UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR Practica no 1: Purificacin de una enzima la lisozima de huevo. Dr.

Misael Garza Lpez

Equipo no.5 Valeria Hernndez Carrillo Aldo Cortes Mndez Marco Antonio Campos Paola Gasca Quintana Velasquet Briseo Jared Gabriela Rosas Reyes

Introduccin
Se conoce por lisozima o muramidasa ( pptidoglicano N-acetil-muramil hidrolasa EC 3.2.1.17) a los componentes de un conjunto de enzimas cuya funcin caracterstica es hidrolizar los enlaces -glicosdicos (1-4) presentes entre los residuos de Nacetilglucosamina (NAG),y N-acetilmurmico (NAM), principales determinantes de la estructura tridimensional de la pared celular bacteriana. Su actividad bacterioltica fue descrita en 1922 por Fleming (1).Su actividad ptima tiene lugar a pH 5.37-6.72 y T 2555 C. La lisozima est presente en lgrimas, mucus nasal, plasma sanguneo y en otras secreciones y tejidos. La ms estudiada es la lisozima de clara de huevo de gallina, que se caracteriza por tener una cadena polipeptdica de 129 aminocidos (14,6 kD) con cuatro enlaces disulfuro . El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrlisis de enlaces glicosdicos (14) de los polisacridos de pared celular bacteriana. Son protenas globulares constituidas por una sola cadena polipeptdica (129 aminocidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 kDa. Estas protenas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera protena secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso un modelo tridimensional (usando cristalografa de rayos X) y la primera para la que se propuso un mecanismo de accin detallado

Hiptesis:
La enzima lisozima purificada mediante cromatografa de intercambio catinico a partir de la clara de huevo tiene una actividad enzimtica con respecto a la bacteria Bacillus subtilis diferente para cada etapa de su purificacin.

Materiales por grupo:

Glicina NaOH NaCl HCl

H2O Destilada PO4H2Na PO4HNa2 Carboximetil celulosa

Centrifuga para tubos de 15 ml Espectrofotmetro (medida de absorbancia a 450 nm)

Por equipo:
2 celdas de 5 ml para espectrofotmetro 5 tubos cnicos con tapn de 15 ml 1 tubo cnico graduado 5 tubos Eppendorf de 1.5 ml

Metodologa
Para poder purificar la enzima lisozima a partir de la clara de huevo, mediante cromatografa de intercambio inico necesitaremos prepara dos tampones.

Tampn A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10

Tampn B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl

Pesar en bscula

0.24 gr. de NaOH (2 porciones) 0.28 gr. de Glicina (NH2CH2COOH NH2CH2COOH- 2 porciones) 3.36 gr. de NaCl 2 gr. de Carboximetil celulosa.

En un vaso de precipitado de 250 ml, recoger solo la clara de un huevo (romper el huevo por la parte superior de ste haciendo ligeramente un orificio, esto para evitar que la yema del huevo caiga en el vaso)

Preparacin del tampn A

En un vaso de precipitados de 250 ml, verter 40ml de agua destilada, agregar los 0.24gr. de NaOH junto con los 0.28 gr. de Glicina y colocar dentro del vaso el agitador magntico (mosca). Agitar por 5 min. hasta que se all disuelto por completo el NaOH y la Glicina. Verter la solucin en el matraz y aforar con agua destilada a 100 ml, etiquetar como solucin A.

Preparacin del tampn B En un vaso de precipitados de 250 ml, verter 40ml de agua destilada, agregar los 0.24gr. de NaOH junto con los 0.28 gr. de Glicina y colocar dentro del vaso el agitador magntico (mosca). Agitar por 5 min. hasta que se all disuelto por completo el NaOH y la Glicina. Agregar a la solucin los 3.36gr. de NaCl, agitar por otros 5 min. para que se disuelva completamente. Colocar la solucin en el matraz y aforar con agua destilada a 100ml, etiquetar como solucin B.

I.-Diluir la clara de huevo con el buffer A en un porcin de 1/5 (vol/vol). Con ayuda de una pipeta de 10 ml diluir en un vaso de precipitados de 250 ml, 10ml de clara de huevo y 40 ml del buffer A. Antes de comenzar la purificacin de la lisozima separar una alcuota de 1 ml en un tubo Eppendor de 1.5 ml Etiquetar con la notacin F0 y el nmero del equipo, para medir la actividad de la enzima en la fraccin de partida.

II.- A los 49 ml restantes, aadir 2 gr. de Carboximetil celulosa (CMC), agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina. Ya que se all disuelto la CMC tomar en un tubo cnico con tapn de 15 ml una muestra de 9 ml.

III.-Centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min.

Tomar una alcuota de 1 ml en un tubo Eppendor de 1.5 ml y etiquetar con la notacin F1 y el nmero del equipo, guardar el sobrenadante.

IV.- Al sobrenadante se le agregan 10 ml del buffer A Centrifugar a 600 rpm durante 3 min Tomar una alcuota de 1 ml en un tubo Eppendor de 1.5 ml y etiquetar con la notacin F2 y el nmero del equipo, Ya que se tengan las cuatro muestras bien identificadas, guardar en un recipiente etiquetado con el nmero del equipo y entregar al profesor encargado.

RESULTADOS
Volmenes Absorbancia Absorbancia Absorbancia A2/min a T0 a T1 a T2 1.177 1.154 1.139 1.137 1.174 1.142 1.129 1.132 1.166 1.146 1.130 1.130 0.003 0.003 0.006 0.005 A2/min Actividad (U) 5.5 4 4.5 3.5 F0 F1 F2 F.3

0.0055 0.0040 0.0045 0.0035

CALCULOS:
1. Actividad de cada fraccin 2. % Retencin de la resina: (Actividad F0 Actividad F1 x 100) / Actividad F0 = % Retencin

(5.5--4)(100)= 27.2 (5.54.5)(100)= 18.1 (5.53.5)(100)= 36.3% retencin

3. % de Recuperacin: (Actividad F3 x 100) / Actividad Fo = % Recuperacin

(3.5)(100)/5.5 = 63.6% recuperacin

Suma (36.3% de retencin)+ (63.6% de recuperacin) = 99.9 %

ANLISIS DE RESULTADOS
Se observ en la purificacin de la lisozima realizada mediante la colecta de la clara de huevo, despus de ser diluida 1/5 (vol/vol) con tampn A y tomar 10 ml de la muestra anterior en un tubo cnico con tapn de 15 ml, que es importante tener en cuenta que antes de empezar la purificacin se debe separar una alcuota de 1 ml para, despus, medir la actividad de la enzima en esa fraccin. Tambin se debe tener precaucin al aadir 4 ml de Carboximetil- celulosa a la F0 (fraccin cero), el agitado y al centrifugar ya que, ser determinante para obtener resultados adecuados en las siguientes F (fracciones). En cuanto a la medida enzimtica, la medida de la actividad lisozima mediante la utilizacin del microorganismo Bacillus subtilis, el equipo de trabajo considera que el resultado fue bueno ya que al incubar la suspensin con lisozima, los fragmentos de pared celular de nuestro microorganismo se hidrolizan, lo que reduce la dispersin de la luz que se manifiesta en una reduccin en la absorbancia. La actividad enzimtica es proporcional a la disminucin de la absorbancia a 450 nm. Se puede observar en nuestros resultados que 1 unidad de actividad enzimtica de lisozima (U) produce una disminucin en la absorbancia de 0.001 en 1 minuto.

CONCLUSIN

Se purific la enzima lisozima a partir de la clara del huevo y almacenamos de forma segura la fraccin 3 para usarse como material de anlisis en las prcticas posteriores. La prctica 1 se realiz en dos sesiones, y al medir la actividad enzimtica con el microorganismo, se obtuvo la comprobacin de nuestra hiptesis.

BIBLIOGRAFA
1. Fleming A. & Allison V. D.(1992). Observations on a bacteriolytic substance (lysozyme) found in secretions and tissues. (Br .J. Exp. Pathol. 13, 252-260) 2. Blake, C.C.F., Mair, G.A., North, A.C.T., Phillips, D.C. and Sarma, V.R. (1967) On the conformation of the hen egg-white lysozyme molecule. ( Proc. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci. 167, 365-377) 3. Morsky P. (1983). Turbidimetric determination of lysozyme with Microccocus lysodeikticus cells: reexamination of reaction conditions (Anal. Biochem.128, 177-185). 4. Bradford M. (1976).A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. (Anal. Biochem. 72, 248254)