Sunteți pe pagina 1din 10

Detectarea unui OMG poate fi realizata prin identificarea unei molecule de AND, ARN sau proteina care poate

fi: -asociata in mod specific cu modificarea genetica - derivate din modificarea genetica de interes Majoritatea metodelor utilizate pana in prezent pentru detectarea OMG sau a derivatelor unor asemenea organsime se axeaza pe identificarea ADN si numai cateva pe identificarea ARN sau a unor proteine. Acest lucru se datoreaza faptului ca analiza ADN este facilitata de stabilitatea acestuia in timp si de multiplicarea lui usoara prin tehnica PCR, dar si faptului ca in cazul modificarilor genetice nucleare, exista o corelatie liniara intre cantitatea de OMG din proba supusa analizei si cantitatea de ADN specific. ARN transcris corespunzator transgenelor este mai greu de identificat datorita stabilitatii sale reduse. Tehnicile care presupun identificarea proteinelor codificate de trangene au la baza formarea cuplului anticorp-proteina , a carui prezenta este apoi detectata printr-o reactie de culoare. Acest proces este dificil de realizat atunci cand cantitatea specifica din proba supusa analizei este redusa. Metodele utilizate pentru detectarea OMG intr-un produs si pentru evaluarea gradului de contaminare a produsului cu respectivele organisme trebuie sa fie validate in prealabil si sa indeplineasca urmatoarele cerinte: sa faca posibila atat detectarea OMG cat si cuantificarea acestor organisme in probele supuse analizei - sa fie usor de aplicat - sa aiba costuri reduse sa fie aplicabile in laboratoare echipate cu aparatura uzuala de proteina

Evaluarea continutului de OMG al unor probe presupune parcurgerea a trei etape: detectarea, identificarea si cuantificarea.(Fig. 1)

1. Identificarea OMG cu ajutorul testelor imunologice, bazate pe detectarea proteinelor specifice Testele imunologice sunt metode curente de detectare si cuantificare a proteinelor straine introduse in planta prin modificarea genetica cu ajutorul anticorpilor specifici. Pentru efectuarea testelor imunologice este absolut necesara existenta anticorpilor cu afinitatea si specificitatea dorite. Aceasta tehnologie este ideala pentru detectarea cantitativa si calitativa a unui numar de proteine. Poate fi aplicata cu success pentru testarea plantelor sau semintelor, dar este mai putin sigura in cazul testarii alimentelor procesate cand proteinele pot fi degradate. Metodele de analiza pe teste imunologice sunt: Western Blot, ELISA si benzile indicatoare de proteine. Anticorpii utilizati in identificarile imunologice pot fi policlonali sau monoclonali. Anticorpii policlonali Cele mai multe din proteinele codificate de transgene sunt imunogene si atunci cand sunt injectate intr-un animal ele stimuleaza producerea unor anticorpi specifici, care pot fi utilizati in

diferite teste serologice. Intotdeauna sunt utilizate proteine foarte bine purificate pentru a evita aparitia unor reactii imunologice nespecifice. Pentru producerea de anticorpi se folosesc iepuri , oi si capre. Programul optim de injectare variaza in functie de specificul fiecarei proteine, insa productia de anticorpi este influentata si de cantitatea de proteina injectata cat si de proprietatile antigenice ale acesteia. Anticorpii monoclonali Acestia sunt sintetizati in culturi de celule hibride obtinute prin fuzionarea in vitro a unor celule producatoare de anticorpi cu celule neoplazice provenite din mieloame sau limfoame. Anticorpii monoclonali prezinta cateva avantaje importante: uniformitatea afinitatii si specificitatii fata de un singur deternmninant antigenic sau epitop si faptul ca pot fi produsi in cantitati mari, in vitro, in culturi de celule. 1.1. WESTERN BLOT ( transferul de tip Western ) Prin aplicarea acestei tehnici poate fi identificata , cu ajutorul anticorpilor specifici o anumita proteina tinta imobilizata pe un suport solid. La aceasta tehnica s-a recurs pentru identificarea CP4 EPSPS atat din soia modificata genetic cat si din produsele derivate din aceasta. Transferul de tip WESTERN necesita echipamente speciale, este mai scump decat testul ELISA, permite doar analize calitative si se aplica numai in laboratoarele specializate. 1.2. ELISA Tehnica ELISA a fost utilizata pentru prima data in scopul cercetarii virusurilor plantelor de catre Clark si Adams in anul 1977 si a constituit o imbunatatire considerabila a posibilitatilor de detectare si de studiere a virusurilor vegetale. Ulterior a fost

aplicata pentru identificarea oricarei proteine care poate fi obtinuta in forma pura pentru care pot fi obtinuti anticorpi specifici. Varianta cea mai des utilizata in ultima vreme este DAS ELISA care este de doua pana la cinici ori mai sensibila in detectarea proteinelor decat alte metode. 1.3. Tehnica benzilor identificatoare de proteine Aceasta tehnica se aplica pentru a detecta OMG in probe de frunze si seminte si se bazeaza pe formarea unor cupluri de anticorp-proteina tinta a caror prezenta este detectata cu ajutorul unui substrat cromogen. Este o tehnica rapida, ieftina, foarte usor de aplicat, ideala pentru un screening primar. Benzile indicatoare de proteine sunt astfel pregatite incat primul anticorp care este cuplat cu un reactiv de culoare si cel de-al doilea anticorp sa fie fixati in zone diferite. 2. Detectarea OMG cu ajutorul tehnicilor PCR Unele metode de investigatie se bazeaza pe analiza ADN si implicit pe multiplicarea unei secvente de ADN prin tehnica PCR, evidentierea fragmentului amplificat putand fi realizata fie pe parcursul, fie la sfarsitul reactiei. Pentru a fi posibila o reactie in lant a polimerazei trebuie indeplinite cateva conditii. In primul rand trebuie sa aiba o dispozitie ADN extras din proba de analizat la un grad de puritate sufficient de inalt pentru a fi inhibata actiuna polimerazei. Daca proba care face obiectul investigatiei este constitiuita din tesut vegetal proaspat se aplica metode uzuale de extractie si purificare a AND. Pentu verificarea calitatii ADN extras si purificat se initiaza reactii in care are loc amplificarea unor gene ce apartin speciilor analizate: gena care codifica lecitina atunci cand se testeaza soia

sau gena care codifica invertaza atunci cand se testeaza porumb. Pentru a fi posibila stabilirea succesiunii nucleotidelor polimerilor este necesara cunoasterea secventelor care flancheaza regiunea tinta. Analiza materialelor vegetale a produselor alimentare procesate cu ajutorul tehnici PCR presupune mai multe niveluri de investigatie. ( Fig. 2 )

A. Printr-un screening primar pot fi detectate foarte multe OMG fara a le identifica. Se cunoaste ca in procesul de modificare genetica a plantelor se folosesc in mod curent virusul mozaicului conopidei si secventa ternminala a genei care codifica noplain sintaza, provenita de la Agrobacterium tumefaciens. Desi se pot utiliza si alti promotori ca si alte sevcvente termninale aproape toate plantele modificate genetic contin cel putin o copie a secventelor mentionate ca parte a constructiei folosite pentru transformare. Probele in cazul carora rezultatul unui screening primar este pozitiv sunt supuse unor analize ulterioare cu scopul eliminarii rezultatelor

eronate si pentru identificarea tipului de OMG obtinut, iar pentru aceasta pot fi aplicate mai multe strategii. - screening de grup-se stie ca diferitele gene inserate in plantele modificate genetic pot caracteriza un grup de OMG, dar nu sunt specifice unui anumit organism transgenic .Concret, prezenta genei care codifica endotoxina Cry IA, provenita de la Bacillus thuringensis indica existenta unui porumb modificat genetic intr-o proba de porumb supusa investigatiei. Dar aceasta gena a fost utilizata pentru mai multe tipuri de OMG. Prin urmare metoda are specificitate de grup, nu de tip. Intr-un asememnea caz se poate recurge atat la metode imnunologice, cat si la amplificarea PCR. - screening de tip- este cunoscut faptul ca in procesele de transformare genetica a plantelor se utilizeaza constructii specifice pentru fiecare tip de OMG. Aceste constructii pot sa contina aceasi gena de interes, dar cuplarea acesteia cu genele reglatoare este intotdeauna diferita. Daca se cosidera secventa tinta jonctiunea dintre gena de interes si elementele reglatoare este posibila identificarea cu precizie a unui anumit tip de OMG. Se poate considera ca prin aceste metode poate fi identificata in mod specific contructia. Alte metode permit identificarea unui anumit eveniment de transformare. Se stie ca tehnologia actuala nu face posibil controlul pozitiei din genom in care se insereaza gena de interes. Daca un acelasi insert este integrat in genomul unui acelasi tip de organism de cateva ori, probabilitatea insertiei de doua ori in acelasi loc este neglijabila. In consecinta, jonctiunea dintre situsul de integrare si insert va fi unica pentru fiecare eveniment de transformare.

B. Dupa identificarea tipului de OMG prezent in proba analizata se trece la etapa urmatoare : cunatificarea continutului de OMG. In acest scop se aplica metode specifice care permit cuantificarea ADN ce constituie gena de interes. Se cuantifica secventa de ADN doarece daca modificarea genetica este nucleara exista o corelatie lineara intre cantitatea de OMG si cantitatea de ADN, corelatie care nu exista intre cantitatea de OMG si cantitatea de proteina codificata de transgena sau cantitatea de ARN. In functie de scopul urmarit pentru detectarea si cuantificarea OMG se utilizeaza in mod current mai multe strategii : PCR calitativ, PCR multiplex, PCR competitiv si real-time PCR. 2.1. PCR calitativ Aceasta metoda de analiza permite detectarea prezentei unei anumite secvente de ADN fara a oferi informatii referitoare la numarul de copii ale acesteia sau la cantitatea in care ea exista in proba supusa investigatiei, cu conditia ca secventele primerilor care flancheaza secventa de interes sa fie cunoscute. Secventele tinta pot fi gena de interes, promotorul, secventa terminala, jonctiunea dintre gena de interes si genomul plantei transformate sau dintre secventa reglatoare si gena de interes, in functie de nivelul de investigatie propus: detectie, identificare de grup, de tip sau a evenimentului de transformare. Este o metoda usor de aplicat, rapida si foarte sensibila ce poate fi utilizata numai in laboratoare de testare, dotate cu aparatura necesara. 2.2. PCR-ul cantitativ- competitiv (QC-PCr) Tehnologia QC-PCR reprezint o metod semicantitativ bazat pe PCR, care include coamplificarea ADN-ului-int transgenic cu un competitor, de obicei o gen de referin, care exist n mod normal

la planta respectiv ( de exemplu, gena zeinei ), cantitatea iniial a fragmentului competitor fiind prealabil cunoscut. Raportul dintre cei doi produi ai PCR, determinai prin electroforez, arat cantitatea aproximativ de secvene modificate genetic. O varianta mai complexa a PCR cantitativ competitiv este PCR cantitativ dublu competitiv care se bazeaza pe acelasi principiu aplicat insa de doua ori: o data unei gene specifice speciei si standardului ei intern si a doua oara unei gene specifice OMG si standardului intern corespunzator. Rezultatele obtinute in cazul ambelor amplificari PCR permite calcularea continutului de OMG luand in considerare cantitatea totala a acestuia in procesul derivat. Nici aplicarea PCR cantitativ competitiv nici a celui dublu competitiv nu necesita alte echipamente decat cele necesare pentru aplicarea PCR cantitativ, din cauza ca presupune realizarea unor standarde cu titlul de termeni de comparatie. 2.3.Real time PCR Real-time PCR reprezint o metod rapid (20 min.-2 ore), cu o sensibilitate i specificitate nalt de cuantificare a produselor de amplificare in timp real. Tehnologia permite determinarea cantitii de secvene amplificate, evitnd etapa de electroforez, ntruct cinetica acumulrii ampliconilor depinde direct de numrul de copii ale ADN-matrice. Principiul metodei const n determinarea fluorimetric a probei n timpul reaciei. Intensitatea emisiilor de fluorescen pn la atingerea etapei de saturare va fi proporional cu numrul de amplificri. Emisia de fluorescen poate fi perceput dup numrul minim de amplificri Ct , iar nivelul de la care se identific acest proces se numete prag de fluorescenta. Astfel cinetica reactiei este reprezentata de o curba ce consta in trei etape : 1) iniiere (cnd produsele PCR nu pot fi detectate);

2) exponenial (gradul de fluorescen este proporional cu numrul de cicluri); 3) saturare (gradul de fluorescen devine constant i nu depinde de numrul de cicluri). Realizarea cu succes a screening-ului PMG cu utilizarea Real-time PCR necesit condiii specifice, cu descrierea primerilor i probelor fluorescente pentru fiecare caz n parte. Actualmente, se disting mai multe metodologii ale procedeului Real-time PCR. Printre acestea se numr tehnologia TaqMan Assay Metoda respectiv este bazat pe utilizarea ADN-polimerazei cu activitate 5-exonucleazic. n volumul de reacie sunt adugate sonde ADN, n componena crora intr o particul marcat fluorescent, notat ca R (dispus la captul 5) i un inhibitor al fluorescenei, notat ca Q (dispus la captul 3), precum i o grupare fosfat n poziia 3, care blocheaz polimeraza. Sondele sunt complementare cu regiunea secvenei de ADN amplificat. Atunci cnd particula fluorescent este dispus n vecintatea inhibito rului, fluorescena nu este detectat. n procesul reaciei PCR, la etapele iniiale, are loc alipirea sondei la secvena complementar de ADN. Cu ct mai mult e produse de amplificare n reacia PCR se vor forma, cu att mai multe sonde se vor lega la ampliconul respectiv. n procesul etapei de elongare, polimeraza sintetizeaz catena complementar de ADN care, ajungnd la sond, ncepe scindarea acesteia, eliminnd i ndeprtnd particulele fluorescente de la inhibitor, astfel nct, concomitent cu procesul de amplificare, are loc emanarea fluorescenei, care este detectat de amplificator. Cu ct numrul de ampliconi va fi mai mare, cu att intensitatea fluorescenei va crete.

Parametrii sondei Taq-Man- raportul G / C de circa 2 0 - 8 0 % , Tm de 68 - 70 C , s nu conin mai mult de 4 nucleotide de acelai fel, care se repet consecutiv. Parametrii primerilor:- raportul G/C de 20 - 80%, Tm de 58 - 60 C, s formeze ampliconi de circa 50 pb, lungimea primerilor de 20 - 30 nucleotide. Parametrii reactiei de amplificare:primerii (300 nM fiecare), sonda (250nM), MgCl2 (3,5 nM), AmliTaqGold-polimeraza O alta varianta a Real-Time PCR-ului este tehnologia Molecular Beacons, n cadrul creia se utilizeaz sonde cu capetele terminale complementare, care la temperatura de topire a primerilor se unesc i formeaz complexe. ntruct secvena medie a sondei este complementar cu ADN-ul amplificat, la aceast etap sondele care nu s-au ataat la ADN matrice rmn n stare legat i nu emit fluorescen, deoarece agentul fluorescent i atenuatorul fluorescenei sunt vecini. Sondele care s-au hibridat cu ADN-matrice sunt n stare desfurat i nregistrate de amplificator. O alt tehnologie Real-time PCR include utilizarea a dou sonde cu transfer de energie prin rezonan ( Light Cycler assay) Principiul metodei const n faptul c energia se transfer de la un fluorofor dispus la captul 3 al primei sonde spre al doilea fluorofor dispus la captul 5 al celei de-a doua sonde. Distana dintre sonde este de 1 - 3 nucleotide. La alipirea simultan a celor dou sonde la ADN, energia eliminat de primul fluorofor este transmis celui d e-al doilea fluorofor, iar fluorescena este detectat de amplificator astfel emit fluorescen, fiind