EXTRACCIN DE ADN DE ALIMENTOS ALTAMENTE PROCESADOS UTILIZANDO EL MTODO DE GRAHAM MODIFICADO Yendi Arely Cruz Flores1, Ral Rodrguez

Herrera1*, Cristbal No Aguilar1, Mara de la Luz Vega Reyes1, Juan Carlos Contreras Esquivel1. 1. Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad Autnoma de Coahuila., Blvd. V. Carranza esq. Ing. Jos Crdenas V. S/N Col. Repblica. Saltillo Coahuila CP. 25000,Tels. (01844)415-57-52, 415-95-34. Correo electrnico rrh961@hotmail.com

RESUMEN En el presente trabajo se modific el mtodo de extraccin de ADN propuesto por Graham (1995), con la finalidad de adecuarlo a matrices complejas y as extraer el ADN. Las modificaciones consistieron bsicamente en la cantidad de muestra, los tiempos de congelacin, temperatura y tiempo de incubacin. Las modificaciones permitieron la extraccin ms eficiente de ADN y con calidad suficiente para realizar su amplificacin por PCR. La extraccin de ADN se logr tanto en alimentos altamente procesados como en los no muy procesados. Este mtodo modificado representa ventajas en la extraccin de ADN para la identificacin de microorganismos de alimentos, residuos transgnicos en los mismos y/o para la autentificacin de alimentos, dado que no se emplean estuches de extraccin de ADN comerciales por lo que los costos se reducen, no se tiene que enriquecer la muestra para la deteccin de microorganismos por lo que tambin el tiempo se reduce. Palabras claves: extraccin ADN, mtodo Graham, matrices complejas, soya (Glycine max (L.) Merr), PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa). INTRODUCCIN La extraccin y purificacin de cidos nucleicos es el paso ms importante en estudios de biologa molecular y de las tcnicas de ADN recombinante. El objetivo de la extraccin de cidos nucleicos es obtenerlos purificados de varias fuentes con el propsito de conducir a un anlisis ms especfico. La calidad y purificacin de cidos nucleicos es uno de los factores crticos del anlisis de PCR. Con el propsito de obtener cidos nucleicos ms puros y libres de contaminantes, se deben utilizar mtodos de extraccin especficos. Los posibles contaminantes en el ADN que pueden inhibir la reaccin de PCR son: SDS, fenol, etanol, isopropanol, acetato de sodio, cloruro de sodio, EDTA, heparina, urea. La extraccin de cidos nucleicos depende de varios factores, entre ellos estn: el producto que se va a analizar y la matriz (granos, harinas, galletas, sopas, etc). En el caso de granos y los primeros productos de molienda de stos, el ADN conserva sus

propiedades fsico-qumicas intactas. Sin embargo, a medida que la materia prima es procesada hacia alimentos terminados, algunos de los distintos tratamientos a que son sometidos los componentes, hacen que se vaya degradando el ADN en algunos alimentos, tanto el proceso al que es sometido el alimento como el tiempo del proceso pudieran influir en la calidad del ADN extrado. Junto a esto cabe mencionar que los costos de extraccin/purificacin del ADN son mayores a partir de matrices elaboradas y/o complejas (Tozzini, 2004). Otra ventaja de la aplicacin de mtodos moleculares es en los aceites, por ejemplo para la posible deteccin de adulteraciones del aceite de oliva e incluso de otros tipos de aceite como el de girasol o de avellana (www.uib.es/servei/comunicacio/sc/ rojectes/arxiu/nousprojectes/additius/aditivos.doc). Muchos estudios han descrito diferentes mtodos para la extraccin de ADN de buena calidad, tanto en materias primas como productos altamente procesados. Tengel y col. (2001) utilizaron 2 mtodos para aislar ADN de diferentes productos, con la finalidad de determinar el mejor mtodo para obtener la mxima calidad, cantidad y pureza de ADN. Mediante el mtodo DNeasy Plant Mini kit se logr aislar ADN de productos con poco procesamiento como son: harina de maz y soya, protena de soya y pan de maz. Mientras que el QIAamp DNA Stool Mini Kit fue el mejor para aislar el ADN de productos altamente procesados que contenan chocolate en diferentes formas. Por otra parte Thion y col. (2002), seleccionaron el estuche (kit) para la extraccin en base a la eficiencia de aislamiento de ADN genmico y plasmdico en plantas. La extraccin consiste en el rompimiento de la pared celular, la eliminacin del ARN, y la remocin de las protenas por precipitacin. Despus de esto el ADN es fijado en una columna de afinidad, lavado y extrado. Garca-Caas y col. (2002), compararon 4 protocolos diferentes para la extraccin de ADN de harina de maz. Los mtodos se nombraron: mtodo CTAB, SDS proteinasa K, acetato de potasio y Wizard. Se pudo observar que las mejores condiciones para la extraccin del ADN con buena calidad fueron el mtodo SDS/proteinasa K y el CTAB, seguido por el acetato de potasio. La calidad ms baja fue con el Wizard. Permingeat y col. (2002), consideraron la homogenizacin de la muestra (por ejemplo harinas) antes de la aislamiento del ADN un punto crtico. La homogenizacin de la harina es un proceso difcil, especialmente cuando la muestra es grande (1Kg o ms). Un camino para resolver este problema es aislar el ADN de la muestra entera. Este procedimiento es eficiente pero no muy prctico por el gran volumen del buffer de extraccin que se requiere. La tcnica permite un material muy homogneo, pero contribuye a la degradacin del ADN. La disolucin del ADN a bajas temperaturas puede resolver este problema. Por otra parte la homogenizacin de la muestra con hexano es una alternativa prctica como rutina para homogenizar muestras. Ms aun la adicin de un solvente orgnico a la harina tiene la ventaja de la extraccin del aceite, haciendo la extraccin del ADN ms fcil.

NOTA: El CTAB o bromuro de hexa-decil-tri-mel-amonio se adhiere fuertemente al ADN, desplaza las protenas y previene la degradacin. Es un surfactante catinico. Sus usos incluyen la utilizacin como solucin tamponante para la extraccin de ADN. Los mtodos de extraccin de ADN necesitan ser optimizados para cada matriz del alimento, debido a que varios de los componentes alimenticios inhiben los reactivos usados en el anlisis. En general, el ADN no es detectable en alimentos tratados con temperaturas altas, en protenas de plantas hidrolizadas, en lecitina purificada, en derivados del almidn, y en aceites refinados derivados de cultivos provenientes de OGMs (Food Technology, 2000). La extraccin de ADN de buena calidad, pureza y cantidad es esencial para analizar alimentos de diferentes matrices y disminuir los costos de extraccin de ADN para el uso de las herramientas de biologa molecular en la industria alimentara para la identificacin de microorganismos, deteccin de residuos transgnicos y/o la autentificacin de alimentos. El objetivo del presente trabajo fue: adaptar el mtodo de extraccin de ADN propuesto por Graham (1995), con la finalidad de adecuarlo a matrices complejas y as extraer el ADN de calidad suficiente para la amplificacin de ADN por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). MATERIALES Y MTODOS Obtencin de las muestras. En un centro comercial de la ciudad de Saltillo, Coahuila Mxico se realiz un inventario de todos los alimentos que estaban en los anaqueles del mismo y que contenan algn ingrediente a base de soya, ya identificados los productos se procedi a hacer una clasificacin de los alimentos basada tanto en el ingrediente a base de soya, como en el proceso al que son sometidos para su elaboracin, obtenindose 15 clases. Cuadro 1.- Clasificacin de los productos de acuerdo al ingrediente de soya y al proceso sometido para su elaboracin.

Cdigo Clases
I II III IV V Aceite puro de soya Aceite vegetal comestible

Caractersticas
Ingrediente 100% de soya.

Producto o alimento tpico

Aceite de soya

Mezclas de aceite de soya con aceite de otro Aceite Vegetal Comestible vegetal. Aceite en aerosol

Otros aceites con lecitina de Aceite vegetal con soya como aditivo. soya

Productos con aceite de soya No utilizacin de temperatura en la elaboracin del Aderezo para ensaladas, mayonesas sin tratamiento trmico producto. Productos con aceite de soya Utilizacin de temperatura en la elaboracin del Cereal, panes, harinas, galletas, con tratamiento trmico producto. chocolates, quesos, papas congeladas Productos con lecitina de Lecitina de soya como emulsionante/antioxidante y soya sin tratamiento trmico no utiliza temperatura para la elaboracin del Paletas de hielo y helados producto. Productos con lecitina de Lecitina de soya como emulsionante/antioxidante y Chocolates, dulces, panes, sopas, soya con tratamiento trmico utiliza temperatura para la elaboracin del galletas producto. Protena hidrolizada soya/salsa de soya tratamiento trmico Protena hidrolizada soya/salsa de soya tratamiento trmico Harina de soya de No utilizacin de temperatura en la elaboracin del sin producto y la protena/salsa de soya se utiliza Aderezos y salsas. como saborizante. de Utilizacin de temperatura en la elaboracin del Chocolates, con producto y la protena/salsa de soya se utiliza sopa instantnea, como saborizante. papas fritas Harina de soya como ingrediente Panes, harinas Cereal, pan, chorizo, jamn, carne, crema imitacin, preparado salchicha, cereales, cacahuates,

VI

VII

VIII

IX

X XI XII

Aislado de soya (protena)/ Contiene ms del 90% de las protenas de soya. protena de soya Soya texturizada

Protenas fibriladas que imitan la textura de tejidos Tocino como los de la carne. chorizo,

atn, para

hamburguesa XIII XIV XV Soya sin especificar Enzimas activas de soya Concentrado de soya La etiqueta indica soya. Frituras, jugos, cereal Tortillas de harina Contiene alrededor del 70% de las protenas de Salchichas soya.

Una vez agrupados los alimentos, se eligieron los productos ms representativos (al menos 1 de cada clase). Es importante mencionar que la forma de seleccin de las muestras a analizar fue de manera subjetiva, tomando en cuenta aquellos productos que segn nuestro criterio son los ms consumidos y las marcas ms conocidas. Se eligieron 44 alimentos en total de la ciudad de Saltillo, Coahuila Mxico. As mismo se realiz un muestreo de los alimentos de las diferentes categoras en las ciudades de Monclova, Piedras Negras y Torren, Coahuila, Mxico. Seleccionando de estas ciudades 39 muestras elegidas y analizadas de la misma forma que las de la ciudad de Saltillo. Extraccin de ADN Inicialmente se seleccion el mtodo reportado por Graham y col. (1995), el cual es un mtodo diseado para la extraccin de ADN fngico, sin embargo este mtodo se fue modificando de acuerdo a los problemas presentados en la extraccin de ADN de las diferentes matrices. La descripcin de la metodologa se presenta a continuacin, y en itlicas las modificaciones realizadas al mtodo original: Se pes 0.3-0.5 g de la muestra homognea del alimento y se envolvi con papel aluminio, identificando con el nmero de muestra. La muestra se introdujo en un termo con nitrgeno lquido por 48-72 horas. Se macer a polvo fino en un mortero estril congelado, el alimento macerado se transfiri a un tubo de 1.5 ml, al cual se le agreg 1 ml de buffer de extraccin CTAB (NaCL 5M, Tris-HCI 2 M pH 8.0, EDTA 0.5 M, CTAB 2%) y 20 l de albmina srica bovina BSA al 20% (p/v). Se mezclaron los compuestos del tubo con un pulso de vrtex y se sumergi 60 minutos en un bao Mara a 60 C. Se centrifugaron los tubos a 12,000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante (600 l) se transfiri a otro tubo nuevo, al cual se le agreg un volumen de 800 l de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1). Se mezcl por inversiones suaves por 1 a 2 minutos y se centrifug a 12,000 rpm durante 10 minutos; la fase acuosa (400 l) se transfiri a otro tubo nuevo y se le agreg 600 l de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1). Se mezcl por inversiones suaves por 1 a 2 minutos y se centrifug a 12,000 rpm durante 10 minutos; la fase acuosa (200 l) se transfiri a un tubo nuevo y se le agreg 50 l de acetato de amonio al 7.5 M y 800 l de etanol fro al 96%. Se mezcl por inversiones suaves y se meti al congelador a 17 C de 48 a 72

horas. Se centrifug a 12,000 rpm por 5 minutos y se descart el sobrenadante. Se lav la pastilla (ADN adherido al tubo) 2 veces con 1 ml de etanol al 70%, se mezcl con inversiones. El tubo se dej destapado en posicin invertida hasta que el olor a etanol desapareci. El ADN resultante se suspendi con 80 l de hidrxido de sodio 8 mM y se colocaron los tubos a 4C. NOTA: El BSA disminuye la inhibicin de PCR haciendo a la enzima polimerasa ms eficiente y enlazando ciertos compuestos inhibitorios. Puede disminuir la inhibicin por cido hmico. Determinacin de la Integridad del ADN En un vaso de precipitado estril se disolvi 0.3g de agarosa en 30 ml de buffer TAE 1x, se calent hasta que se disolvi, agitando continuamente. Se dej enfriar hasta una temperatura de 45 C y se le agreg 6 l de bromuro de etidio. La solucin se verti en un portagel al cual se le coloc un peine. Se dej solubilizar de 15 a 20 minutos y se removi el peine. Sobre una tira de parafilm se coloc una gota (1 l) de azul de bromofenol, sobre ste se coloc 10 l de la muestra y se mezcl succionando y expulsando de 5 a 10 veces. La muestra se coloc en un pozo del gel y se coloc en una cmara de electroforesis con un volumen del buffer TAE 1x hasta cubrir el gel. Se fraccionan las muestras a 60 volts por 5 minutos y despus se increment a 100 volts por 45 minutos. En el transiluminador de luz UV, se visualiz el ADN. Anlisis de los Productos de PCR A 23 l de la mezcla de PCR que contena amortiguador de PCR 1X (20 nm Tris, pH 8.4, 50 mM KCl) (Invitrogen), 0.2Mm dNTPs, 2.0 mM MgCl2, 0.5 UM de cada uno de los iniciadores y 0.1 u/ l de Taq ADN polimerasa. Se mezclaron todos los reactivos en el tubo succionando y liberando el lquido con la micropipeta, posteriormente se le agreg una gotita de aceite mineral estril. La amplificacin fue llevada a cabo en un termociclador (Thermo Hybrid) con los siguientes pasos en cada ciclo: preincubacin a 95 C por 5 minutos; 35 ciclos con una temperatura de desnaturalizacin de 94 C por 1 minuto, la de anillamiento 62 C por 1 minuto y la de extensin a 72 C por 1 minuto. El par de iniciadores utilizados RR (RR01 5TGGCGCCCAAAGCTTGCATGGC3 y RR04 5CCCCAAGTTCCTAAATCTTCA AGT3) utilizados para identificar el gen epsps, el cual fue utilizado para corroborar que el DNA extrado de alimentos altamente procesados tenia la calidad suficiente para ser amplificado por PCR. Una vez concluida la reaccin se sacaron los microtubos y se realiz una electroforesis con gel de agarosa al 2% para estimar el tamao de los segmentos amplificados, y se utiliz un marcador molecular (100 pb DNA ladder) para referencia del tamao. Se coloc 2 l del marcador con 1l de azul de bromofenol, y 10 l de la muestra con 1 l de azul de bromofenol. Se visualiz en un transiluminador de UV para verificar los segmentos amplificados.

NOTA. Para mejorar el contacto de los microviales con el termociclador, se aadi en cada pocilio, y previo a la colocacin de los viales, una gota de aceite mineral. Asimismo dos gotas de aceite mineral fueron incorporadas a cada microvial para evitar las prdidas por evaporacin.

NOTA. Cultivos modificados genticamente

El glifosato (N-fosfo-nometil-glicina, C3H8NO5P, CAS 1071-83-6) es un herbicida no selectivo de amplio espectro, desarrollado para eliminacin de hierbas y de arbustos, en especial los perennes. El glifosato es el principio activo del herbicida Roundup (nombre comercial producido por Monsanto, cuya patente expir en 2000). Monsanto patent en algunos pases el evento "40-3-2" en la soja transgnica, el cual confiere resistencia al glifosato. Aunque existen actualmente muchos otros tipos de cultivo resistentes al glifosato como maz, algodn, canola, etc. El glifosato es un amino-fosfonato (anlogo estructural de aminocidos) y un anlogo del aminocido natural glicina. El glifosato acta inhibiendo la 5-enolpiruvil-shiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS), enzima responsable de la formacin de los aminocidos aromticos fenilalanina, tirosina y triptfano. El shiquimato (anin del cido shiqumico) es el precursor clave y comn en la biosntesis de todos los aminocidos aromticos y del triptfano que resulta de la ciclacin de un cido heptnico. La EPSPS cataliza la reaccin entre shiquimato-3-fosfato (S3P) y fosfoenolpiruvato (PEP) para formar ESP y fosfato. Los aminocidos aromticos se utilizan tambin para formar metabolitos secundarios como los folatos, las ubiquinonas y las naftoquinas. La ruta del proceso bioqumico del shiquimato no se encuentra en animales. El glifosato adicionalmente se utiliza en la lucha contra el cultivo de la amapola, la coca y otras plantas usadas en el desarrollo de estupefacientes. Y tambin como herbicida en los cultivos de soja, que ha sido manipulada genticamente para no ser afectada por esta sustancia.

nombres registrados del glifosato

1.Sal de amonio 2.Sal amina isopropil 3.Glifosato cido - standalone, tanto como sal amoniacal o sal isopropil

4.Sal potsica Algunos microorganismos tienen una versin de la 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) resistente a la inhibicin por glifosfato. La versin usada en cultivos modificados por ingeniera gentica se aisl de la cepa de Agrobacterium CP4 (CP4 EPSPS) resistente a glifosato. Este gen CP4 EPSPS fue clonado y transferido a soja, y en 1996 se comenz la comercializacin de la soja transgnica.

Junto con la soja en 1996 aparecieron otros cultivos Roundup Ready (que soportaban el glifosato), como maz, sorgo, canola, alfalfa, algodn, y trigo en desarrollo. Estos cultivos dieron a los agricultores la capacidad de controlar malezas, ya que el glifosato no afectaba sus cultivos modificados. Para 2005, el 87 % del cultivo de soja de EE. UU., era de la variedad transgnica. El glifosato es uno de los herbicidas usados por el gobierno de Estados Unidos para asperjar campos de cultivo de coca en Colombia en el Plan Colombia. Sus efectos a la salud humana, al ambiente, a los cultivos legales, y la efectividad en el combate de EE. UU. en la guerra contra las drogas estn ampliamente disputados. Ya hay informes acerca de estas amplsimas aplicaciones areas de glifosato en su intento de destruir cultivos de coca en Sudamrica, resulta en el desarrollo natural de cepas de coca con resistencia a glifosato conocidas como Boliviana negra, que

habra sido mejorada por seleccin.18 Aunque no hay reportes cientficos de coca resistente a glifosato en la literatura con revisin por rbitro. Adems, ya que est prohibido aplicar herbicidas en los parques nacionales colombianos, se cultiva coca dentro de esas reas, cortando la vegetacin natural, y estableciendo plantaciones ilegales de coca. La EPA (Agencia de Proteccin Ambiental),19 as como la Organizacin Mundial de la Salud20 21 clasificaron los herbicidas con glifosato como de baja toxicidad, englobados en la Clase III para exposiciones oral e inhalacin en una escala de I (ms txico) a IV (menos txico). En dos ocasiones la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos ha encontrado cientficos falsificando deliberadamente los resultados de las pruebas realizadas en los laboratorios de investigacin contratados por Monsanto para estudiar los efectos del glifosato. En el primer incidente, que involucr a Industry Biotest Laboratories, un revisor de la EPA declar despus de la investigacin sobre falsificacin de datos de rutina que era difcil de creer la integridad cientfica de los estudios cuando se dice que tomaron muestras de los teros de conejos machos. En el segundo incidente sobre falsificacin de resultados, ocurrido en 1991, el propietario del laboratorio Craven Labs, y tres empleados fueron acusados de 20 cargos; el propietario fue condenado a 5 aos de prisin y una multa de 50 000 dlares, el laboratorio fue multado con 15,5 millones de dlares y se le orden pagar 3,7 millones en restitucin. Los laboratorios Craven haban realizado estudios para 262 empresas, entre ellas los plaguicidas de Monsanto. Monsanto afirma que los estudios en contingencia han sido repetidos y que la certificacin del Roundup ante la EPA actualmente no cita estudios de los Laboratorios Craven o IBT. Segn Monsanto, la investigacin a los Laboratorios Cravens fue iniciada por la EPA gracias a que un grupo de trabajo creada por la industria descubrieran irregularidades. En 1996 Monsanto fue acusado de publicidad falsa y engaosa de los productos derivados del glifosato, acarreando una demanda judicial iniciada por el fiscal general del estado de Nueva York. El 20 de enero de 2007, Monsanto fue declarada culpable de publicidad engaosa por presentar al Roundup como biodegradable y alegar que el suelo permaneca limpio despus de su uso. Defensores del medio ambiente y de los derechos del consumidor plante el caso en 2001 sobre la base de que el glifosato, el ingrediente principal del Roundup, est clasificado por la Unin Europea, como peligroso para el medio ambiente y txico para los organismos acuticos. Monsanto Francia tiene previsto apelar el

veredicto.

RESULTADOS Y DISCUSIN Como se indic anteriormente se utiliz el mtodo reportado por Graham y col. (1995), el cual Henry en 1997 utiliz despus para la extraccin de ADN vegetal. A partir de ste mtodo Valdez (2003) realiz algunas modificaciones para la extraccin ms eficiente de ADN de algunos alimentos a base de maz. En este trabajo se utiliz el mtodo modificado por Valdez (2003), sin embargo debido a que no se obtuvo buena calidad de ADN en los productos analizados, se hicieron algunas modificaciones, estos cambios consisten bsicamente en la cantidad de muestra, los tiempos de congelacin, temperatura y tiempo de incubacin. Estas modificaciones permitieron obtener un ADN de mejor calidad. Aunque con estas modificaciones a la tcnica se extrajo ADN de buena calidad de algunas muestras, con otras muestras se presentaron problemas por lo que se tuvieron que hacer ms modificaciones. Unas de las muestras en donde fue ms difcil extraer ADN por el mtodo de Graham y col. (1995), fueron los productos que contenan chocolate, como una alternativa se emple el Kit Qiagen Stool que segn Tengel y col. (2001) y despus Rott y col. (2004) est diseado para remover todos los inhibidores de PCR, sin embargo en este caso este kit no fue eficiente para extraer ADN de los productos con chocolate. Por lo tanto se realizaron ms modificaciones al mtodo de extraccin y se logr obtener ADN de buena calidad (Figura 1). Las modificaciones fueron en el tamao de la muestra, en donde se pes alrededor de 0.3-0.5 g de muestra y se dej 48-72 horas en nitrgeno lquido para que estuviera bien congelado y la maceracin fuera ms sencilla. Se alarg el tiempo de incubacin en bao Mara a 60 C durante 30-40 minutos. Se centrifug a 12000 rpm durante 10 minutos, en la parte superior del tubo se form una aglutinacin que impeda tomar del lquido, con cuidado se tom el lquido de la parte media sin tomar del aglutinado. Y el tiempo durante la precipitacin se increment de 1 hora a 48 72 horas.

gura 1.- Calidad de

ADN obtenido de muestras de productos comerciales de las ciudades de Monclova (M), Torren (T) y Piedras Negras (P). 1: Galletas saladas (M), 2:Tortillas harina (M), 3: Pan molido (M), 4: Galletas ritz (M), 5: Polvo de chocolate

(T), 6: Cacahuate japons (T), 7: Frituras de maz (T), 8: Buuelos (T), 9: Pan Tostado (P), 10: Donitas (P), 11: Galletas saladas (P), 12: Pan molido (P), 13: Sopa instantnea, 14: Tortillas de harina (P), 15: Galletas maras (P), 16: Jugo de soya (P).

Otro caso en donde se presentaron problemas fueron las muestras solubles en agua (por ejemplo: chocolate en polvo, polvo para bebida de horchata, salsa de soya, jugo y harinas) en donde despus de la incubacin en bao Mara y la centrifugacin no se observan dos fases, slo una y en algunos casos un residuo slido en la parte inferior. En este caso se tom 600 l del lquido y se prosigui con el tratamiento. A pesar de esto se logr extraer ADN del chocolate, polvo para bebida, el jugo y las harinas, en el caso de la salsa de soya no se obtuvo ADN. Rott y col. (2004) lograron obtener ADN suficiente para cuantificacin espectrofotomtrica y la amplificacin posterior, en donde utilizaron 1g de salsa de soya deshidratada utilizando el kit Qiagen Stool. Debido a que los productos contienen muchos otros ingredientes, por ser muestras muy complejas como es el caso de las galletas con relleno. En este caso si en la etiqueta se especifica en que parte del producto contiene la soya, la muestra se toma principalmente de esa parte. Por ejemplo para el caso de las galletas con relleno de crema en la etiqueta se especifica que el relleno contiene lecitina de soya, por lo tanto la mayor parte de la muestra para extraer ADN se recolecta de ese lugar. Cabe mencionar que la proporcin de soya y de otros ingredientes vara de un producto a otro y es de suponer que debido a que en estos productos la concentracin de soya es muy baja y/o que el ADN de soya esta muy degradado, la mayor parte del ADN extrado proviene de otros ingredientes. Rott y col. (2004) asumieron que el incremento del nivel de procesamiento resulta en la disminucin de la cantidad y calidad del ADN de soya que puede ser extrado debido a la degradacin de ADN causada por los diferentes mtodos de procesamiento. En el Cuadro 2 se muestran los alimentos seleccionados para el anlisis, los diferentes grados de procesamiento del ingrediente de soya y la integridad del ADN obtenido. En donde se puede observar que en el caso de los aceites no se logr extraer ADN, esto debido a que durante su obtencin se emplean muchas etapas (Figura 2). Solo para obtener el aceite crudo (con una gran cantidad de impurezas) se emplean temperaturas de 110 C para la extraccin, por lo que es de suponerse que el ADN en esta etapa este desnaturalizado. Aun ms despus de la refinacin que se lleva a cabo en los siguientes pasos: desgomado (60-70 C), neutralizacin (NaOH 12-15% y 60-70 C), decoloracin (80-90 C) y desodorizacin (270 C). Para el caso de los productos que contienen aceite de soya, como ingrediente secundario, se logr la extraccin de ADN de muy buena calidad en los siguientes alimentos: galletas saladas, harina para hot cakes y polvo para preparar una bebida de horchata. Esto no indica que necesariamente sea ADN de soya sino que pudiera provenir de los otros ingredientes.

En los alimentos con lecitina de soya clasificados como altamente procesados, se observ que el ADN no fue degradado e incluso con una integridad buena, a pesar que es un subproducto de la refinacin del aceite de soya y se utiliza como emulsionante y antioxidante (se utilizan en bajas concentraciones de 100 a 200 ppm) lo cual ratifica que a pesar de los diferentes mtodos de procesamiento, se puede aislar ADN. En los productos con protena hidrolizada de soya se observa una variacin en los resultados, desde una extraccin de ADN muy buena hasta la ausencia de ADN. En la salsa de soya no se logr aislar ADN, en donde es importante sealar que el grado de procesamiento es del ingrediente de soya y no del producto, esto es importante ya que la salsa de soya como producto es altamente procesado, ya que se lleva a cabo un proceso de fermentacin de 6 a 12 meses. Los productos de la clase de harina de soya fueron en donde ms fcilmente se pudo extraer ADN y con una calidad muy buena, esto debido a que es la forma menos refinada de la soya. Esta forma de la soya contiene la menor cantidad de protenas de un 40 a un 50%, las cuales representan un contaminante para el ADN, y al estar en bajas concentraciones permiten una mejor extraccin. Ese no es el caso de los aislados que contienen ms del 90% de las protenas de soya y donde la calidad de ADN fue pobre y solo buena en algunas muestras, excepto en la crema de championes, en donde no se logr extraer ADN. La crema como producto es altamente procesado, por el tratamiento trmico a altas temperaturas al que es sometida. Para el caso de los alimentos con concentrados de soya la calidad de ADN fue buena, y la concentracin de protenas es alrededor del 70%. Esto nos indica que la concentracin de protenas es un factor que se debe cuidar en la extraccin del ADN, de ser necesario se debe lavar con cloroformo: alcohol isoamlico varias veces para eliminar cualquier residuo de protenas que pudiera contener la fase acuosa. Para la elaboracin de la soya texturizada se llevan a cabo cambios bruscos de pH, sin embargo, se aisl ADN de buena calidad en los alimentos con este ingrediente. Incluso en la carne para hamburguesa y la imitacin de tocino se obtuvo muy buena calidad de ADN, a pesar de los tratamientos con cidos y lcalis al que se someten. En la clase de soya sin especificar, pese a que en la etiqueta no especifica alguna de las formas comerciales de la soya, se logr obtener ADN. Para el jugo de soya se obtuvo una pobre extraccin de ADN, el pastel de avena buena y las frituras muy buena. El ADN extrado de alimentos altamente procesados tena la calidad suficiente para ser amplificado por PCR (Figura 3) dado que se observo una banda de 356 pb del gen epsps y corresponde con lo reportado en la literatura para el par de iniciadores empleados. La banda de 356 pb del gen epsps se observo en el ADN amplificado de los siguientes alimentos: harina para hot cakes, chorizo, cereal de avena vainilla, harina para pastel de chocolate y harina para pastel de chocolate, provenientes de la ciudad de Saltillo, as como

en ADN de las galletas maras (Monclova), harina para hot cakes (Torren) y harina para hot cakes (Piedras Negras).

Figura 3.

Amplificacin del gen epsps en productos comerciales de la ciudad de Saltillo M: Marcador 100 pb, 1: Pan blanco , 2: Cacahuate japons, 3: Salchicha para asar, 4: Harina para hot cakes 2, 5: Cereal de avena vainilla-canela, 6: Chorizo, 7: Chocolate relleno, 8: Harina para pastel de chocolate.

CONCLUSIONES En este estudio se logr extraer ADN de diferentes alimentos altamente procesados modificando el mtodo propuesto inicialmente por Graham y col. (1995). En donde los principales cambios consistieron en la cantidad de muestra, tiempo y temperatura de incubacin y el tiempo de congelacin. Aislndose ADN tanto de alimentos altamente procesados como el chocolate hasta los no muy procesados como la harina, lo cual permiti obtener ADN con calidad suficiente para amplificar la secuencia correspondiente al gen epsps. Estos resultados indican que a pesar de que se especula que el ADN es degradado durante el proceso de elaboracin del alimento, en realidad este permanece durante las etapas de elaboracin y no es degradado por la temperatura, pH o condiciones adversas.

Producto o alimento

Ingrediente de soya

Grado de procesamiento Extraccin

de

ADN
SALTILLO Aceite Vegetal Comestible Aceite Vegetal Comestible Aceite Vegetal Comestible Aceite Vegetal Comestible Aceite de Oliva Aderezo para ensaladas Cereal de Avena sabor canela Roles de Canela glaseados Aceite puro de soya Aceite puro de soya Aceite puro de soya Aceite Vegetal Comestible Otros Aceites con Lecitina de Soya Altamente procesado Altamente procesado Altamente procesado Altamente procesado Altamente procesado + ++ ++ +++ +++ +++ + ++ ++ + ++ + ++ ++

Productos con aceite de soya sin tratamiento trmico Altamente procesado Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado

Polvo con leche para bebida de Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado horchata Harina para preparar hot cakes Galletas Saladas Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado

Paleta de helado de crema Productos con lecitina de soya sin tratamiento Altamente procesado cubierto de chocolate trmico Chocolate duro Pan tostado doble fibra Gansito Polvo para chocolate Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico

Galletas de chocolate con crema Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado sandwich trmico Galletas de fresa sandwich Galletas Maras Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico

Aderezo para ensaladas Salsa de soya Frituras de harina de maz Chocolate relleno Sopa instantnea Cacahuate japons Pan blanco en rebanadas Pan molido Harina para hot cakes

Protena hidrolizada de soya/salsa de soya sin Altamente procesado tratamiento trmico Protena hidrolizada de soya/salsa de soya sin Altamente procesado tratamiento trmico Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Harina de soya Harina de soya Harina de soya No muy procesado No muy procesado No muy procesado No muy procesado

+ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++

Harina para preparar pastel Harina de soya sabor chocolate Chocolate Aislado de soya (protena) / protena de soya

Moderadamente procesado + Moderadamente procesado ++ Moderadamente procesado Moderadamente procesado ++ Moderadamente procesado + Moderadamente procesado + Moderadamente procesado +++ Moderadamente procesado ++ Moderadamente procesado +++ Moderadamente procesado ++

Cereal de Avena sabor vainilla Aislado de soya (protena) / protena de soya canela Crema de championes Chorizo cantimpalo Salchicha para asar Jamn de pavo Trocitos imitacin de tocino Ensalada de atn con verduras Preparado para hamburguesa Chorizo Aislado de soya (protena) / protena de soya Aislado de soya (protena) / protena de soya Aislado de soya (protena) / protena de soya Aislado de soya (protena) / protena de soya Soya texturizada Soya texturizada Soya texturizada Soya texturizada

Jugo de soya

Soya sin especificar

Moderadamente procesado + Moderadamente procesado ++ Moderadamente procesado +++ Altamente procesado +++

Pastel de avena relleno de crema Soya sin especificar Frituras de maz con sal Tortillas de harina Salchicha de pavo MONCLOVA Jugo de soya Sustituto de crema Salchicha de pavo Galletas Maras Galletas Saladas Tortillas de harina Pan molido Galletas Ritz Sustituto de leche TORREN Tortillas de harina Polvo para chocolate Cereal con frutas y nueces Cacahuate japons Frituras de maz con sal Enzimas activas de soya Soya sin especificar Soya sin especificar Enzimas activas de soya Concentrado de soya

Moderadamente procesado +

Moderadamente procesado + +

Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Concentrado de soya

Moderadamente procesado + ++ +++ +++ +++ ++

Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Enzimas activas de soya Harina de soya Altamente procesado No muy procesado

Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Aislado de soya

Moderadamente procesado +

Altamente procesado

+++ ++ ++ +++

Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Soya sin especificar

Moderadamente procesado +++

Jugo de soya

Soya sin especificar

Moderadamente procesado + Moderadamente procesado + +++

Bebida de chocolate a base de Aislado de soya (protena) / protena de soya soya

Polvo con leche para bebida de Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado horchata Salchicha de pavo Negrito Bimbuuelos Aderezo para ensaladas Salchicha para asar Harina para hot cakes PIEDRAS NEGRAS Negrito Donitas Donas espolvoreadas Pan tostado doble fibra Galletas Saladas Frituras de maz con sal Cacahuate japons Galletas Maras Tortillas de harina Pan molido Polvo para chocolate Aislado de soya (protena) / protena de soya Harina de soya Concentrado de soya Aislado de soya (protena) / protena de soya Harina de soya

Moderadamente procesado + Moderadamente procesado ++ No muy procesado +++ +

Productos con Aceite de Soya sin Tratamiento Altamente procesado Trmico Aislado de soya (protena) / protena de soya Harina de soya

Moderadamente procesado + No muy procesado +++

Moderadamente procesado ++ No muy procesado +++ + ++ +++

Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Soya sin especificar

Moderadamente procesado +++ +++ ++ +++ +++ ++

Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado trmico Enzimas activas de soya Harina de soya Altamente procesado No muy procesado

Productos con lecitina de soya con tratamiento Altamente procesado

trmico Sopa instantnea Jugo de soya Harina para preparar hot cakes Salchicha de pavo Salchicha de pavo Protena hidrolizada de soya/ salsa de soya con Altamente procesado tratamiento trmico Soya sin especificar +++

Moderadamente procesado + +++

Productos con aceite de soya con tratamiento trmico Altamente procesado Concentrado de soya Aislado de soya (protena) / protena de soya

Moderadamente procesado + Moderadamente procesado +

No se observ banda + Pobre (banda tenue) ++ Buena (banda intensa con barrido) +++ Muy buena (banda muy intensa y gruesa)

REFERENCIAS 4. Food Technology, 2000. Etiquetado de alimentos derivados de la biotecnologa del rADN. 54: 9. Disponible en www.worldfoodscience.org/cms/?pid=1001265. 5. Garca-Caas, V., Gonzlez, R. and Cifuentes, A. 2002. Detection of Genetically Modified Maize by Polymerase Chain Reaction and Capillary Gel Electrophoresis with UV Detection and Laser Induced Fluorescence. J. Agric. Food Chem. 50: 1016-1021. 6. Graham, H. C., Mayers, P. and Henry, R. J. 1995. A Simplified Method for the Preparation of Fungal Genomic DNA for PCR an RAPD analysis. BioTechniques 16: 48-50. 7. Permingeat, H., Reggiardo, M. and Vallejos, R. 2002. Detection and Quantification of Transgenes in Grains by Multiplex and Real-Time PCR. J. Agric. Food Chem. 50: 4431-4436. 8. Rott, M., Laerence, T., Wall, E. and Green, M. 2004. Detection and Quantification of Roundup Ready Soy in Foods by Conventional and Real-Time Polymerase Chain Reaction. J. Agric. Food Chem. 52: 5223-5232. 9. Tengel, C., Schbler, P., Setzke, E. and Balles J. 2001. PCR-based Detection of Genetically Modified Soybean and Maize in Raw and Highly Processed Foodstuffs. Product Application Focus. 10. Thion, L., Vossen, C., Couderc, B., Erard, M. and Clemenon, B.

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2002. Detection of Genetically Modified Organisms in Food by DNA Extraction and PCR Amplification. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30: 51-55. Tozzini, A. C. 2004. Deteccin de OGM en la Cadena Alimentaria. p. 409-424. En Echenique V., Rubinstein C. y Mroginski L (ed.) Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal. INTA. Buenos Aires, Argentina. Pginas en la web: www.uib.es/servei/comunicacio/sc/projectes/arxiu/ nousprojectes/ additius/aditivos.doc