REZUMAT

al tezei de doctorat cu titlul :

EFECTELE UNOR PRINCIPII FITOTERAPEUTICE ASUPRA RADICALILOR LIBERI RESPONSABILI DE INSTALAREA STRESULUI OXIDATIV
Termenul de stress oxidativ a fost definit pentru prima dat n 1985 ca o alterare a balanei dintre pro-oxidani versus antioxidani, n favoarea primei forme [Sies, 1985]. Odat cu desluirea n amnunt a mecanismelor moleculare care conduc la instalarea stresului oxidativ, definiia stressului oxidativ a fost reformulat, astfel Dean Jones propune redefinirea acestui termen ca o ntrerupere a controlului semnalizrii redox [Jones 2006]. O abordare comun pentru evaluarea stresului oxidativ n sistemele biologice implic dozarea moleculelor redox sensibile, creterea sau scderea acestora ca rspuns la fenomenul de stres oxidativ. n sistemele biologice stresul oxidativ este caracterizat de urmtorii parametri: creterea i formarea de specii chimice cu caracter oxidant, scderea antioxidanilor cu greutate molecular mic i a celor lipo-solubili, tulburri ale balanei redox celulare, alterarea oxidativ a componentelor celulare (biomembrane, proteine, ADN, ARN, etc). Radicalii liberi sunt compui reactivi, produi n mod natural n corpul uman. Ei pot exercita efecte pozitive (asupra sistemului imunitar) sau negative (oxidarea lipidelor, proteinelor sau ADN-ului). Pentru a limita aceste efecte duntoare, un organism necesit o protecie complex reprezentat de sistemul antioxidant. Acest sistem este constituit din antioxidani enzimatici (catalaza, glutation peroxidaza, superoxid dismutaza etc.) i antioxidani neenzimatici (vitamina E-tocoferol, vitamina A-retinol, vitamina C-acidul ascorbic, glutationul i acidul uric). Defensiva endogen antioxidant proprie organismului, enzimatic sau non-enzimatic, poate fi suplimentat, prin hran, deci exogen, cu substane cu proprieti asemntoare celor enumerate mai sus [Hayes et al. 1999; Masella et al., 2005]. Dintre aceste substane, polifenolii din plante au fost intens studiai pentru proprietile lor antioxidante precum i proprieti de reglare celular [Hartman et al. 2006]. Polifenolii reprezint un grup de metabolii secundari ai plantelor, care sunt frecvent ntlnii n fructe, legume, plante medicinale, etc. * * * * 1

Teza redactat cuprinde un numr de 358 pagini, n care sunt incluse 54 tabele, 297 figuri i/sau grafice i 291 surse bibliografice. Teza este structurat n dou pri, respectiv studiul bibliografic i cercetrile proprii. Partea I, dedicat studiului bibliografic al cunotinelor n domeniu reprezint 29,20 % din lucrare, cuprinde un numr de 101 pagini n care sunt incluse 18 tabele i 39 figuri i a fost elaborat pe baza consultrii a 178 de titluri bibliografice, din care 75 % aprute dup anul 2000. Partea a II-a, rezervat cercetrilor proprii cuprinde un numr de 253 pagini care reprezint 70,80 % din coninutul tezei i include 36 tabele i 252 figuri i/sau grafice.

Partea I STUDIU BIBLIOGRAFIC

Partea I, reprezentat de Studiul bibliographic, este structurat n 2 capitole, respectiv: stresul oxidativ i compui polifenolici. n capitolul I Stresul oxidativ sunt prezentate consideraii generale ale stresului oxidativ, modalitile de formare intracelular a speciilor reactive de oxigen, modalitile de formare extracelular a speciilor reactive de oxigen, clasificarea speciilor reactive de oxigen, oxidarea biomoleculelor celulare (proteine, lipide, ADN), mecanismele de protecie ale organismului contra stresului oxidativ antioxidani enzimatici (superoxid dismutazele, catalazele, glucozo6fosfat dehidrogenaza, glutation peroxidaza) i antioxidani nonenzimatici (vitamina E, ubichinonele, carotinele, metalotioneine, glutationul, tioredoxinele, vitamina C). n capitolul II sunt prezentate datele generale despre polifenolii din plante, clasificarea acestora, oxidarea polifenolilor n reaciile antioxidante la care particip, reaciile polifenolilor cu proteinele. n acest capitol sunt descrise bioaciunile polifenolilor: aciunea mpotriva aterosclerozei i efectul cardioprotector, efectele neuroprotectoare i efectele mpotriva mbtrnirii, proprietile antiinflamatorii, proprietile anticarcinogene i antimutagene, efectele asupra aparatului digestiv, inclusiv asupra enzimelor digestive, modularea cilor de semnalizare ale transduciei indus de polifenoli, efectele protectoare asupra celulelor imunitii, stimularea activitii antialergice, efectele antidiabetice, reglarea ciclului celular, activitatea antimicrobian prezentat de unii polifenoli, efectele biochimice ale flavonoidelor (asupra hormonilor, asupra enzimelor). Ultima parte a capitolului II prezint activitatea prooxidant i efectele celulare ale radicalilor fenoxil i biodisponibilitatea polifenolilor (absorbia intestinal, mecanismele de conjugare i
transportul n plasm, concentraiile plasmatice, modaliti de excreie i captarea polifenolilor de esuturi).

Partea II CERCETRI PROPRII

Partea a II-a, rezervat Cercetrilor personale este structurat n 3 capitole, respectiv: materiale i metodele utilizate, rezultate i discuii i concluziile generale. n prima parte a capitolului 3 au fost prezentate scopul i obiectivele cercetrilor n care sunt prezentate scopul i obiectivele urmrite, respectiv: scopul tezei de doctorat a fost 1) mbogirea cunotinelor tiinifice referitoare la sursele i nivelurile de polifenoli din unsprezece plante medicinale din flora autohton i 2) determinarea capacitaii polifenolilor de a anihila radicalilor liberi: in vitro pe modelul emulsiei de acid linoleic i pe modele experimentale care decurg cu generare de radicali liberi i in vivo la animalele de laborator supuse unui stres oxidativ. Obiectivele tezei de doctorat au fost reprezentate de: extracia i izolarea polifenolilor din plante medicinale; analiza calitativ a polifenolilor din extractele alcoolice obinute din plante medicinale prin spectroscopie UV-VIS; analiza cantitativ a polifenolilor din extractele alcoolice obinute din plante medicinale (dozarea polifenolilor totali i a flavonoidelor); testarea capacitilor de anihilare a radicalilor liberi, de reducere i chelatare a ionilor metalelor tranziionale de ctre extractele alcoolice obinute din plantele medicinale. n scopul atingerii acestui obiectiv au fost detrminate: 1) capacitatea de anihilare a radicalilor liberi: 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), anionul superoxid (O2), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxil (HO), a radicalul oxid nitric (NO); i 2)capacitatea de reducere a ionului Fe3+, abilitatea extractelor de a chelata ionul Fe2+. determinarea activitii antioxidante a polifenolilor pe modelul emulsiei de acid linoleic: determinarea valorii de peroxid (PV), dienelor conjugate (CD) i substanelor care reacioneaz cu acidul tiobarbituric (TBARS); evaluarea procesului de peroxidare lipidic indus de stresul oxidativ la animalele de laborator: determinarea peroxizilor lipidici, determinarea substanelor care reacioneaz cu acidul tiobarbituric (TBARS), determinarea activitii unor enzime antioxidante i a glutationului redus. n acest capitol s-a efectuat o prezentare general a plantelor medicinale din care s-au obinut extracte polifenolice: suntoarea (Hypericum perforatum), pducelul (Crataegus 3

oxyacantha), trei frai ptai (Violae tricoloris), urzica (Urtica dioica), fasolea (Phaseolus Vulgaris), afinul (Vaccinium myrtillus), vscul (Viscum album), mrul lupului (Aristolochia clematitis), rostopasca (Chelidonium majus), pedicua (Lycopodium clavatum), schinelul (Cnicus benedictus), precum i modalitatea de obinere a extractelor alcoolice care au fost utilizate pentru cercetrile ulterioare. Caracterizarea primar a extractelor alcoolice a presupus: Analiza calitativ a extractelor alcoolice care s-a realizat prin determinarea spectrelor de absorbie UV-VIS; Analiza cantitativ a polifenolilor care a presupus determinarea polifenolilor totali i a flavonoidelor prezente n extractele alcoolice; Determinarea puterii reductoare a extractelor polifenolice: determinarea puterii de reducerea a ionului Fe III la Fe II i a ionului Mo VI la Mo V; Determinarea capacitii de chelatare a ionului Fe II de ctre principiile fitoterapeutice prezente n extractele alcoolice; Evaluarea capacitii de anihilare a radicalilor liberi: radicalului sintetic 1,1difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), anionul superoxid (O2), peroxidul de hidrogen (H2O2), radicalul hidroxil (HO) i radicalul oxid nitric (NO); Determinarea activitii antioxidante a polifenolilor din extractele alcoolice obinute din plantele medicinale menionate, pe modelul emulsiei de acid linoleic: a fost evaluat inhibarea formrii produilor primari (peroxizii lipidici i dienele conjugate) i a produilor secundari ai peroxidrii lipidice (substanele care reacioneaz cu acidul tiobarbituric (TBARS)). Evaluarea procesului de peroxidare lipidic indus de stresul oxidativ la animalele de laborator, s-a realizat prin: determinarea peroxizilor lipidici, i a substanelor care reacioneaz cu acidul tiobarbituric (TBARS) din omogenatele de ficat de oarece; determinarea activitii unor enzime antioxidante: superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT), glutation peroxidaza (GPX), glutation S transferazelor hepatice, glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH) din omogenatele de ficat de oarece; determinarea glutationului redus din omogenatele de ficat de oarece; determinarea proteinelor totale din omogenatele de ficat de oarece. n capitolul 4, dedicat rezultatelor i discuiilor, sunt prezentate rezultatele obinute la evaluarea parametrilor enumerai anterior. 4

n subcapitolul 4.2 au fost prezentate rezultatele analizei spectrelor UV-VIS ale extractelor alcoolice obinute din plante medicinale. Rezultatele obinute pentru extractele alcoolice din cele unsprezece plante investigate au fost comparate cu rezultatele obinute pentru diferite standarde ca: acid galic, acid cafeic, acid tanic, acid eleagic, acid clorogenic, quercitin, catehin, guaiacol. n subcapitolul 4.3 au fost redate rezultatele analizei cantitative a polifenolilor. Cea mai mare concentraie n polifenoli a prezentat-o extractul de suntoare (Hypericum perforatum) 40.43 3.09 mg echivalent acid cafeic /g substan uscat iar cea mai redus concentraie a prezentat-o extractul de fasole (Phaseolus Vulgaris) 7,46 1,29 mg echivalent acid cafeic /g substan uscat. De asemenea, Toate extractele alcoolice obinute din plantele medicinale aflate n studiu, au prezentat concentraii semnificative n compui flavonoidici. Cea mai mare concentraie a prezentat-o extractul alcoolic de afin (Vaccinium mirtillus) 2145,0 45,5 g equivalent quercitin/g substan uscat, iar cea mai mic extractul alcoolic de pedicu (Lycopodium clavatum) 334,0 24,8 g equivalent quercitin/g substan uscat. n subcapitolul 4.4 au fost analizate rezultatele obinute la evaluarea puterii reductoare i a capacitii de chelatare a ionilor metalelor tranziionale de ctre extractele alcoolice obinute din plantele medicinale investigate. Cea mai mare puterea reductoare, adic 3,81 0,23 mM echivalent FeSO4/g substan uscat, au prezentat-o extractele alcoolice de pducel (Crataegus oxyacantha) i afin (Vaccinium myrtillus). Cele mai mici capaciti de reducere ale ionilor de Fe3+ la Fe2+ le-au prezentat extractele alcoolice de pedicu (Lycopodium clavatum) 0,42 0,07 mM echivaleni de FeSO4/g substan uscat i cel de fasole (Phaseolus Vulgaris) 0,59 0,04 mM echivaleni de FeSO4/g substan uscat. Cele mai semnificative valori, n ceea ce privete capacitatea de chelatare, au fost nregistrate pentru extractele etanolice de trei frai ptai (Viola tricoloris) 63,35 15,09 %, urzic (Urtica dioica) 61,55 14,39 %, fasole (Phaseolus vulgaris) 61,01 15,21 % i rostopasc (Chelidonium majus) 67,61 15,62 % respectiv. Extractul alcoolic de pedicu (Lycopodium clavatum) a prezentat cea mai redus capacitate de chelatare a ionilor de Fe (II), i anume 14,55 4,55 %. Rezultatele privind determinarea capacitii de anihilare a radicalilor liberi de ctre extractele alcoolice obinute din plantele medicinale au fost prezentate n subcapitolul 4.5.. Toate extractele alcoolice obinute din cele 11 plante medicinale au prezentat importante capaciti de anihilare a radicalilor liberi (a radicalului 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), a anionului superoxid (O2), a peroxidului de hidrogen (H2O2), a radicalului hidroxil (HO) i a radicalului oxid nitric (NO)). Extractele alcoolice de suntoare (Hypericum perforatum) i de frai ptai (Viola tricoloris) au prezentat cea mai important valoare n ceea ce privete capacitatea de 5

anihilare a oxidului nitric (59.31 %). Extractul alcoolic de pducel (Crataegus oxycantha) a prezentat capaciti de anihilare a DPPH de 87,25 9,89 % i a peroxidului de hidrogen de 3.94 0.12 % care de altfel au fost cele mai mari capaciti de anihilare ale acestor radicali dintre toate extractele alcoolice obinute din plantele medicinale investigate. Extractul de afin (Vaccinium myrtillus) a prezentat cea mai important activitate de anihilare a anionului superoxid (63.33 12.09 %). Extractul alcoolic de Viscum album a prezentat cea mai important capacitate de anihilare a radicalului hidroxil 34,44 4,98 %. S-au studiat activitile antioxidante ale celor unsprezece extracte alcoolice obinute din plante medicinale pe modelul emulsiei de acid linoleic, utilizndu-se pentru comparaie un etalon de butilhidroxianisol (BHA), iar rezultatele au fost prezentate n subcapitolul 4.6. n acest scop, activitatea antioxidant a acestor extracte din plante medicinale a fost testat pe emulsie de acid linoleic, urmrindu-se valoarea de inhibiie a dienelor conjugate, valoarea de inhibiie a peroxizilor i valoarea de inhibiie a substanelor ce reacioneaz cu acidul tiobarbituric (TBARS) pe o perioad de 7 zile i la o temperatur de incubaie de 37C. n general, asupra emulsiei de acid linoleic, extractele alcoolice au manifestat efect de inhibiie a peroxidrii lipidice. n subcapitolul 4.7 s-au prezentat rezultatele obinute pentru efectul in vivo a extractelor obinute din plantele medicinale asupra stresului oxidativ. n acest scop s-au utilizat 120 soareci care au fost mprii aleator n 24 de loturi. Primul lot (G1) a fost utilizat ca martor pozitiv, oarecii din acest lot au fost inui n condiii adecvate, ei primind per os n fiecare zi ap distilat. Loturile G2 G12 cu oareci nestresai, au primit extracte obinute din plantele medicinale Lotul 13 (G13) a fost utilizat ca martor negativ, oarecii din acest lot au fost stresai prin modificarea orelor de lumin i orelor de ntuneric i au primit per os numai ap distilat. Loturile G14 G24 sunt loturi de oareci care au fost supui stresului datorat modificrii orelor de lumin i orelor de ntuneric, ns au primit per os extracte de plante medicinale. n vederea determinrii efectelor celor unsprezece plante medicinale asupra stresului indus animalelor de laborator, la nivelul ficatului s-au evaluat: peroxidarea lipidic au fost dozai peroxizii lipidici i substanele care reacioneaz cu acidul tiobarbituric (TBARS); marker-ii enzimatici ai stresului oxidativ: a fost evaluat activitatea enzimelor superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CAT), glutation peroxidaza (GPx), glutation S transferaza (GST), glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH); marker nonenzimatic al stresului oxidative - glutationul redus; proteinele totale din ficat. Testele efectuate au demonstrat c toate extractele polifenolice utilizate au prezentat capacitatea de a atenua, ntr-o msur mai mare sau mai mic, stresul oxidativ la oarece determinat de modificarea orelor de lumin i orelor de ntuneric. 6