Prezentare la Enzimologie

Elaborat de catre st. gr BTI-091 Nemciuc Maria

Metode i tehnici utilizate n Enzimologie

tabilirea enzimei ce urmeaz! a "i obinut!#

$eci"icitatea de aciune $%-ul o$tim de aciune Tem$eratura o$tim! de aciune

&ondiiile alegerii tuil$inii microbiene#

! se dez'olte $e medii ct mai sim$le cu $utin! i ie"tine s! $roduc! ct mai $uini metabolii secundari enzima ce urmeaz! s! "ie obinut! s! "ie e($ortat! n mediul de incubare n aa "el nc)t s! "ie uor de izolat i $uti"icat s! nu "ie $oluante ! nu "ie $atogene i s! nu $roduc! metabolii to(ici ! nde$lineasc! condiiile *.+.,. &lonarea genei

&ulti'area tul$inii $roduc!toare#

Pe medii lichide Pe medii solide Pe medii submerse

E(tracia i $uri"icarea enzimelor#

-

Intracelulare .iz! su$limentar! a celulelor microbiene E(tracelulare/ $rin# &entri"ugarea 0iltrarea E'a$orarea Preci$itarea re'erisbil! .io"ilizarea

&omercializarea sub "orm! de# Pudre/ soluii/ cristale/ imobilizat!

E(tracia Enzimelor#

1mogenizarea esuturilor Izolarea structrilor subcelulare olubilizarea Enzimelor

Metode de e(tracie a Enzimelor#

Termo$reci$itarea Preci$itarea la $% izolectric Preci$itarea cu sol'eni organici Preci$itarea cu s!ruri neutre

2eterminarea acti'itatii enzimatice#

Masurarea gradului de trans"ormare al substarului Masurarea concentratiei $rodusului de reactie sau m!surarea cineticii de reactie/ urm!rite ntr-un inter'al de tim$ $rin metode "izice sau chimice adec'ate.

,cti'itatea enzimatica se e($rima cantitati' n unit!tile $ro$use de c!tre &omisia de Enzimologie 3&E4 si anume#

Unitatea de activitate enzimatica (U) re$rezinta cantitatea de enzima care catalizeaza trans"ormarea a 1 mol substrat5min n conditii standard 3678&/ $% si concentratie de substrat o$time49 Katalul (Kat) re$rezinta cantitatea de enzima care catalizeaza trans"ormarea a 1 mol substrat5s n conditii standard9 Activitatea specifica re$rezinta numarul de unitati enzimatice5mg $roteina 3:at5;g $roteina49 Activitatea enzimatica molara re$rezinta numarul de molecule de substrat trans"ormate de c!tre o molecula de enzima n tim$ de 1 minut sau 1 secunda 3:at5mol enzima4 32umitru si Iordachescu/ 19<14.

Metode de determinare a acti'itatii enzimatice#

Metode s$ectro"otometrice Metode "luorimetrice Metode titrimetetrice Metode calorimetrice Metode $olarimetrice Metodie radiometrice Metode cu enzime imobilizate Metode cu ;it-uri de reacti'i

,$licarea Metodelor la unele tu$uri de enzime#

Enzime de degradare a amidonului

Alfa- amilaza- metode 'ascozimetrice/ cu substrat colorat/ turbidimetrice/ colorimetrice/ gel di"uzie si glucid reducator. Beta-amilaza- multe metode $entru determinarea acti'itatii amilazei "olosesc/ ca substrat/ amidon solubilizat si masoara glucidele reducatoare Dxtrinaza limita- desco$erirea "a$tului ca $ullulan este un substrat e(celent $entru aceasta enzima a "acilitat determinarea ei. Metodele care utilizeaza acest substrat includ determinarea glucidelor sau micsorarea 'ascozitatii $roduse de actiunea enzimatica

Enzime proteolitice

Endo-enzime - n trecut au "ost utilizate metode de determinare a $rodusilor de reactie solubili din substrate/ cum ar "i hemoglobina sau cazeina/ $entru determinarea acti'itatii endo$roteolitice. Exo-enzime - aceste enzime sunt monitorizate/ in mod obisnuit/ $rin degradarea substratelor arti"iciale cu masa moleculara mica/ multe dintre ele "iind $rodusi de reactie cromo"orici sau "luorescenti.

Activitatea proteazelor este e($rimata n unitati# HU (unitati hemoglobina = $rin metoda ,>re-,nderson %emoglobin4. ,lte metode de determinare# $entru proteaze = unitati Northrop (NU4 $rin determinarea 'ascozitatii gelatinei.

Arabinoxilani si celulaze - ni'elul acestor enzime $oate "i masurat 'ascozimetric sau $rin $roducerea glucidelor reducatoare din substratele lor Endo beta glucanaze- im$ortanta acestor enzime in hidroliza glucanilor cu masa moleculara mare/ concomitent cu scaderea 'ascozitatii/ a a'ut ca rezultat dez'oltarea a numeroase metode de analiza. Totusi/ in general/ aceste metode $ot "i clasi"icate in ? mari $rocedee# metode 'ascozimetrice/ cresterea glucidelor reducatoare la hidroliza -glucanilor/ eliberarea unui cromogen dintr-un substrat -glucan/metode de di"uzie radiala

Ester hidrolaze

!ipaze si esteraze - acestea sunt determinate "olosind o triglicerida ca substrat si determinand acizii grasi liberi "ormati/ incluzand titrarea / gaz cromatogra"ia/ colorimetria sau scaderea turbiditatii. "osfataze - "itaza $oate "i determinata $rin masurarea cresterii "os"atului anorganic "ormat du$a degradarea enzimatica a acidului "itic sau "itatului. "osfatazele acide sunt determinate/ in mod obisnuit/ $rin "olosirea substratelor esterazei/ cum ar "i $-nitro"enilacetat/ $roducand/ du$a hidroliza/ un $rodus colorat.

#xidaze

$olifenol oxidaza - au "ost utilizati/ ca substrate/ di"eriti com$usi $oli"enolici. +eactia $oate "i monitorizata $rin "ormarea $rodusilor de reactie. Este necesar sa se masoare a$ortul direct de o(igen "olosind sus$ensii a$oase. $eroxidaza si catalaza - $ero(idul de hidrogen si un co-substrat/ utilizate $entru masurarea acti'itatii $ero(idazei. Metoda $oate "i realizata/ $rin masurarea $rodusilor de reactie colorati/ ti$ chinona/ care s-au "ormat. Intr-o alta metoda determinam scaderea concentratiei de $ero(id de hidrogen care a "ost determinata $rin reducerea dicromatului la acid cromic si masurarea culorii la 7@0 nm.

Acid ascorbic oxidaza - dis$aritia acidului ascorbic sau a o(igenului dizol'at $oate "i masurata $rin metoda. .ui *rant/ in care scaderea concentratiei acidului ascorbic este masurata du$a reactia cu 6/A-diclor"enolindo"enol. !ipoxigenaza - "olosesc substratul acid linoleic/ cu masurarea dis$aritiei o(igenului dizol'at. ,cti'itatea lipoxigenazei este e($rimata n unitati !U (unitati lipoxidaza%&