARE, Diagnostic microbiologic n supravegherea bolilor transmisibile Bucureti perioada 15-17 octombrie 2004, Curs Elaborarea procedurilor n cadrul sistemului de management al calitii din laboratoarele medicale conform SR EN ISO/CEI 17025:2001 Duru perioada 17-21 ianuarie 2005, Curs Metode de laborator pentru supravegherea rezistenei la antibiotice organizat de INCDMI Cantacuzino i Societatea Romn de Microbiologie perioada 20-24 iunie 2005, Curs Managementul performant al laboratorului acreditat. Studii de caz, aplicaii practice, instrumente informatice Fiatest SRL Bucureti perioada 9-10.03.2006, Curs Autorizarea legislaiei sntii mediului ambiant Cerina pentru Integrare European, UMF Iai
58

perioada 10-12.07.2006, Curs coala de var n sntate public, ISP Iai perioada 10-12 Iulie, Workshop on Public Health ISP Iai perioada 29-31.08.2006, Curs Prezentarea cerinelor SREN ISO/CEI 17025/2005- referenial pentru acreditarea laboratoarelor i a cerinelor SR EN ISO CEI 15089/2005, RENAR curs biochimie clinica si biochimie medicala IASI 05.2008 Rezistenta la antibiotice UMFIasi 03/2009 curs biochimie clinica si biochimia Rinichiului IASI 04.2009 curs biochimie clinica si biochimia hormonilor IASI 03.2010 Formare profesionala si organizationala a angajatilor din laboratoarele de imunologie prin implementarea tehnologiilor de vaf si a managerului calitatii IMUNOLAB 2011-2013 Lucrri tiinifice: Colaborator la lucrarea Tuberculoza la pacienii infectai cu HIV n judeul Suceava din perioada 01.05.1990 - 30.04.1999, iunie 1999. Colaborator la lucrarea Evaluarea rezistenei antimicrobiene la tulpinile de E. coli, la al 10-lea Congres European de microbiologie clinic i boli infecioase, Stockholm, Suedia, 28-31 mai 2000 Coautor la Proiecte de dezvoltare organizaional n cadrul reformei sistemului de supraveghere al BT 23-25 septembrie 2004 Iai, Reuniunea anual de microbiologie. Coautor la Evaluarea sensibilitii la chinolone prin metoda clasic a diluiilor n agar a enterobacteriilor izolate n perioada 1991-2003, 23-25 septembrie 2004 Iai, Reuniunea anual de microbiologie. Coautor Planul naional de aciune pentru supravegherea si controlul bolilor transmisibile in ROMANIA 2004. Coautor Monitorizarea incidenei infeciei gonococice i cunoaterea profilului rezistenei la antibiotice a unor tulpini de N. gonorrhoeae izolate la subiecii de vrst fertil n cursul anului 2004 , Conferina 75 ani de Sntate public la Iai21-24-09/2005. Coautor la studiul privind diagnosticul Tbc prin QuantiFeron TB Gold 2006/2008. Monitorizarea rezistenei la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrhoae in judeul Suceava rev. medico chirurgicala nr. 113 . 2009.
59

Determinari cantitative prin E test pentru evaluarea rezistentei la antibiotice a Neisseria gonorrhoae rev. Med.chir. nr. 114 Iasi 2010 . Apartenena la foruri tiinifice cu profil profesional: Societatea Romn de Microbiologie, 1994 Participri la sesiuni i congrese tiinifice: Primul Congres Naional de Medicin de Laborator, 8-10 septembrie 1999, la sala Palatului Bucureti. Simpozion Antibioterapia n infeciile severe, 22 iunie 2000 Suceava. 8th Meeting of Balkan Clinical Laboratory Federatin, 20-23 septembrie 2000 Sinaia . Simpozion Klacid macrolid de ultim generaie n infeciile respiratorii, Suceava 24 noiembrie 2000. Primul Simpozion Danubian de Medicin de Laborator la Sala Palatului Bucureti, 9-12 octombrie 2001. Simpozion Rezistena bacterian la antibiotice, 12 octombrie I.C. Bucureti. 2end Balkan Conference of Microbiology, Thessaloniki 22-24 noiembrie 2001. 9th Scientific Meeting Suceava, Infectious Diseases, 9-11 mai 2002. A XXXV-a Conferin a I.S.P. Iai, 19-20 septembrie 2002. Simpozion Rezistena microorganismelor la antibiotice, Trgovite 24-26 septembrie 2002. Metode clasice i rapide n diagnosticul microbiologic, 23-25 septembrie 2004, UMF Iai. Conferina naional Supravegherea i controlul bolilor transmisibile n Romnia trecut, prezent i viitor, Bucureti 12-13 octombrie 2004. Conferina 75 de ani de sntate public la Iai 21-24 septembrie 2005. A-X-a Reuniune anual de microbiologie 21-22.09.2006, UMF Cluj. A-X-a Reuniune anuala de microbiologie 23/26 mai 2007-Mamaia. A-3-a Conferinta a Asociatiei Laboratoarelor Medicale cu participare internationala .05.2007 IASI. Simpozionul DE LA CONCEPERE PANA LA UTILIZARE IASI 1.06.2007.
60

Conferinta de MEDICINA DE FAMILIE SUCEAVA 1922.06.2008. Congresul de microbiologie Sibiu cu participare internationala 26-29-10/2008. Scoala doctorala Iasi Catedra de microbiologie 2008. A-XI-a Reuniune anuala de microbiologie 08/10 oct 2009-Brasov. Formare profesionala si organizationala a angajatilor din laboratoarele de imunologie prin implementarea tehnologiilor de vaf si a managerului calitatii IMUNOLAB 2011-2013.

61