Apoptoza

Apoptoza, sau moartea programata a celulelor, este o forma distinctiva a decesului celulelor, care difera de decesul produs prin necroza . Apoptoza se ntlneste la toate tipurile de celule vegetale sau animale, uni- sau pluricelulare, pna la nivelul mamiferelor superioare si al omului . Apoptoza se ntlneste n conditii normale n turnoverul celulelor, n homeostazia tesuturilor, n embriogeneza n care exista programarea decesului celulelor , n inducerea si mentinerea tolerantei imunitare, n dezvoltarea sistemului nervos si n atrofia tesuturilor dependente endocrin

Este o maniera particulara de cenzurare a anormalitatilor de desfasurare a ciclului celular. Pentru producerea apoptozei se consuma energie sub forma de ATP. In celulele supuse apoptozei, cromatina nucleara se condenseaza, nucleul se fragmenteaza, iar membrana celulara se mentine integra pana in stadiul final, cand celulele apoptotice se rup, formeaza corpii apoptotici ce sunt fagocitati de macrofage. In inducerea apoptozei sunt implicati produsi care controleaza ciclul celular: p53, Rb, etc. Exista mai multe situatii care pot induce declansarea apoptozei. S-a presupus ca acest fenomen survine fie cand celula receptioneaza semnale contradictorii, fie cand celula nu primeste semnale de supravietuire (factori de crestere, hormoni) din mediul extracelular, fie ca raspuns la modificarile marcante aparute la nivelul ADN-ului.

Moartea clular programat sau apoptoza celular : procesul prin care o celul moare linitit, fr s declaneze reacie inflamatorie. Procesul este declanat de factori interni sau externi celulei, cel mai adesea nu externi organismului i se bazeaz pe informaia genetic i aparatul proteic proprii fiecarei celule

Modelul mortii celulelor - pe calea apoptozica sau a necrotica - e dependenta si de concentratiile intracelulare de NAD+ si ATP. Micsorarea nivelului de NAD+ si ATP induce necroza celulara Intr-un organism sanatos moartea programata celulara (MPC) este un mecanism de mentinerea homeostaziei. Atat hipofunctia, at si hiperfunctia apoptozei are in consecinta dereglari de homeostazie. Se considera actualmente, ca MPC este o etapa naturala de activitate a celulelor

Markeri tisulari de apoptoz

fragmentare nuclear condensri de cromatin fragmentri de ADN

Rolul apoptozei
nlturarea populaiilor celulare devenite inutile ca: -nedorite -lezate -compromise Procesul este esenial n procesul de dezvoltare embrionar i n combaterea microorganismelor infecioase.

Stimuli declanatori de apoptoz

Produse de :

scderea concentraiei locale de factori de cretere tisular (tissue morphogens or growth factors) suferina grava a unor componente celulare eseniale (sever stress or danage) ADN Citoschelet
radiaii ionizante oc traumatic toxine desprinderea din stucturile fibrilare ale MEC (ECM) infecii virale sau bacteriene transformarea oncogen

Moartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea normala a organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuie inlaturate din microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale si functionale a tesutului

Afectarea genelor implicate in declansarea specifica a apoptozei poate da nastere la diferite malformatii ale dezvoltarii diferitelor organe. De exemplu: perturbarea apoptozei specifice in dezvoltarea degetelor la om poate provoca sindactilie:

Apoptoza versus necroza

In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologie distincta: apoptoza si necroza , insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca complet intelese. NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-si mai poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si gradientul ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se dilata

Moartea celular agresiv sau necroza celular : procesul prin care o celul se dezintegreaz declannd, concomitent un proces inflamator localizat. Procesul este declanat de factori externi celulei si/sau organimului: traumatism, infecie bacterian sau viral, hipoxie sever, intoxicaie

Morfologia apoptozei

celula se micsoreaza in dimensiuni si formeaza exvaginari rotunde ale membranei celulare in urma degradarii citosceletului de catre caspaze Citoplasma devine densa si organitele apar condensate Cromatina se condenseaza indepartandu-se de anvelopa nucleara (picnoliza) Anvelopa nucleara este strangulata si ADN-ul din interiorul nucleului este fragmentat (in fragmente de pana la 200pb)cariorrhesis. Nucleul este fragmentat in bucati mai mici corpuri cromatinice(chromatin bodies). Fragmentarea ADN-ului este aproximativ de aceleasi dimensiuni membrana celulara este iregulata, pierzandu-si forma, formand exvaginari cunoscute de curgeri celula este distrusa, formand asa-numitele corpuri apoptosomice, care vor fi fagocitate de catre macrofage

(a) Celula normala are o citoplasma dispersata si cromatina nucleara heterogena.

(b) Celula a pierdut o parte din volum si organitele citoplasmatice sunt strans impachetate (d) Colapsul cromatinei cu aranjareaei in forma de semiluna

(c) Celula etaleaza zeioza

(e) Nucleul are acum aspectul unei gauri negre (f) Nucleul se fragmenteaza g) Fragmentele celulare

Indepartarea celulelor intrate in ultimele stadii ale apoptozei prezinta pe suprafata membranei celulare molecule semnal de recunoastere a macrofagelor pentru digestia acestora. O molecula semnal care declanseaza fagocitarea celulei intrata in apoptoza este fosfatidilserina, care in mod normal este gasita pe partea citosolica a membranei celulare, dar din moment ce celula a intrat in apoptoza o enzima (ipotetic este considerata ca fiind scramblaza) transfera fosfatidilserina pe fata externa a membranei celulare. Dupa ce a fost recunoscut receptorul specific, macrofagul v-a digera celula.

Figura 1. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si necroza (7si 8). (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin compactarea si marginalizare cromatinei,condensarea citoplasmei si plierea membranelor, nucleara si plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul se fragmenteaza si protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma corpii apoptotici, care (4),sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in lizozomi (7). Necroza este asociata cu grupareaneregulata a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a membranelor (8). Apoi membranele se dezintegreaza dar, in general, celula isi mentine intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele mononucleare.

Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:

- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil angajata pe calea mortii; - executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale; - clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.

Fazele procesului apoptotic

Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului celular este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3 optiuni posibile
1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de apoptoza (celula aflata in faza G0); 2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0G1SG2mitoza) 3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata (G0D1FD2fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata (necroza)

Celula poate fi:

Figura 2. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1 defineste perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta pentru inducerea fragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se fragmenteaza in corpi apoptotici.

Biochimia apoptozei

Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea mai plauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare imediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intrun mod adecvat. A fost observata umflarea cisternelor reticului endoplasmic. Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata de degradarea lor, dar sincronizarea acestor evenimente in raport cu modificarile morfologice nu este inca bine caracterizata

Figura 4. Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru -tubulina inainte de aparitia modificarilor morfologice si a clivajului DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si in citoplasma cantitati crescute de -tubulina. Probabil ca, genele pentru -tubulina sunt degradate impreuna cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa (30).Agentii care interfera cu polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a aratat ca previn inmugurirea celulara ce duce la formarea corpilor apoptotici fara a bloca fragmentarea

Modificarile morfologice si biochimice observate n celulele decedate prin procesul de apoptoza sunt mediate de catre familia cistein-aspartazelor sau a caspazelor (cysteine protease cleaving an aspartic acid residue). Aceasta familie de 14 caspaze este constituita din proenzime care, prin proces proteolitic, genereaza forme active. Proenzimele caspazelor pot fi activate de catre AIF (apoptosis inducing factor), care se elibereaza din mitocondrie prin permeabilizarea membranei acesteia. Semnalul apoptotic transmis prin activarea caspazelor poate fi dereglat de catre supresorii apoptozei, cum este proteina IAP (inhibitor of apoptosis).

Caspazele sunt cele mai importante molecule care induc apoptoza. Cele mai importante caspaze implicate n apoptoza includ caspaza 2 (ICE-1, interleukine-1-beta- converting enzyme), caspaza 3, caspaza 7, caspaza 8 si caspaza 10. Familia caspazelor se mparte n doua mari subfamilii: caspazele 1, 4 si 5 intervin n maturarea citokinelor, a interleukinei 1-B si a interleukinei 18 si au functie proinflamatorie. Alti membri ai acestei familii au actiune apoptotica, fie ca initiaza, cum sunt caspazele 2, 8, 9 si 10, fie ca o executaza, cum sunt caspazele 3, 6 si 7. n timpul apoptozei, caspazele 3, 6 si 7 cliveaza proteinele localizate n membrana, nucleu si n citoplasma. Caspaza 9 este capabila de activitate autocatalitica si actioneaza asupra caspazelor efectoare 3 si 7.

Caspazele efectoare sunt responsabile de modificarile morfologice ale apoptozei, cum este condensarea cromatinei, scindarea citoplasmei si a nucleului n vezicule nvelite n membrana intacta, degradarea ADN. Procaspaza 9, legata de APAF-1 (apoptotic protease activating factor 1), formeaza cu citocromul c un complex proteic, numit apoptosom [42]. Procaspaza 9 se activeaza prin clivaj autocatalitic si activeaza caspaza 3 si declanseaza cascada caspazelor

In rezultatul actiunii caspazelor are loc:

activarea procaspazelor, cu formarea caspazelor; scindarea proteinelor antiapoptozice din familia Bcl-2. hidroliza proteinelor laminelor, ce stabilizeaza membrana nucleara, cu condensarea cromatinei; distrugerea proteinelor, participante la reglarea functiei citoscheletului; inactivarea si dereglarea reglarii proteinelor ce iau parte in reperarea DNA, splaisigului mRNA, replicarii DNA. Tinta caspazelor este poli (ADP-ribozo) polimeraza (PARP). Aceasta enzima participa la repararea DNA, catalizand poli (ADP-ribozilare) proteinele,

Cile sau cascadele apoptozei

Calea extrinsec (extrinsec celular) Este declanat de cuplarea moleculelor de semnalizare extracelular cu receptorii membranari de moarte celular (DRs). Prin intermediul acestora se activeaz cascada caspazelor intracelulare.

Calea extrinseca este legata de existenta receptorilor celulari de suprafata, receptorii tanatogeni (death receptors), cum sunt: CD95, TNF si TRAIL-TNF (TNF related apoptosis inducing ligand; ligand inductor al apoptozei legat de TNF). CD95 sau Fas sau APO1 este un receptor proteic si apartine receptorilor TNF. CD95 se leaga de ligandul sau specific, CD95- Ligand (FasL). Cuplarea CD95 cu CD95-L transmite semnalul pentru apoptoza. Factorul de necroza tumorala (TNF) distruge celulele tumorale prin efect citotoxic [15]. Pe membrana celulara se afla receptorii pentru citokinele TNF. Alterarea expresiei Fas sau FasL este confirmata n diverse cancere. Cnd receptorul Fas nu se cupleaza cu ligandul Fas-L, apoptoza este indusa de genele DCC (deleted in colorectal cancer), dar blocheaza apoptoza cnd moleculele Natrin-1 sunt cuplate . Genele DCC sunt un supresor tumoral, iar daca apar mutatii n aceste gene, se dezvolta cancerul . Genele DCC codifica si receptorul pentru molecula Natrin-1 . Existenta FasL induce cresterea apoptozei la nivelul limfocitelor citotoxice n infiltratul din jurul tumorii . Receptorul CD95 (Fas) si membrii familiei proapoptotice bcl-2 participa la actiunea lactoferinei, glicoproteina legata de fier si contribuie la supresia efectelor dezvoltarii tumorii

Calea intrinsec (intrinsec celular) Este declanat de stimulii de apoptoz celular prin intermediul familiiei de proteine intracelulare BCL-2 care duce la permeabilizarea membranei mitocondriale externe, extenalizarea citocromului C n citosol i activarea cascadei caspazelor intacelulare.

Calea intrinseca presupune alterarea membranei plasmatice, eliberarea proteinelor mitocondriale, a citocromului c si a factorului ce induce apoptoza (AIF apoptosis inducing factor) .n stadiile initiale ale apoptozei au loc schimburi ntre suprafata celulei si plasma. Prin alterarea plasmei, fosfatidilserina iese la suprafata celulei. Citocromul c (Apof-2) actioneaza asupra factorului ce activeaza proteazele apoptotice (Apof-1) si induce activarea caspazei 9 (Apof-3), care initiaza cascada caspazelor. Permeabilizarea membranei mitocondriale elibereaza citocromul c, permeabilizare reglata de catre caspazele apoptotice bax, bak si boc si de catre caspazele antiapoptotice bcl-2, bcl-x, bcl-w, mcl-1 si A1.

Exista cateva cai de realizare a MPC

1. Calea determinata de inductorii fiziologici, actiunea carora se realizeaza prin receptorii celulari, ce au functia de a include mecanismele programei apoptozei. Schematic ar putea fi in felul urmator: inductor > receptor > adaptori > caspazele initiale > reglatori > caspazele finale. Receptorul (Fas) interactioneaza cu ligandul (FasL) (proteina transmem- branara a T-Kiler), se activeaza si include PMC infectata de virus

inductorului apoptozei, brusc se micsoreaza potentialul membranar, ce duce la majorarea permeabilitatii membranei interne mitocondriale, ca

2. In celulele, supuse actiunii

consecinta la formarea porilor. (Bernardi P si al. 1998). Deschiderea porilor e determinata de micsorarea cantitatii de glutation redus, NAD(P)H, ATP, ADP.

3. In unele cazuri MPC se realizeaza ca rezultat al

efectului combinat al 2 cai cu participarea receptorilor membranei plasmatice si a citocromului C mitocondrial.

Lezarea DNA duce la acumularea in celule a proteinelor genei p53, care stopeaza inmultirea celulelor si (sau) induce apoptoza. In mai mult de 50% cazuri in celulele cancerigene gena p53 este inactiva - este dereglata reglarea homeostazei celulare de p53. Aceasta proteina, p53, este un factor de transcriptie, ce regleaza activitatea genelor. Se presupune ca, raspunsul la formarea p53 e dependent de gradul de alterare a genomului celular.

4. Exista si calea de transmitere a semnalului MPC cu participarea reticulului endo- plasmatic, unde-i localizata procaspaza 12. Dereglarile homeostaziei Ca2+ intracelular la adaosul tapcigarginei sau a preparatului Ca2+ ionoforic A23187 duc la apoptoza, determinata de activarea procaspazei 12. Apoptoza, dependenta de RE este in maladia Alzheimer: (neuronii corticali la soricei cu deficit de caspaza 12 sunt rezistenti la apoptoza indusa de o proteina amiloidica, dar nu la apoptoza indusa de cit.c sau cu participarea receptorilor membranari).

Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice

Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite. Celulele apoptotice sunt indepartate inaintea lizei lor, acest eveniment sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafata ce semnalizeaza fagocitelor legarea si inglobarea lor. Aceste fagocite pot fi profesioniste (macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale si celule musculare netede din peretii vaselor de sange). Pana acum au fost descrisi mai multi receptori pe macrofage si alte celule ce leaga celulele apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia sunt reprezentati de receptori lectin-like (65), receptorul pentru vitronectine v3 (66), CD36, receptorul de recunoastere al fosfatidilserinei (67), inca necaracterizat, CD14 (68) si receptori scavanger (69

Receptori trombospondinici ai fagocitelor Macrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot recunoaste neutrofile si limfocite umane apoptotice prin intermediul receptorilor pentru vitronectina (VnR) v3 si receptorii scavenger din clasa B (CD36) (74). Acesti receptori se leaga de trombospondina ce serveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice

Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia cancerului Implicatiile apoptozei in patologie

Dereglarea procesului apoptotic, ce are ca rezultat o moarte celulara excesiva, insuficienta sau prematura, constituie fundamentul initierii si progresiei multor maladii umane. Se presupune ca o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la progresia si severitatea mai multor dereglari neurodegenerative ce includ maladia Alzheimer, scleroza laterala amiotrofica, atrofia musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile neuromotorii si chiar atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este corelata cu sindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce manifestarea insuficienta a acestui proces constituie mecanismul de declansare al anumitor boli autoimune si limfoproliferative

Transformarea maligna Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge fenotipul malign si datorita faptului ca aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sau tratamente care, in timp, altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deteriorate sau initiate promoveaza carcinogeneza. In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct de vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lor corespund pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale(hiper- sau hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti, singulari sau multipli. Exista o crestere a raportului nucleocitoplasmatic

Apoptoza indeplineste un rol important si in prevenirea cancerului. De exemplu: daca o celula este incapabila sa intre in apoptoza in urma unei mutatii, ori o inhibare a unei cai metabolice, poate duce la o continua diviziune si dezvoltarea tumorii. O gena a visusului papiloma interfereaza cu gena p53, gena cu o importanta mare in declansarea apoptozei, astfel ca celula nu poate declansa apoptoza si incepe sa se divida necontrolat dand nastere la cancerul de col uterin.
In cazul infectiei cu virusul HIV 1, deletia de limfocite este rezultatul unui proces complex, in care legarea glicoproteinei gp120 de antigenul CD4 limfocitelor T. CD4 face celula sensibila la apoptoza, la a doua stimulare. Tinand cont de acest aspect, SIDA poate fi privit ca un dezechilibru intre viteza mortii celulelor limfocitare T CD4 si procesul de reinoire a acestor celule.