29 de Marzo de 2008

Dra. Gabriela Villarreal Levy

Directora de Educacin Mdica Continua y Extensin, Escuela de Medicina

Dr. Jorge Santiago

OCD Professional Education Manager Latin America

Nuevas Tcnicas en Seguridad Microbiolgica

Inmunoensayos

Inmunoensayos
Son ensayos de laboratorio que permiten la deteccin de pequeas concentraciones de metabolitos.

En los inmunoensayos se utilizan antgenos o anticuerpos para el reconocimiento de la molcula que se desea medir.
Los diferentes tipos de inmunoensayos se diferencian en como se revela que la unin Ag-Ab se produjo.

Inmunoensayos
Los inmunoensayos pueden clasificarse de distintas maneras, por ejemplo:

De acuerdo a como se desarrolla la reaccin: En fase homognea (Inmunoturbidimetra, EMIT, etc.) En fase heterognea (Latex, ELISA, etc.)

Inmunoensayos
Otra opcin es clasificarlos de acuerdo a como se expresan los resultados: Cuantitativos El resultado obtenido indica una concentracin Cualitativos o Cut-0ff El resultado obtenido indica slo la presencia o ausencia de la molcula buscada

Inmunoensayos
Los ensayos Cut-off
Poblacin sana

Nmero de individuos

Infectados

Verdaderos Negativos

Verdaderos Positivos

Seal Falsos Negativos Valor Cut-off Falsos Positivos

Caractersticas de los ensayos

Especificidad
Sensibilidad Precisin y exactitud

Caractersticas de los ensayos

Especificidad
Sensibilidad Precisin y exactitud

Especificidad

En los inmunoensayos la especificidad est dada por la especificidad de la reaccin Ag-Ab misma. Est asociada al porcentaje de falsos positivos (FP) que se obtienen con una determinada tcnica.

Inmunoensayos
Los ensayos Cut-off

Resultado Positivo Negativo

Infeccin Presente Ausente VP FN FP VN

Especificidad
Infeccin Presente Ausente

Resultado

Positivo
Negativo

VP
FN

FP
VN

La especificidad se expresa como: VN E= VN + FP

Caractersticas de los ensayos

Especificidad
Sensibilidad Precisin y exactitud

Sensibilidad
Indica la mnima concentracin que una determinada tcnica permite medir de un determinado metabolito.
Debe adecuarse a las concentraciones que dicho metabolito tiene en el fludo biolgico en los que se desea realizar la medicin.

Sensibilidad
En los inmunoensayos la sensibilidad est determinada por la marca que permite revelar la reaccin Ag-Ab. Est asociada al porcentaje de falsos negativos (FN) que se obtienen con una determinada tcnica.

Sensibilidad
Infeccin Presente Ausente

Resultado

Positivo
Negativo

VP
FN

FP
VN

La sensibilidad se expresa como: VP S= VP + FN

Caractersticas de los ensayos

Especificidad
Sensibilidad Precisin y exactitud

Precisin y exactitud
Medicin exacta pero no precisa

Valor verdadero

Precisin y exactitud
Medicin exacta pero no precisa

Valor verdadero

Medicin precisa pero no exacta

Valor verdadero

Precisin y exactitud
Un sistema ideal de medicin sera aquel que mida siempre el valor verdadero, por supuesto ese sistema no existe. Qu es ms importante en el laboratorio? La precisin o la exactitud?

Precisin y exactitud
Un sistema ideal de medicin sera aquel que mida siempre el valor verdadero, por supuesto ese sistema no existe. Qu es ms importante en el laboratorio? La precisin o la exactitud?

Obviamente la precisin.

Precisin y exactitud
Ms an. Existe en realidad la exactitud? Por definicin la exactitud es una medida de cunto se acerca la media de las mediciones realizadas, al valor verdadero. Pero el valor verdadero es imposible conocerlo, por lo tanto la exactitud tiene slo un valor terico.

Precisin y exactitud
En los anlisis biolgicos no importan tanto los valores absolutos de concentracin sino la concentracin que un determinado metabolito presenta frente a su rango de referencia.

Si bien las calibraciones de los ensayos se realizan contra standards internacionales, cada tcnica presenta su propio rango de referencia.

Precisin y exactitud
Prolactina (ng/ml)
250

216.2
200 150

100 50 0
Access

98.6

Vitros ECi

DELFIA

ACS 180 Immulite

Axsym

Elecsys

Sociedad Argentina de Endocrinologa Ginecolgica y Reproductiva

Precisin y exactitud
Prolactina (ng/ml)
250

216.2
200 150

100 50 0
Access

98.6

Vitros ECi

DELFIA

ACS 180 Immulite

Axsym

Elecsys

Coef. Variacin %

3.66

1.30

1.66

3.48

1.51

5.70

2.47

Sociedad Argentina de Endocrinologa Ginecolgica y Reproductiva

Inmunoensayos ms habituales

Radioinmunoensayo (RIA) Enzimoinmunoensayo (EIA) Quimioluminiscencia (QL)

Radioinmunoensayo
El marcador es un tomo radioactivo. En general se usa 125I, aunque tambin se utiliza el tritio (3H). La lectura se realiza midiendo la cantidad de radioactividad en un contador de pozo.
Problemas: - Son lentos - Son difciles de automatizar - Tienen requerimientos regulatorios

Enzimoinmunoensayo
El marcador es una molcula de enzima (en general peroxidasa). La enzima acta sobre un sustrato cuyo producto final es coloreado. La medicin se realiza en un espectrofotmetro comn.
Problemas: - Son Poco sensibles

Quimioluminiscencia
Es la ltima tecnologa desarrollada. El marcador es una molcula c|apaz de emitir luz (en general luminol o steres de acridina).

Existen 4 generaciones de reactivos diferentes:

1) Quimioluminiscencia directa 2) Quimioluminiscencia indirecta 3) Electroquimioluminiscencia 4) Quimioluminiscencia amplificada

Quimioluminiscencia directa
En esta tcnica el anticuerpo est marcado directamente con la molcula luminiscente. Por lo tanto, por cada anticuerpo marcado se emiten una cantidad limitada de fotones.
Luz

Tiempo

Quimioluminiscencia indirecta
Funciona de manera similar al EIA. El anticuerpo est marcado con una enzima, sta acta sobre un sustrato que es el que emite la luz. Por cada anticuerpo marcado se obtienen muchos fotones.
Luz

Tiempo

Electroquimioluminiscencia
El anticuerpo queda marcado con un complejo Ru-TPA (Tripropilamina) Este complejo emite luz slo cuando es activado elctricamente. La energa necesaria para la emisin es provista externamente.
Luz

Tiempo

Quimioluminiscencia amplificada
Es una quimioluminiscencia indirecta. Tambin ac vamos a tener una enzima que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molcula que acelera la reaccin entre la enzima y el sustrato.
Luz

Tiempo

Quimioluminiscencia amplificada
Es una quimioluminiscencia indirecta. Tambin ac vamos a tener una enzima que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molcula que acelera la reaccin entre la enzima y el sustrato.
Luz

Tiempo

Quimioluminiscencia amplificada
Mecanismo de reaccin
NH2 COO

LUZ
N2

Acido 3-aminoftlico
NH2 O

COOH

Luminol
NH NH O N N

H2O
O

NH2

Ag

HRP
(+e)
NH2 O N N O O

+ HOO-

H2O2

Quimioluminiscencia amplificada
Mecanismo de reaccin
NH2 COO

LUZ
N2

Acido 3-aminoftlico
NHCOCH3 NH2 O

COOH

Luminol
NH NH

H2O
Cl O

NH2

O N N

Ag

HRP

(+e)

(-e)
NHCOCH3

+ HOO-

(+e)
NH2 O N N O

H2O2
Cl

OH

Potenciador

Caractersticas de la Quimioluminiscencia Amplificada

Quimioluminiscencia amplificada
Caractersticas
Es la ltima tecnologa de quimioluminiscencia desarrollada El potenciador multiplica la velocidad de la reaccin entre la enzima y el sustrato por un factor de 103 El sustrato se mantiene emitiendo luz durante 4 horas sin que se pueda detectar una cada en la emisin La emisin de luz es 106 veces ms brillante que en la quimioluminiscencia directa Presenta sensibilidades y rangos dinmicos mximos

Sensibilidad
Comparacin de sensibilidades
EIA FPIA Radioinmunoensayo Quimiolumiscencia indirecta

Mtodo de deteccin

10-14

10-15 10-16 10-17 10-18 10-19 10-20 10-21 Lmite mnimo de deteccin / moles de marcador

Sensibilidad
Comparacin de sensibilidades
EIA FPIA Radioinmunoensayo Quimiolumiscencia indirecta Quimiolumiscencia amplificada

Mtodo de deteccin

10-14

10-15 10-16 10-17 10-18 10-19 10-20 10-21 Lmite mnimo de deteccin / moles de marcador

Especificidad
Tal como dijimos, en los inmunoensayos la especificidad la aporta la reaccin antgenoanticuerpo misma.
Este tipo de reacciones son altamente especficas, pero con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales esta especificidad ha llegado a niveles sencillamente exquisitos.

Precisin
Luz emitida
Quimioluminiscencia amplificada

Indeterminaciones debidas al instrumento

Quimioluminiscencia directa

Indeterminaciones en la medicin final

Concentracin

Quimioluminiscencia Amplificada en el Banco de Sangre

Inmunoensayos
Los ensayos Cut-off
Poblacin sana

Nmero de individuos

Infectados

Verdaderos Negativos

Verdaderos Positivos

Seal Falsos Negativos Valor Cut-off Falsos Positivos

Inmunoensayos
Los ensayos Cut-off
Poblacin sana

Nmero de individuos

Infectados

Seal

Distribucin de resultados
ELISA anti-HCV
Pacientes no reactivos
1200
1000 800 600 400
253 704 578 190

n = 1229 pacientes
439

500

Pacientes reactivos

400 300 200

200
67

136 91

100
41 44
25 21 19 15 15 20 25 30 >30

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
Vitros anti-HCV
Pacientes no reactivos
1200
1000 800
671 1101

n = 1229 pacientes

500

Pacientes reactivos

400
305

300 200

600 400 200

88 30 48 24 9 6 3 2 18 5 6 8 17 15 20 25 30 >30 145 143

100
0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
anti-HCV
Pacientes no reactivos
1200
1000 800 600 400 200 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2,0 3.0 5.0 10 15 20 25 30 >30

n = 1229 pacientes

500

Pacientes reactivos

400 300 200

100
0

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
MEIA anti-HIV
Pacientes no reactivos
800
700 n = 865 pacientes
88

100

Pacientes reactivos

600
500 400 300 200 100 0
2 50 10 1 1 1 1 3 1 2 15 5 310 367

80
60 40
23

20 0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10

20

40

60 >60

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
Vitros anti-HIV
Pacientes no reactivos
800
700
716

n = 865 pacientes

100

Pacientes reactivos

600
500 400 300 200 100 0
19 2 1 2 2 2 15 20 40 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10

80
69

60 40
19

33

20 0

60 >60

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
anti-HIV
Pacientes no reactivos
800
700 n = 865 pacientes 100

Pacientes reactivos

600
500 400 300 200 100 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 40 60 >60

80
60 40 20 0

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
MEIA HBsAg
Pacientes no reactivos
800
700 n = 1208 pacientes 100

Pacientes reactivos

600
500 400 300 200 100 0
6 38 155 21 383 491 58

80
60 40 20 0

32

3 15

3 20 100 200 >200

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
Vitros HBsAg
Pacientes no reactivos
800
700
765

n = 1208 pacientes
80

100

Pacientes reactivos

600
500 400 300 200 100 0
15 190 133 3 5

80
60 40 20

1 15

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10

20 100 200 >200

Relacin de positividad

Distribucin de resultados
HBsAg
Pacientes no reactivos
800
700 n = 1208 pacientes 100

Pacientes reactivos

600
500 400 300 200 100 0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.0 5.0 10 15 20 100 200 >200

80
60 40 20 0

Relacin de positividad

Receso
Coffee Break

Los kits de deteccin de HIV de 4ta. Generacin

HIV
El virus

HIV
Las principales protenas
Denominacin
gp160 gp120 gp41 p55 Precursora del core p40 gag p24 p17 p66 Transcriptasa inversa p51 p31 Endonucleasa pol Protena principal Protena de la matriz

Protena
Precursora de envoltura Glucoprotena externa Glucoprotena transmembrana

Gen

env

SIDA, 1996-2000, REVISIN, Septiembre 1998

HIV
El diagnstico de la infeccin
No existe ninguna manifestacin clnica que sea caracterstica de la infeccin VIH o del SIDA y, aunque la presencia de alguna de ellas puedan sugerir en un contexto determinado la presencia de la infeccin, no es posible establecer un diagnstico clnico de la enfermedad por lo que ste solo se puede establecer de un modo definitivo por tcnicas de laboratorio (1)
(1) SIDA, 1996-2000, REVISIN, Septiembre 1998

HIV
Los mtodos diagnsticos

Tcnicas inmunomtricas
Mtodos directos Pruebas confirmatorias

Tcnicas inmunomtricas
Generaciones

Primera generacin
Segunda generacin Tercera generacin

Tcnicas inmunomtricas
Primera generacin
Deteccin de anticuerpos mediante EIA indirecto con antgeno obtenido de lisado vrico y anticuerpos policlonales
Fase slida

Antgeno proveniente de lisado vrico

Muestra del paciente

Anti-inmunoglobulina humana policlonal conjugada

Tcnicas inmunomtricas
Segunda generacin
Deteccin de anticuerpos mediante EIA indirecto con antgeno obtenido de lisado vrico y anticuerpos monoclonales
Fase slida

Antgeno proveniente de lisado vrico

Muestra del paciente

Anti-inmunoglobulina humana monoclonal conjugada

Tcnicas inmunomtricas
Tercera generacin
Deteccin de anticuerpos mediante EIA tipo sandwich o de inmunocaptura, con antgeno obtenido de protenas recombinantes y/o pptidos sintticos y deteccin conjunta de anticuerpos especficos IgG, IgM e IgA
Fase slida

Antgeno recombinante

Muestra del paciente

Anti-inmunoglobulina humana monoclonal conjugada

Mtodos directos
Miden en forma directa algn componente de la estructura viral Cultivo viral

Deteccin de antigenemia (p24) (ELISA)

Deteccin molecular de DNA provrico o RNA vrico

Pruebas confirmatorias

Western Blot (WB)

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Pruebas de cuarta generacin

El perodo ventana
Uno de los principales desafos que presenta el diagnstico del HIV en banco de sangre es el perodo ventana Este perodo es el lapso que transcurre desde el momento de la infeccin hasta el momento de la aparicin de algn marcador medible Obviamente los primeros marcadores que pueden encontrarse son los antgenos virales, en particular la protena p24 Al aparecer los anticuerpos anti-p24 la protena se hace indetectable pues queda enmascarada formando parte de complejos inmunes

Marcadores en la infeccin por HIV

Ag / Ab HIV RNA

Ab anti-p24

Ag p24 Das 0 Da 11 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Da 16 Da 22

G. Contreras Carrasco, Sociedad Espaola Interdiciplinaria del SIDA, Volumen 14, Nmero 3, Marzo 2003

El perodo ventana
De acuerdo al grfico precedente la determinacin conjunta de p24 y anticuerpos anti-HIV permitira la reduccin del perodo ventana en poco menos de una semana Por esta razn muchas legislaciones en el mundo comenzaron a exigir la determinacin tanto de Ag como de Ab como mtodos de screening Es decir que a cada donante se le debern realizar dos ensayos inmunomtricos en lugar de uno, lo cual conlleva un mayor gasto y una mayor complejidad desde le punto de vista operativo

Pruebas de cuarta generacin

Desde el ao 1997 se encuentran disponibles en el mercado los ensayos inmunomtricos llamados de cuarta generacin Estos ensayos permiten la determinacin simultnea de Ag p24 y anticuerpos anti-HIV con el objetivo de bajar el perodo ventana pero mediante un solo ensayo De esta manera se solucionaran los problemas de tipo econmico y operativos

Pruebas de cuarta generacin

Estrategia
Anti-p24 monoclonal Deteccin de Ag p24 Anti-p24 monoclonal conjugada

Muestra del paciente Deteccin de Ab Antgeno recombinante Anti-inmunoglobulina humana monoclonal conjugada

Pruebas de cuarta generacin

La principal pregunta que debemos hacer ahora es si realmente consiguen el objetivo buscado Lo que claramente se observa es una prdida de sensibilidad para los dos tipos de molculas que se estn midiendo, es decir tanto para p24 como para los anticuerpos En los ensayos tipo sandwich la sensibilidad viene determinada, entre otros factores, por la cantidad de sitios activos, por unidad de superficie, presentes en la fase slida

La sensibilidad
Distribucin de sitios en la fase slida
Medicin de Ag p24 (kits de tercera generacin)

Medicin de Abs (kits de tercera generacin)

Medicin de Ag p24 y Abs (kits de cuarta generacin)

Pruebas de cuarta generacin

Se han realizado estudios que vienen a demostrar que estos equipos, unos ms que otros, tienen ciertos inconvenientes que plantean limitaciones para su uso rutinario en el diagnstico de la infeccin. Por un lado, en relacin con la sensibilidad, se ha visto que en algunos de ellos el lmite de deteccin para el antgeno p24 est en 20 pg/ml, mientras que para los convencionales de tercera generacin est en 3-5 pg/ml. Por otro lado, los anticuerpos pueden perder hasta la tercera parte de su capacidad de unin con los antgenos. (1)
(1) G. Contreras Carrasco, Sociedad Espaola Interdiciplinaria del SIDA, Volumen 14, Nmero 3, Marzo 2003

Pruebas de cuarta generacin

Estos ensayos pierden algo de sensibilidad analtica en cada uno de sus componentes, de modo que el umbral de deteccin de antgeno es mayor, y lo mismo ocurre con los anticuerpos, observndose una reduccin en la seal de reactividad en las muestras en las que el antgeno desciende o desaparece. (1)

(1) Diagnstico de la Infeccin por el VIH, Manuel Rodriguez Iglesias y Alberto Terrn Perna

Marcadores en la infeccin por HIV

Ag / Ab Perodo ventana HIV RNA Ab anti-p24

Umbral Ag p24 Das 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Deteccin de p24

Deteccin de anticuerpos

Kits de tercera generacin

Marcadores en la infeccin por HIV

Ag / Ab HIV RNA Ab anti-p24

Umbral

Ag p24 Das 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Deteccin de p24

Deteccin de anticuerpos

Kits de cuarta generacin

Marcadores en la infeccin por HIV

Ag / Ab HIV RNA Ab anti-p24 Primera ventana Umbral

Ag p24 Das 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Deteccin de p24

Deteccin de anticuerpos

Kits de cuarta generacin

Marcadores en la infeccin por HIV

Ag / Ab HIV RNA Primera ventana Umbral Segunda ventana

Ab anti-p24

Ag p24 Das 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Deteccin de p24

Deteccin de anticuerpos

Kits de cuarta generacin

Pruebas de cuarta generacin

El primer hallazgo interesante, al utilizar los ensayos de cuarta generacin, es la aparicin de un segundo perodo ventana (1), (2)
Esto implica un acortamiento del perodo de deteccin del Ag p24 Consecuentemente tambin se demora la deteccin de los anticuerpos anti-HIV

(1) Meier T. et al.; J Clin Virol. 2001 Dec;23(1-2):113-6 (2) Speers D. et al.; J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):5397-9

Pruebas de cuarta generacin

(1) Frente

a paneles de seroconversin no todos los ensayos tuvieron la misma performance, habiendo diferencias en das al tiempo de obtener el primer resultado positivo (2). Al ensayar los ELISAs frente a muestras clnicas provenientes de pacientes en seroconversin hemos detectado que la mayor diferencia entre ellos es su sensibilidad para antgeno p24, en donde muestras antgeno p24 reactivo y anticuerpos negativo por ensayos de tercera generacin, no fueron detectadas por algn ensayo de cuarta generacin. (3)
Mara Beln Bouzas; Infeccin por HIV: Una revisin sobre la tecnologa en diagnstico Thoai D.L. et al.; J. Clin. Microbio. 2001; 39:3122-3128 Zapiola I. et al.; The 14 International AIDS Conference. Barcelona. July 2002.

(1) (2) (3)

Pruebas de cuarta generacin

El nmero de donantes que pudieran ser detectados durante el perodo de deteccin de la protena p24 es extremadamente bajo Peor an es el hecho de no saber realmente que cantidad de pacientes caen en esa segunda ventana inmunolgica, puesto que al ser negativos no se les requiere ningn ensayo posterior Estas razones han hecho que este tipo de ensayos prcticamente no sean utilizados

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