PRCTICA NMERO 4

HEMOPARSITOS

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HEMOPARSITOS

INTRODUCCIN Los protozoarios son los microorganismos que mayormente pueden parasitar la sangre del humano. Por lo que se hace necesario el conocer el tipo de clulas presentes en sangre que pueden ser parasitadas y los posibles parsitos que ms comnmente se presentan en sangre. Las Hemoparasitosis constituyen enfermedades ampliamente distribuidas en toda Amrica, al igual que sus vectores, causando efectos negativos en la salud de los rebaos animales y sobre la produccin y rentabilidad de los sistemas de produccin animal establecidos en las diferentes regiones del continente. Igualmente, la Trypanosomiasis en humanos (Mal de Chagas) ocasiona importantes problemas de salud en la poblacin humana americana.

Hemoparasito (Tripanosoma sp.) Existen diversas tcnicas para determinar los parsitos en sangre. Algunas sumamente sencillas y eficaces como son los frotis sanguneos, otros ms sofisticados pero muy precisos como son las tcnicas inmunolgicas, las cuales son indispensables de conocer por el Q.F.B. Los mtodos Inmunoenzimticos son las tcnicas que se estn utilizando actualmente y consisten en; Ser tcnicas que emplean antgenos, haptenos o anticuerpos marcados con una enzima. Se basan en la especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo y en la sensibilidad del sistema indicador. Existen dos tipos de inmunoensayos: homogneos y los heterogneos.

Tripanosoma cruzi
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Inmunoensayo homogneo: Se basa en los cambios de la actividad enzimtica, un hapteno es unido a la enzima de tal forma que altera su actividad cuando el hapteno se une al anticuerpo. Su uso se da sobre todo en; la deteccin de drogas de abuso, en la medicin de niveles teraputicos de drogas, etc. Ventajas; ensayo especfico, sensible, de amplia aplicacin, equipo requerido barato y disponible, reactivos baratos y de vida media-larga, potencialmente se puede automatizar y no tiene peligro de radiacin. Inmunoensayo heterogneo: Es el llamado Anlisis de inmunosorbente unido a enzimas (ELISA). Esta tcnica combina las ventajas de la Inmunofluorescencia y el radioinmunoensayo, superando las ventajas de otros mtodos. Se usa esta prueba para determinar y medir la presencia de sustancias con un PM mayor a los 10,000 Daltons. Ventajas; ensayo especfico, sensible, preciso y eficiente. Las tcnicas de ELISA pueden ser competitivas, no competitivas e indirectas. La variante no competitiva es la ms utilizada y se ver en forma demostrativa en la presente prctica y consiste en:
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El llamado ensayo inmunoenzimtico, ELISA indirecta, en esta tcnica el antgeno reacciona con un exceso estequiomtrico de anticuerpos y la reaccin antgeno-anticuerpo es medido en un segundo paso.

Tipos de ELISA. Se usan antgenos bivalente o polivalente y se siguen los siguientes pasos: 1. El anticuerpo especfico se inmoviliza en la fase slida, el anticuerpo no pegado se elimina por lavado. 2. La solucin conteniendo el antgeno se incuba con la fase slida sensibilizada, se elimina por lavado el antgeno que no reacciona. 3. El complejo anticuerpo-antgeno inmovilizado se incuba con un exceso de un segundo anticuerpo unido a la enzima, se elimina por lavado lo que no reacciona.

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4. Se adiciona el sustrato y el cambio de color es proporcional a la cantidad de antgeno presente en la muestra.

Se usa la tcnica para cuantificar los marcadores tumorales como antgeno carcinoembriognico, alfafetoprotena y otros antgenos como protenas, virus, bacterias, parsitos y hongos. Los elementos, que se usan en la tcnica de ELISA son: 1. Fase slida. 2. Etapas de lavado. 3. Muestra a ensayar. 4. Antgeno. 5. Conjugado (mtodos de Nakane o el de Avrameas). 6. Sustrato y cromgeno.

Placas para tcnica de ELISA (fase solida).

Pasos generales de tcnica de ELISA

Kit para pruebas de ELISA

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OBJETIVOS: 1. El alumno aprender a realizar tcnicas; hematolgicas para determinar los parsitos presentes en sangre. 2. Que el alumno tenga el conocimiento de las tcnicas que se utilizan en la actualidad para determinar parsitos presentes en sangre. 3. Familiarizar al alumno con el manejo de muestras sanguneas para su posterior anlisis. MATERIAL POR EQUIPO: 1. Microscopio. 2. Aceite de inmersin. 3. Fortis o preparaciones realizadas en la prctica anterior. 4. Canastillas para tincin o en su defecto cajas petri 5. Portaobjetos una caja. 6. Cubreobjetos una caja. 7. Laminilla de lectura de la tcnica de ELISA, una. 8. Lector de ELISA (preferentemente). REACTIVOS POR EQUIPO: 1. Metanol 100 ml. 2. Colorante de Giemsa 50 ml. 3. Colorante de Wright 50 ml. 4. Amortiguador de fosfatos para la tincin de Giemsa y para la tincin de Wrigth 100 ml. para cada uno.

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MTODO Utilice las laminillas obtenidas en la prctica nmero tres y talas con las tcnicas de Giemsa y/o Wright. *Los tiempo sealados para realizar las tinciones sern modificados de a cuerdo a la madurez de los colorantes. Tincin de Wright: 1. No es necesario fijar el frotis. 2. Coloque el portaobjetos en la canastilla para tincin y sumrjalas en el recipiente que contiene el colorante de Wright sumergiendo por completo la canastilla. 3. Despus de cinco minutos escurra la canastilla para eliminar los restos de colorante y sumerja la canastilla en solucin amortiguador (amortiguador de fosfatos o agua destilada) 4. Despus de cinco minutos enjuague con agua de la llave. 5. Deje secar y lea al microscopio, en seco dbil 10X, seco fuerte 40X y a inmersin 100X. Tincin de Giemsa: 1. En un frotis delgado es necesaria la fijacin con metanol. 2. Coloque los portaobjetos en canastillas para tincin y sumerjala en un recipiente con metanol durante veinte minutos. 3. Deje secar el frotis al aire.

4. Coloque la canastilla en el recipiente que contiene colorante de giemsa durante diez minutos. 5. Saque y deje secar la preparacin y lavar con solucin amortiguador (unas gotas del colorante en agua destilada) por 5 minutos. 6. Si se llega a sobre teir repita el lavado. 7. Seque y lea al microscopio a seco dbil 10X, seco fuerte 40X e inmersin 100X. *Es importante marcar los portaobjetos antes de realizar las tinciones, para identificar las diferentes preparaciones. Se recomienda el uso de lpiz con punta de diamante. *Para las improntas realizadas repita el proceso de esta tincin. Tcnica de ELISA: Esta tcnica la mayor de las ocasiones en este laboratorio se realiza nicamente de manera demostrativa por lo cual slo se muestra de manera general el procedimiento de la tcnica en tres de sus principales mtodos como se muestra en la siguiente figura.

Resultados de la tcnica de ELISA.

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pasos

ELISA directo Antgeno

Recubrimie nto de los pozos con: Lavado con regulador fisiolgic o (1) Bloqueo(2) Incubacin con: Lavado con regulador fisiolgic o: Incubacin con: Lavado con regulador fisiolgic o: Adicin de substrato (+ cromgen o) (6): Detencin de la reaccin (7): Lectura a la apropiada (8):

ELISA Indirec to Antgeno

ELISA en sndwich Anticuerpo (Ac)(5)

3 veces

3 veces

3 veces

+ AcEnzim a (3) 4 veces

+ Suero proble ma 3 veces

+ Antgeno problem a 3 veces

AcEnzim a (4) 4x

Ac-Enzima (5) 4x

1) Solucin salina (pH 6.0), solucin salina-fosfatos (pH 7.4), solucin salina-boratos (pH 8.4), etc. Algunos adicionan tween 20 del 0.01 al 0.05% a la solucin de lavado, otros no lo hacen. 2) Solucin de albmina, casena, gelatina o leche descremada al 23% en el regulador fisiolgico. 3) Anticuerpo especfico, acoplado a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, etc.). 4) Anticuerpos contra el antgeno problema, el primer anticuerpo (de captura) usualmente es monoclonal, el segundo anticuerpo (de deteccin), acoplado a una enzima, casi siempre es policlonal. 5) El substrato y el cromgeno (cuando este es necesario) dependen de la enzima. 6) La reaccin se detiene con diferentes reactivos, dependiendo del cromgeno. 7) La longitud de onda de lectura depende del color del producto de la reaccin enzima-substratocromgeno.

Cuadro 1.4.1 Pasos que se realizan en la tcnica de ELISA.

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Diagrama de flujo
TINCIN DE GIEMSA Fijacin del frotis con metanol

TINCIN DE WRIGHT

Tincin con colorante de Wright

Secar el frotis

Lavado con solucin amortiguadora de fosfatos

Coloracin con Giemsa

Lavado con solucin amortiguadora

Lavado con agua de la llave

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CUESTIONARIO 1. Cules son los protozoarios hemticos ms comunes en Mxico? 2. En qu casos se debe usar la tcnica de gota gruesa? 3. En qu caso se debe usar la tcnica de extensin de sangre? 4. En qu hemoparsitos se puede utilizar la tcnica de ELISA? 5. Qu otras tcnicas inmunolgicas se pueden utilizar en el diagnstico de hemoflagelados parsitos del hombre?

5. Rodrguez E. Manual ilustrado de parasitologa mdica. Mxico: Editorial Cuellar; 1998. 6. Sitites D. Inmunologa bsica y clnica. 7 ed. Mxico: Editorial Manual Moderno; 1993. 7. Rojas O. Espinosa. Inmunologa (de memoria). 3 ed. Mxico: editorial Mdica Panamericana; 2006.

REFERENCIAS 1. Biagi F. Enfermedades parasitarias. 3a ed. Mxico: Ediciones el Manual Moderno; 2004. 2. Tay Z.J, Velasco C, Gutirrez M. Parasitologa mdica. 7 ed. Mxico: Mndez Editores; 2002. 3. Romero R. Microbiologa y parasitologa humana: bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias. 3a ed. Mxico: Editorial Panamericana; 2007. 4. Capuccino J, Sherman N. Microbiology: a laboratory manual. 5a ed. USA: Benjamn/Cuminngs Pub Co Edition; 1998.

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