Sunteți pe pagina 1din 62

CONF. DR. B.

VOICULESCU

Fecundatie
Procesul de unire a spermatozoidului cu ovocitul

secundar
Numarul de cromozomi este restabilit Initierea dezvoltarii unui individ ce respecta

caracterele speciei

Actorii fecundatiei - OVOCIT


Inconjurat de cumulus ooforus, al carui strat intern se

numeste corona radiata si de zona pellucida Se elibereaza din folicului de Graaf in trompa uterina in cursul ovulatiei Ovocitele prezinta microvili circumferential la nivelul membranei, cu exceptia zonei aflate in dreptul fusului de diviziune Microvilii incercuiesc capul spermiei, inainte de fuziunea propriu- zisa Interactiunea dintre cele 2 celule are loc numai in zonele cu microvili
3

Cumulus oophorus
Celule foliculare de tip granulos ce inconjoara ovocitul Se extinde postovulator prin depunerea unui matrix de

proteoglicani, avand component major acidul hialuronic Stratul cel mai intern al cumulus oophorus de numeste corona radiata Intre celulele CO si ovocit - jonctiuni gap care strabat zona pellucida si se termina la nivelul ovolemei

Expansiunea cumulus oophorus


Se face prin sinteza si stabilizarea matrixului extracelular

de catre celulele CO Sinteza de acid hialuronic de catre celulele CO Are loc sub actiunea : unor factori paracrini secretati de ovocit
CGF-9 BMP 15 - activarea caii Smad 2/3; are si rol antiapoptotic

pentru celulele CO

FSH hipofizar

Stabilizarea - Legaturi intre lanturile de AH - legaturi ionice si covalente

Rolurile cumulus oophorus


Nutritiv pentru ovocit (ovocitul preovulator se gaseste

la distanta de orice sursa vasculara) prin jonctiunile gap Transfer de molecule reglatorii si metaboliti prin jonctiunile gap Maturarea citoplasmei ovocitului Mentinerea ovocitului in profaza I a meiozei Participa la fecundatie - conduce spermia catre ovocit

Zona pellucida
Invelis glicoproteic in jurul ovocitului Bariera specio-specifica pentru legarea si penetrarea

spermiilor (impiedica penetrarea cu spermiile altor specii) Eficienta nu este 100 % (cal + magar, unele specii de maimute) Indepartarea ZP - spermii de la alte specii pot penetra Test pentru fertilitatea masculina - fertilizarea ovocitului fara ZP de hamster de catre spermiile umane (HZFO test=hamster zona-free ovum test) normal= fecundatia a peste 25 % din ovocite

Zona pellucida
Formata din 3 glicoproteine majore: ZP3 mediaza legarea specifica a spermiei de zona pellucida ZP2 mediaza legarea secundara a spermiei ZP1 legarea incrucisata a lanturilor ZP2 si ZP3, formand o retea de proteine; nu este esentiala pentru fertilizare, dar este importanta pentru integritatea structurala a ZP la om s-a descoperit ZP4, dar nu se cunoaste functia Soarecii cu ZP1 mutata produc embrioni a caror ZP este eliminata prematur, cu probleme de dezvoltare

Actorii fecundatiei - SPERMIE


In mod normal, doar unul intra in contact cu

membrana plasmatica a ovocitului Strabate zona pellucida, in acest timp suferind transformari importante Fuziunea incepe in dreptul segmentului ecuatorial, aflat intre membrana acrozomala interna si membrana corespunzatoare nucleului, din regiunea posterioara a capului

13

Capacitatie
Totalitatea modificarilor fiziologice ale

spermatozoidului, care au loc in tractul genital feminin si au rolul de a il face capabil de fertilizare Spermiile din sperma proaspat ejaculata nu pot fecunda ovocitul secundar Dureaz aproximativ 5-7 ore, fiind maxim n trompa uterin. Este o etap absolut necesar pregtirii spermiei pentru penetrarea coronei radiata si pentru declansarea reactiei acrozomiale.

Capacitatie
- activarea motilitatii spermiei si mai tarziu a

hipermotilitatii - modificari ale concentratiilor ionice intracelulare: eflux de potasiu, influx de calciu si anion bicarbonic. - schimbarea fluiditatii membranare prin inlaturarea colesterolului cu ajutorul unor molecule care il leaga (acceptoare) - modificari ale proteinelor membranare prin fosforilare protein-tirozin kinazica - dezorganizarea bistratului lipidic (prin modificari ale fosfolipidelor membranare), in vederea fuziunii membranei acrozomiale externe cu membrana spermiei.

Activarea motilitatii spermiilor


proces precoce gametii de la nivelul epididimului sunt mari consumatori

de oxigen, dar sunt imobili Miscarea incepe imediat ce sperma vine in contact cu HCO3- si Ca2+ , prezenti in concentratie mare in tractul genital feminin. Acesti ioni au rolul de a activa un tip unic de adenilat ciclaza - SACY (sperm adenylyl cyclase), crescand AMPc intracelular. Cresterea lui activeaza protein-kinaza A (PKA), care fosforileaza o serie de proteine tinta ce determina activarea motilitatii spermiei.

Eliberarea colesterolului din membrana


proces tardiv are loc datorita existentei in mediu a unor molecule ce

leaga colesterolul (albumina serica, lipid-transfer protein 1 - LTP 1). impreuna cu influxul de HCO3- si Ca2+, produce hiperactivarea motilitatii spermiilor. produce si fluidizarea membranei (destabilizarea acesteia), cu scaderea raportului colesterol/ fosfolipide si cresterea permeabilitatii pentru ionii de calciu. Influxul de ioni de calciu este elementul trigger al reactiei acrozomiale.

Modificarea fosfolipidelor membranare


Proces tardiv Necesar pentru a putea avea loc fuziunea celor doua

membrane (acrozomiala externa si a spermiei), in vederea reactiei acrozomiale. Se produce o metilare a fosfolipidelor si sinteza fosfatidiletanolaminei din fosfatidilcolina, astfel incat sa nu se formeze un bistrat lipidic, pentru a se permite fuziunea.

Caractere specifice ale fecundatiei


Fazele finale ale gametogenezei pregatesc gametii pentru

fertilizare - Ovocitul eliberat de foliculul Graafian - maturare meiotica - Spermia - capacitatie In trompe - nr mic de ovocite - 1 la om, 10 la soarece nr mic de spermii la locul fertilizarii- 100- 150/ comparativ cu cate sunt depuse prin ejaculare 0, 002 % din spermii ajung in trompa

21

Caractere specifice ale fecundatiei


Chemotaxia spermiei - nu este specio-specifica - doar o mica populatie din spermii au comportament

chemotactic - sursa de factor chemotactic - nu este ovocitul, ci fluidele foliculare sau celulele cumulus ooforus - nu se cunoaste exact - dar mecanismul implica:
- Cresterea Ca2+ intracitoplasmatic la nivelul spermiei

- Aceasta este indusa de factorul chemotactic


- Ca2+- moduleaza miscarea flagelara
22

Factorii chemotactici
Din fluidele foliculare Peptide N-formilate (Iqbal si colab 1980) PNA (Zamir si colab 1993) Progesteron (Villanueva-Diaz si colab 1995) Din cumulus ooforus Progesteron (Teves si colab 2006, Guidobaldi si colab 2008) Spermiile umane - exprima receptori olfactivi cuplati

cu proteine G si receptorul olfactiv 17- 4, probabil implicati in chemotaxie (Spehr si coab 2003)
23

Comportamentul chemotactic al spermiei


In absenta stimulului chemotactic - sptz mamifere -

miscari liniare cu batai flagelare simetrice


In cel stimulat chemotactic - miscari asimetrice

rapide, orientate catre atractant


Putin studiat la om

24

Etapele fecundatiei
Penetrarea cumulus ooforus Penetrarea zonei pellucida - incepe prin declansarea

reactiei acrozomale, ca apoi, spermia activata prin aceasta reactie sa penetreze ZP si sa patrunda in spatiul perivitelin Aderarea la membrana ovocitului si fuziunea celor doua celule Din considerente etice, majoritatea cercetarilor se desfasoara pe soareci, dar pot fi extrapolate la om
25

Penetrarea CO
Cu ajutorul hialuronidazei HA20 - enzima ancorata de

membrana plasmatica a capului spermiei Enzima este ancorata de catre restul lipidic al glicozilfosfatidil-inozitolului (GPI-anchored) Degradarea se face la nivelul moleculelor matrixului care vin in contact direct cu capul spermiei Spermia ajunge la zona pellucida in cateva minute Prin reactia acrozomiala se elibereaza o forma solubila de hialuronidaza, necesara penetrarii zonei pellucida
27

Legarea spermiei de ZP si reactia acrozomiala


- spermia ce vine in contact cu straturile ce invelesc ovocitul are acrozomul intact - in cadrul fecundatiei normale, stimularea spermiei de catre cumulus ooforus si corona radiata, urmata de legarea ei de zona pellucida, determina declansarea reactiei acrozomiale, inainte de legarea de ovocit

Enzima GalTase
Beta 1,4 galactoziltransferaza Ataseaza galactoza la glicoproteine/ glicolipide in

timpul biosintezei lor in ap Golgi De asemnea, se gaseste si pe mb plasmatica a unor celule, incluzand spermia Donorul galactozei se numeste uridin difosfogalactoza (UDP-gal) si in prezenta lui, GalTase ataseaza galactoza la acceptorul acesteia (glicoproteine etc)

Legarea spermiei la ZP - receptorul ZP3


Legarea spermiei si reactia acrozomiala declansata de aceasta sunt dependente enzimatic GalTase - cea mai acceptata teorie - reprezinta receptorul ZP3 de la nivelul spermiei

Membrana plasmatica a spemiei nu contine UDPgalactoza - reactia enzimatica incompleta


In acest caz, substratul si enzima raman atasate,

acesta fiind de fapt mecanismul de legare a spermiei la ZP

Legarea spermiei de ZP
Fiecare spermie se leaga de un rest glucidic (N-

acetilglucozamina, GLcNAc) de la nivelul ZP3, cu ajutorul enzimei galactozil-transferaza (GalTase), de pe suprafata membranei celulare a spermiei Deci, GlcNAc reprezinta substratul GalTase. In mod normal, actiunea GalTase determina transferul restului glucidic, cu ajutorul UDP-galactozei, care lipseste in acest caz.

Fiecare spermie prezinta la nivelul capului enzima

galactozil transferaza (GalTase) Rolul ei - transfera un rest de zahar de pe o molecula pe alta Legarea se face primar de ZP3 In dreptul locului de legare, granulele corticale sunt intacte, ca si acrozomul

ZP3 si reactia acrozomiala


Pe masura ce mai multe GalTase leaga substratul

GlcNAc, are loc deschiderea unor canale de Ca2+- tip T (transient) si cresterea concentratiei de Ca intracitoplasmatic, la nivelul spermiei Cresterea Ca2+ determina activarea PLC (fosfolipaza C), printr-un mecanism legat de proteinele G, cu formare de IP3 si DAG Efectul este deschiderea unor noi canale de calciu TRPC, care produc patrunderea sustinuta a ionului in spermie declansarea R acrozomiale

Calciul si reactia acrozomiala


Se stie ca ionul de Ca declanseaza diferite

tipuri de mecanisme ce implica fuziuni membranare, in special cele ce implica exocitoza (ex. Transmitere sinaptica) In acest caz determina fuziunea membranelor si declansarea R acrozomiale

R acrozomiala
formarea zonelor de fuziune dintre membrana extern

a acrozomului si membrana plasmatic a capului spermiei rezolutia acestor zone, determin expunerea membranei interne a acrozomului ce va lua contact cu zona pellucida eliberarea de enzime proteolitice: hialuronidaza, acrolizina, proacrolizina implicate n facilitarea trecerii spermiei prin zona pellucida.

Traversarea ZP
Se face cu ajutorul enzimelor acrozomale

1. Proteaze acide: hidrolizeaza proteine in mediu cu pH acid: - Colagenaza - Acrozina 2. Carboxilaze: - Beta-glucoronidaza - Hialuronidaza - Neuraminidaza 3. Lipaze: - Fosfolipaza C

Adeziune spermie- ovocit


Dupa penetrarea ZP, spermiile adera de membrana ovocitului cu

care ulterior fuzioneaza Molecule implicate- nu se stie modul de interactiune Spermie: - fertilina alfa (ADAM1) - fertilina beta (ADAM2) - cirytestina (ADAM3) - izumo Ovocit: - integrine- receptori pentru ADAM- ex. Integrina alfa9 beta1pentru fertilina beta) - Tetraspanina CD9 - proteine ancorate la GPI (glicozilfosfatidil inozitol)

Blocarea polispermiei
Polispermie= penetrarea ovocitului de catre mai mult

de o spermie Alterarea nr de cromozomi Numarul mic de spermii din trompe este un mecanism de protectie ce reduce sansele de polispermie Blocaje specifice ale polispermiei: 1. rapid: modificari electrice- ale potentialului membranar 2. lent: modificarea compozitiei ZP= reactia corticala

Blocaj rapid
modificarea potentialului de repaus al membranei

ovocitului (PR) n conditii obisnuite este -70 mV la cteva secunde dup fuzionarea membranelor celor doi gameti, PR devine +20 mV, prin deschiderea canalelor ionice pentru Na+, care intr n celul in aceste conditii membrana unei alte spermii nu poate fuziona cu o membran ncrcat electric pozitiv.

Blocaj lent- reactia corticala


n citoplasma periferica oului fecundat de gsesc

numeroase granule corticale ce contin enzime proteolitice, mucopolizaharide si glicoproteine in timpul fecundatiei creste influxul de Ca2+ intraovocitar, determinnd o exocitoz a granulelor corticale enzimele eliberate cliveaz ZP3 si ZP2 transformandule n ZP3f si ZP2c reactia cortical se propag la tot oul plecnd de la locul de impact cu spermia.

(A) Dupa declansarea reactiei acrozomiale, spermia se leaga de ZP2

prin membrana acrozomiala interna expusa (B) Imediat dupa fecundatie, granulele corticale elibereaza o proteaza ZP2 specifica si alte enzime in spatiul perivitelin. Acestea convertesc ZP2 in forma clivata ZP2c, ce nu mai leaga spermiile. ZP3 disociaza de pe ZP2 si sufera o modificare subtila, transformanduse in ZP3f, ce nu are proprietatea de a lega spermiile si nici de a declansa reactia acrozomiala.

A. Spermia se apropie de ovocit B. Spermia penetreaza ZP (verde). C. Contactul cu ovocitul stimuleaza exocitoza locala a granulelor corticale D. Degranularea se produce si in granulele adiacente tridimensional, producand modificari la nivelul ZP (albastru) prin eliberare de enzime E. Exocitoza continua pana cand se elimina continutul tuturor granulelor .

Activarea oului
Incepe dupa fertilizare si initiaza dezvoltarea

embrionului Implica cresterea Ca2+ citosolic la aprox 1 microM Cresterea are loc la cateva secunde- cateva minute dupa fuziunea membranelor gametilor Cresterea Ca2+ are loc sub forma de unda ce calatoreste in interiorul oului

Activarea oului
La mamifere are loc o oscilatie de frecventa joasa in concentratia Ca2+ spike-uri de 1-2 minute, cu frecventa de 1 spike la 10 minute generate de IP3, prin activare R- IP3 de pe membrana RE

Mecanismul prin care creste IP3 este necunoscut, se presupune ca odata cu fuziunea, spermia introduce un factor activator al PLC
Oscilatiile persista pentru cateva ore, pana la prima diviziune mitotica a celulei ou

Cresterea Ca2+ citosolic produce:


- Continuarea meiozei ovocitului - Reactia corticala - Recrutarea ARNmatern pentru translatie - Modificari in sinteza proteica - Activarea genomului zigotic

ARNm matern
ARN mesager provenit din transcriptia genelor materne, se formeaz n ovocit si intervine n primele diviziuni ale zigotului (pn la primele 8 blastomere).

Ulterior va fi degradat si nlocuit de ARN-ul mesager provenit din activarea transcriptiei zigotice.

Evenimente pronucleare
Patrunderea spermiei determina completarea meiozei II la

nivelul ovocitului Odata patruns in citoplasma ovocitului, nucleul haploid al spermiei devine pronucleu masculin Etape: 1. Pronucleii feminin si masculin migreaza catre centrul celulei ou 2. Membranele nucleare se interdigiteaza 3, Are loc replicarea centrozomului 4. Dezintegrarea membranelor nucleare prin veziculatie 5. Cromozomii ambilor nuclei se aliniaza pe un fus comun de diviziune

Evenimente pronucleare
La mamifere, pronucleii nu fuzioneaza direct, asa cum se

intampla la alte specii, ci se apropie si raman distincti, pana la dezintegrarea membanelor


Spermia contribuie la formarea zigotului prin AND si prin

centriolul care va forma fusul de diviziune


Ovocitul nefecundat nu are centriol!!!

Centriolul pantrunde in ovocit impreuna cu capul si coada

spermiei

Imunofluorescenta- pronuclei umani dupa FIV -Microtubulii fusului sunt marcati cu AC antitubulina (verde) -ADN- albastru A. Fus de diviziune in ovocitul matur, nefecundat B. Un fecundat ce elimina al doilea globul polar, la 5 ore dupa fuziunea cu spermia; capul spermiei (stanga) prezinta microtubuli care radiaza de la nivelul lui C. Unirea pronucleilor D. La 16 ore dupa fuziune, centrozomul se replica si se formeaza fusul de diviziune bipolar; cromozomii se aliniaza la nivelul placii metafazice.

Sageata - coada spermiei asociata cu unul dintre centrozomi

Fertilizare in vitro
Tehnic de reproducere asistat folosit n infertilitate

atunci cnd celelalte metode au esuat.


Const n fertilizarea ovulelor n afara uterului, in

vitro, ntr-un mediu fluid.


Zigotii astfel obtinuti sunt apoi transferati n uter.

Etapele FIV:
1. inductia superovulatiei cu FSH recombinat 2. monitorizarea raspunsului ovarian prin dozarea

estradiolului si prin ecografie 3. stimularea maturarii foliculare cu hCG, atunci cand numarul si dimensiunile foliculare sunt corespunzatoare 4. recoltarea ovocitelor dupa 34- 36 de ore prin punctie ghidata cu ajutorul ecografiei transvaginale 5. fertilizarea prin plasarea ovocitelor si a spermiilor in mediul de cultura. Se asteapta o perioada de 1- 3 zile in vederea fertilizarii 6. embrio- transferul intrauterin dupa 48- 72 de ore.

Etapele FIV
In cazul in care se considera ca sansele de fertilizare

sunt mici, in etapa fecundatiei propriu- zise, spermia este injectata in interiorul ovocitului printr-o tehnica numita ICSI (intracytoplasmic sperm injection )
Majoritatea laboratoarelor folosesc tehnica ICSI, chiar

daca nu este nimic in neregula