Este un microscop special care mrete contrastul ntre diferitele structuri ale unui preparat proaspt sau nativ

(celulele sunt vii, nefixate i colorate)

Atunci cnd unda luminoas traverseaz structuri cu consistene diferite, aceasta este supus unui proces de defazare. Microscopul cu contrast de faz transform diferena de drum a razelor luminoase n diferen de amplitudine, perceptibil vederii. Pentru examinarea n contrast de faz, unui microscop obinuit i se ataeaz obiective speciale cu inel de faz i un diafragm inelar

Acest microscop permite studiul celulelor n stare vie, observndu-se astfel viabilitatea celular (micrile ciliare, flagelare, diviziunea celular, reacii celulare la diferii stimuli fizici i chimici). Permite de asemenea studiul culturilor de celule.

Cu acest microscop se studiaz fenomenul de birefringen (dubl refracie). Prezint dou prisme speciale numite nicoli, confecionate dintr-un material numit spath de Islanda Cele dou prisme poart numele de polarizor i analizor.

Birefringena se studiaz n poziie de nicoli ncruciai, atunci cnd planurile celor doi nicoli sunt perpendiculare Astfel, cmpul microscopului devine ntunecat iar dac structurile studiate sunt birefringente acestea apar intens strlucitoare.

Acest microscop se utilizeaz pentru examinarea structurilor cu aspect liniar (ex. fibrele de colagen, fibrele de mielin, fibra muscular striat) structurilor cu simetrie radial (ex. granule proteice, lipidice, colesterol) structurilor cu simetrie liniar (ex. membrane biologice).

Acest microscop studiaz fenomenul de fluorescen, fenomen luminos care ia natere n structuri biologice primare (naturale) sau secundare (artificiale). Metoda se bazeaz pe proprietatea unor substane care, iradiate cu un fascicol de lumin cu o lungime de und mic i cu frecven nalt, emit radiaii cu o lungime de und mare i o frecven joas lumina fluorescent. Microscopul cu lumin fluorescent este un microscop special care are ca surs de lumin o lamp tubular de cuar cu vapori de mercur sub tensiune nalt.

Microscopul este dotat cu filtre speciale i anume filtrul de excitaie situat n piciorul microscopului, ntre oglind i condensor, cu rolul de a opri toate radiaiile n afara U.V. Filtrul de protecie situat la nivelul ocularelor, cu rol de a proteja retina.

Fluorescena primar natural sau autofluorescena, este produs de substane care se gsesc n mod natural n celule sau esuturi : dintele natural, clorofila (rou), anumite virusuri, bacilul Koch (verde stralucitor), amine biogene fluorescena secundar artificial, provocat, este indus prin tratarea esuturilor cu fluorocromi, folosind metoda fluorocromrii cu acridin-orange. Fluorocromii sunt substane chimice cu proprietatea de a se fixa de anumite structuri din preparat i de a emite de la nivelul acestora lumina indus. Cu ajutorul fluorocromilor se pot identifica acizii nucleici (ARN - rou, ADN - verde-galbui), fibre de colagen elastice i de reticulin (verde), nucleii leucocitelor (verde), etc.

Coloraia cu acridin orange se mai utilizeaz n citodiagnosticul precoce al cancerului (studiul acizilor nucleici n condiiile unui proces tumoral) Cea mai important aplicaie este imunofluorescena care se bazeaz pe cuplarea unui acid nucleic cu un fluorocrom; prin fluorescena indus poate fi identificat reacia antigenanticorp, localizarea antigenelor n celul.

Microscopul electronic permite studiul detaliilor structurilor, datorit puterii de rezoluie ce depete cu mult puterea de rezoluie a microscoapelor fotonice Pentru obinerea imaginii utilizeaz fasciculul de electroni n locul fasciculului de lumin Microscoapele electronice moderne pot ajunge la magnificri de aproximativ 1.000.000 x

Din punct de vedere constructiv, microscopul electronic are o structur mult mai complex dect microscopul optic. Totui, prile principale ale microscopului electronic ndeplinesc aceleai funcii ca i lentilele microscopului optic. Ele sunt magnetice sau electrice, dupa cum devierea fasciculului de electroni are loc ntr-un cmp magnetic sau ntr-un cmp electric In cazul microscopului electronic, electronii pe toat traiectoria lor, de la surs pn la imaginea final, se deplaseaz n vid

Pentru ca imaginea electronic s fie vizibil, este necesar ca aceasta s fie transformat ntr-una luminoas. n acest scop, n planul imaginii finale se afla un ecran fluorescent Principiul de funcionare se bazeaz pe postulatul fizicianului francez Louis Victor de Broglie (1924), denumit i natura de und a electronilor De Broglie a stabilit c electronii au proprieti ondulatorii, adic le este asociat o und i din acest punct de vedere se aseamn cu fotonii. Aceast lungime de und a electronului se numete lungimea de und de Broglie i este dat de formula: = h / mV

 = lungimea de und a electronului h = constanta lui Plank (6,54 x 10-27 erg/s) v = viteza electronului m = masa electronului Dup 1970 microscopul electronic a atins apogeul perfecionrii, respectiv rezoluia limit care poate s o furnizeze lungimea de und a electronilor Cele mai perfecionate microscoape electronice, aflate n exploatare n diferite laboratoare, au rezoluii garantate de 2-3 (n condiii speciale atingnd 1,2 ) i puterea maxim de mrime pe placa fotografic de 800.000x

Folosirea intensiv a microscopiei electronice n biologie i medicin a nceput abia dup anul 1950, primele succese mai importante n studiul celulelor fiind legate de numele lui George Emil Palade (n.1912), citolog american de origine romn, unul din fondatorii biologiei celulare, laureat al Premiului Nobel pentru Fiziologie i Medicin n 1974

a)

b)

Clasificarea microscoapelor electronice se face n raport de tipul de construcie i destinaia lor. n biologie celular se folosesc de regul urmtoarele dou tipuri de microscoape electronice (ME) microscoape electronice de transmisie sau de tip TEM (Transmission Electron Microscope), folosite pentru investigarea structurilor i ultrastructurilor celulare. Imaginea electrono-optic se obine n urma traversrii electronilor prin preparat, fiind o imagine n plan microscoape electronice de baleiaj (scanning) sau de tip SEM (Scanning Electron Microscope) utilizate pentru explorarea tridimensional a suprafeelor celulare sau a suprafeelor organitelor citoplasmatice. Imaginea electrono-optic este rezultatul reflectrii electronilor de pe suprafaa preparatului pe ecranul fluorescent

Principalele elemente constructive ale microscopului electronic de transmisie (TEM) sunt urmtoarele : A. Coloana microscopului - component principal a ME B. Dispozitivele anexe - sistemul electronic, panoul de comand i sistemul de vid

Coloana microscopului sau sistemul optic este alctuit din: sistemul de iluminare n care intr tunul electronic i lentilele condensor, camera pentru preparat, sistemul pentru formarea imaginii, camera de observaie i camera fotografic Drumul fasciculului de electroni prin microscopul electronic TEM: - fasciculul de electroni traverseaz preparatul i cu ajutorul sistemului de formare a imaginii pe ecranul fluorescent se obine imaginea preparatului supus examinrii care apoi poate fi fotografiat

Elemente constructive ale microscopului electronic de baleiaj (SEM) Acest tip de microscop ofer imagini tridimensionale ale suprafeelor probelor de studiat, dar nu poate furniza detalii morfo-structurale din interiorul preparatului Difer de TEM prin faptul c fasciculul de electroni nu strbate preparatul, ci se reflect pe suprafaa lui microscoapele electronice de baleiaj sunt alctuite din urmtoarele 3 uniti funcionale distincte, legate ntre ele: - Sistemul electrono-optic - Sistemul de vid - Sistemul de operare i afiaj

Aplicaii practice ale microscopiei de baleiaj - Avnd n vedere particularitile constructive i funcionale ale microscoapelor de baleiaj, se pot obine nu numai date privind aspectul suprafeei unei structuri sau formei ei tridimensionale, ci i analiza unor propriti fizice i chimice ale preparatului - Practic microscopia de baleiaj ofer posibilitatea diferenierii proliferrilor limfocitare de tip T de cele de tip B, diferenierii histocitelor macrofage precum i a altor categorii de celule din seria mielomonocitar. De asemenea are numeroase aplicaii n biologia celular i molecular, patologie celular, oncologie, microbiologie, etc

Fotografierea n microscopia electronic Preparatele biologice folosite n microscopia electronic sunt deosebit de fine i supuse degradrii. De aceea pentru cercetarea imaginilor preparatului i interpretarea lor se efectueaz fotografii. Toate microscoapele electronice sunt prevzute cu dispozitive speciale de fotografiere, unele complet automatizate. De regul, o dat cu instalarea microscoapelor electronice se asigur i un laborator fotografic

Tipuri de informaii care se pot obine prin microscopie electronic: -Ultrastructura diferitelor tipuri de celule i a componentelor acestora n stare normal i patologic -Structura i configuraia macromoleculelor proteice -Procese de transcripie i translaie n codul genetic -Alctuirea molecular a virusurilor i mecanismul infeciei virale -Structura suprafeelor esuturilor, celulelor i biomoleculelor -Configuraia molecular a acizilor nucleici i stabilizarea greutii lor moleculare -Aciunea unor substane asupra structurilor (chimioterapie, pesticide) -Localizarea reaciilor imunologice i a activitii enzimatice -Analize de compoziie chimic -Transportul ionic prin celule -Procese de filtrare prin membrane -Biosinteza de proteine i structuri -Gradul de nrudire genetic dintre organisme.