DIFICULTATI ALE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR IN BOALA LYME Daniela Badescu, Ani Ioana Cotar, Cornelia Ceianu, Raluca Ioana

Gatej

INCDMI Cantacuzino

Ixodes ricinus: in stanga stadiul de larva si adult femela ; in dreapta stadiul de nimfa si adult mascul. Sursa: Institut de Zoologie,Neuchtel, Switzerland. 1 patrat mic = 1mm2

Aspecte clinice
Boala Lyme este in emisfera nordica una dintre cele mai frecvente boli infectioase transmise de capusa. Agentul patogen: Borrelia burgdorferi sensu lato - un complex de genospecii dintre care frecvent intalnite in Europa sunt 3: B.b. sensu stricto, B. afzelii, B. garinii. Vectorii: capuse din genul Ixodes. Evolutie multistadiala: -stadiul I (borrelioza localizata cu manifestari precoce) debut 3-4 zile 6 saptamani: eritem migrator (EM) limfocitom borreliozic (rar, mai ales la copii) -stadiul II (borrelioza diseminata cu manifestari precoce) debut 6-12 saptamani cateva luni: neuroborrelioza acuta - complicatia majora (~ 10% cazuri) paralizie nerv facial meningita limfocitara radiculonevrita eritem migrator multiplu artrita recurenta cardita recurenta (tulb de cond-bloc AV)

Eritem migrator

Aspecte clinice (continuare)

-stadiul III (borrelioza diseminata cu manifestari tardive la cei netratati) debut cateva luni cativa ani; neuroborrelioza cronica (encefalomielita) acrodermatita cronica atrofica (ACA) artrita Lyme Infectia cu B.b . poate fi asimptomatica!

Acrodermatita cronica atrofica

Diagnosticul in boala Lyme (I)

Diagnostic complex: EM : diagnostic clinic + date epidemiologice (muscatura de capusa, preferabil certificata de un medic zona endemica pt boala Lyme)

Testele de laborator nu sunt necesare. Se pot efectua: cultura din biopsii tegumentare pe medii speciale pentru borrelia (dificil ) testare serologica (IgM poate fi +/-) Limfocitom borreliozic : diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste de laborator (obligatorii pentru confirmare) teste serologice (IgM + ) frotiuri din tesut pentru examen histologic cultura din biopsii tegumentare vizualizare spirochete la microscopul cu camp intunecat /PCR (dificil)

Diagnosticul in boala Lyme (II)

Neuroborrelioza acuta : diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste de laborator (obligatorii pentru confirmare) detectie de anticorpi in probe de ser si lcr recoltate simultan cu evidentierea producerii intratecale de anticorpi IgM si IgG (index de anticorpi) detectie de benzi oligoclonale in lcr detectie de anticorpi in probe duble de ser cu modificarea semnificativa in dinamica a titrului de anticorpi cultura din lcr Cardita : diagnostic clinic +/- date epidemiologic + teste de laborator (obligatorii pentru confirmare) modificarea semnificativa in dinamica ( pe probe duble de ser) a titrului de anticorpi specifici IgG cultura din biopsii endomiocardice (+) vizualizare spirochete la microscopul cu camp intunecat /PCR

Diagnosticul in boala Lyme (III)

Artrita: diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste de laborator (obligatorii pentru confirmare) teste serologice (IgG +++) cultura din lichidul sinovial sau/si tesut vizualizare spirochete la microscopul cu camp intunecat , IF /PCR ACA : diagnostic clinic +/- date epidemiologic + teste de laborator (obligatorii pentru confirmare) teste serologice (IgG +++) ex histologic cultura din biopsie tegumentara vizualizare spirochete la microscopul camp intunecat , IF /PCR

Diagnosticul in boala Lyme (IV)

Neuroborrelioza cronica: diagnostic clinic +/- date epidemiologice + teste de laborator (obligatorii pentru confirmare) pleiocitoza limfocitara in lcr productie intratecala de anticorpi specifici (IgM si IgG prezenti in probe de ser si lcr recoltate simultan) IgG specifici +++ in ser detectia de benzi oligoclonale specifice in lcr

Nivelul seric al anticorpilor poate creste ca urmare a evolutiei bolii sau a instituirii tratamentului antibiotic si poate descreste in cursul procesului de vindecare recoltarea probelor biologice trebuie facuta la un interval de minimum 3 luni pentru a observa descresterea nivelului IgG.

Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (I)

Metode directe Microscopie - fara valoare diagnostica mare datorita numarului mic de spirochete din probele clinice - se utilizaeaza in corelatie cu cultura Cultura - test de confirmare; mediu BSK II, BSK-H; - in EM, ACA biopsii de tegument sensibilitate crescuta, in absenta tratamentului; rata pozitivitate ~ 80% sange rata pozitivitate 10 - 40% - in localizari extracutanate ale bolii sange, lcr, lichid sinovial sensibilitate scazuta - durata mare in timp (1-12 saptamani) - crestere lenta - costuri ridicate

Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (II)

Teste de biologie moleculara (PCR) - tintesc gene cromozomale si plasmidiale - in EM si ACA sensibilitate mai crescuta (aprox 64% si respectiv 54%) pe probe de tegument - in boala Lyme sensibilitate scazuta pe probe de sange (10-18%) - in neuroborrelioza pe probe de lcr sensibilitate mai buna in forma precoce acuta decat in cea tardiva - in artrita Lyme sensibilitate de aprox 80-90% pe lichid sinovial /membrana sinoviala mai ales la cei netratati (OspA) - per ansamblu sensibilitate scazuta

Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (III)

Metode indirecte Detectie de anticorpi in ser si lcr Imunofluorescenta indirecta (IFA) Teste imunoenzimatice (ELISA si western blot) cele mai utilizate Imunoprecipitare un test foarte specific (100%) si sensibil (98%): Luciferase Immunoprecipitation system (LIPS) care utilizeaza un antigen obtinut prin tehnici de recombinare (VOVO =VlsEOspCVlsEOspC).
Diagnosticul serologic este utilizat in mod curent in boala Lyme. In stadiul initial al bolii: predomina IgM, care se poate secreta in toate etapele bolii in absenta tratamentului; tinte antigenice: flagelina (p41), OspC, VlsE, p39 In stadiul II: IgM + IgG predominant; tinte antigenice : p39, p58, p83, VlsE, etc. In stadiul III: IgG titruri mari; IgM foarte rar detectabil; tinte antigenice: p83/100, p30, p39, p21, p58, p43, Osp17, etc

Dificultatile diagnosticului serologic:

Sunt legate in principal de : a) raspunsul imun particular al gazdei din cadrul bolii Lyme si b) dificultatea dezvoltarii de teste fata de multiplele antigene care se exprima diferentiat in cursul bolii a) Raspunsul imun al gazdei:

In faza initiala a bolii serologia poate fi negativa; Anticorpii de tip IgM pot fi absenti/nedetectabili prin metodele curente; IgM pot persista luni de zile; IgG pot persista si dupa remisiunea clinica a bolii; Existenta unor reactii incrucisate cu alte microorganismediagnostic diferential

Importanta interpretarii testelor de laborator in context clinic si epidemiologic!

Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (IV)

b) Dificultati ale dezvoltarii de teste fata de tintele antigenice mentionate: - expresia unor antigene diferite in functie de gazda (OspA la capusa nehranita OspC la cea care a avut o masa de sange pe mamifer) si de ciclul de evolutie al bolii - expresia unor antigene exclusiv in vivo la mamifere (VlsE,BBK32) - pierderea prin cultivare (pasaje multiple) a unor antigene codificate in plasmide Sensibilitatea si specificitatea truselor functie de tipul antigenelor si de stadiul de evolutie al bolii. SENSIBILITATE 20-50% in stadiul I 70-95% in stadiile II si III SPECIFICITATE 90-95% ELISA si WB cu antigene obtinute prin recombinare (obligatoriu 95% pentru WB)

Metode de diagnostic de laborator in boala Lyme (V)

Antigenele utilizate in truse ELISA : - lizate celulare reactii incrucisate ale proteinelor flagelare si heat-shock (famHSP60 si HSP70 omologie cu GroEL si DNaK de la E.coli) - antigene purificate si recombinate - ELISA avantaje: automatizare,exprimare cantitativa /semicantitativa Antigenele utilizate pentru WB: - sunt separate prin greutatea moleculara - utilizarea lor a permis identificarea celor imunodominante, cu specificitate inalta - dezavantaje: apreciere subiectiva a benzilor; - in prezent exista posibilitatea evaluarii automatizate (scanner)

Algoritm de diagnostic in boala Lyme (I)

ECDC, CDC, EUCALB (European Union Concerted Action on Lyme Borreliosis) si alte organizatii propun un algoritm de diagnostic serologic pentru boala Lyme in doi pasi (doua etape):

Un test ELISA cu sensibilitate crescuta urmat de un test WB cu specificitate mare pentru IgM si IgG.

Algoritm de diagnostic in boala Lyme (II)

Consideratii asupra rezultatelor serologice 2009-2010

Activitatea de testare serologica pentru cazurile cu suspiciune de boala Lyme se desfasoara in Laboratorul Infectii Transmise prin Vectori (ITV) din INCDMI Cantacuzino din anul 2006. Incepand cu anul 2010 laboratorul participa la programul de supraveghere a bolii Lyme in Romania, pentru zona de sud si est. Materiale si metode In anul 2009 (ianuarie-septembrie) s-au primit in Laboratorul ITV 615 probe de ser si lcr provenind de la 582 cazuri cu suspiciune de boala Lyme . In anul 2010 in aceeasi perioada s-au primit 696 probe provenind de la 652 cazuri cu aceeasi suspiciune de boala . Probele au fost trimise de DSPJ, spitale, laboratoare si clinici private.

Repartitia probelor (ser, lcr) in functie de provenienta

Probele clinice (ser si lcr) au fost testate cu trusele de diagnostic in vitro ELISA (IgM / IgG Mikrogen si Euroimmun) si Western blot (IgM / IgG Line Immunoblot Virotech) . Trusele ELISA au o sensibilitate >95%, iar cele WB au o specificitate de 97,2% Antigenele purificate si recombinate din WB sunt : OspC, VlsE, BmpA (p39), p83, BBA36 (iv1), BBO323 (iv2), Crasp3 (iv3), PG (iv4), EBV. (iv 1-4) antigene exprimate in vivo. Criterii de interpretare a testelor WB IgM Nici o banda / benzi < cut-off Sau IgG Nici o banda /benzi < cut-off / 1 banda IgG (nu VlsE) IgM 1 banda (nu OspC) Sau Echivoc IgG VlsE IgM OspC / 2 benzi IgM Sau Pozitiv IgG 2 benzi

Negativ

Rezultate
Lunile I-IX 2009: 615 probe (ser, lcr) testate 84 pozitive testate exclusiv prin ELISA 42 pozitive testate exclusiv prin WB 12 cazuri pozitive (ELISA +WB) Din 615 probe testate 465 au fost negative (75%). Lunile I-IX 2010: 696 probe (ser, lcr) testate 99 pozitive testate exclusiv prin ELISA 29 pozitive testate exclusiv prin WB 14 cazuri pozitive (ELISA+WB) Din 696 probe testate 540 au fost negative (77%).

126 total

128 total

11 cazuri din 12 pozitive in 2009 si 12 din cele 14 pozitive in 2010 au fost de la DSPJ! De ce? Necunoasterea algoritmului de diagnostic si a definitiei de caz de catre unii medici din sistemul sanitar public si privat Recoltare de seruri prematur fata de momentul debutului bolii Dificultati financiare

Repartitia cazurilor pozitive in functie de respectarea algoritmului de diagnostic

Teste western blot IgM si IgG

2 3 4 5

6 78

1 23
1-3 seruri pacienti; IgG pozitiv nr.1si 2

1-8 seruri pacienti; IgM pozitiv nr.3, 4, 7

Concluzii

Implementarea supravegherii pentru boala Lyme a determinat: o crestere de 3 x in anul 2010 fata de 2009 a numarului de probe clinice (ser si lcr) trimise de catre DSPJ pentru testare/confirmare la Institutul Cantacuzinocresterea sanselor de diagnosticare a acestei boli cu potential ridicat de cronicizare in absenta unui tratament corect.
- orientarea diagnosticului unor pacienti spre alte entitati clinice cu evolutie potential grava, care constituie diagnosticul diferential al bolii Lyme (boli autoimune, sifilis, infectii cu EBV). Se impune ca o necesitate cunoasterea definitiei de caz si a algoritmului de diagnostic pentru boala Lyme de catre toti cei implicati in activitatea de sanatate, atat in sistemul public cat si in cel privat (medici de familie, medici de diferite specialitati-infectionisti, dermatologi, neurologi,etc)

Concluzii
Dificultatile legate de testarea serologica in doua etape a probelor clinice trebuie sa constituie un stimul pentru gasirea si implementarea de modalitati noi de testare/confirmare, intr-o singura etapa, a cazurilor de suspiciune de boala Lyme (vezi testul LIPS).
Extinderea testarii cazurilor pentru care se infirma diagnosticul de boala Lyme si pentru alte infectii transmise prin vectori.

Initierea unui program la scara nationla cae sa studieze circulatia spirochetei Borrelia burgdorferi la nivelul vectorului Ixodes.
Cea mai importanta concluzie: SUPRAVEGHEREA BOLII LYME CONTINUATA!

IN

ROMANIA

TREBUIE